Anticorpii specifici au nevoie de validare specifică

Unul dintre cele mai utilizate instrumente în cercetarea biomedicală este anticorpul monoclonal. Aceste proteine au potențialul de a căuta și de a se lega de orice țintă dorită și pot fi utilizate pentru imagistica celulară, sortarea celulelor, imunoanalize și multe alte aplicații.

Dar acești cai de bătaie de laborator nu funcționează întotdeauna corect. În funcție de natura țintei sale, un anticorp poate fi inconsecvent în anumite teste – legându-se la o țintă greșită pentru a da rezultate fals pozitive, de exemplu. Având în vedere prevalența utilizării anticorpilor în cercetare, aceasta este potențial o problemă de un miliard de dolari.

Un obiectiv major este de a dezvolta strategii de validare a anticorpilor, astfel încât cercetătorii să aibă încredere că un anticorp este potrivit pentru nevoile lor particulare – și că rezultatele lor vor fi reproductibile.

Thermo Fisher Scientific a dezvoltat o platformă de validare a anticorpilor în două părți pentru a testa nu numai specificitatea anticorpilor săi InvitrogenTM (că se leagă la ținta corectă), ci și adecvarea lor pentru diferite aplicații. Cu toate acestea, același test nu este adecvat pentru toți anticorpii: Thermo Fisher utilizează un test adecvat pentru fiecare țintă proteică, în funcție de funcția biologică a acesteia. Anumiți anticorpi vor fi cel mai bine testați folosind CRISPR-Cas9 pentru a elimina gena care codifică proteina țintă și verificând dacă anticorpul nu se mai leagă de nimic. Alți anticorpi ar putea fi testați folosind imunoprecipitarea urmată de spectrometrie de masă pentru a verifica dacă sunt legați de țintele corecte.

Thermo Fisher dezvoltă și perfecționează testele de validare a anticorpilor pe baza funcției biologice a antigenului țintă. Iată două studii de caz privind proteine specifice și testele de specificitate ale acestora.

Knock-out-uri pentru cancer

Receptorul factorului de creștere epidermică (EGFR) este o proteină bine studiată: dereglarea în calea EGFR este implicată în diverse tipuri de cancer. Pentru a testa dacă anticorpii sunt specifici pentru EGFR sau pentru oricare dintre țintele sale din aval, cercetătorii pot elimina proteine critice din calea EGFR și pot vedea cum se modifică semnalul de legare a anticorpilor.

În ultimii ani, sistemul CRISPR-Cas9 a devenit cunoscut ca fiind cel mai fiabil și mai puternic mod de a elimina o genă. Acest lucru îl face ideal pentru a testa specificitatea anticorpilor în cadrul unei cascade de semnalizare. Cercetătorii de la Thermo Fisher au luat o linie standard de carcinom uman (A-431) și au folosit un western blot pentru a obține o linie de bază pentru semnalul de legare. Apoi au folosit CRISPR-Cas9 pentru a elimina gena țintă și a crea knock-out-uri EGFR. Un western blot al proteinei extrase din aceste celule knockout a arătat că nu mai exista niciun semnal pentru o proteină țintă (Figura 1).

Teste suplimentare au confirmat rezultatul. Cascada de semnalizare din aval de EGFR include proteine precum RAS, RAF, MEK și ERK. Activarea EGFR de către factorul de creștere epidermică (EGF) duce la fosforilarea acestor proteine din aval, care poate fi detectată cu ajutorul altor anticorpi care recunosc aceste stări fosforilate. Cu toate acestea, adăugarea de EGF la celulele EGFR-knockout nu ar trebui să ducă la nicio fosforilare în aval. Adăugarea acelorași anticorpi care recunosc țintele fosforilate nu a produs niciun semnal. Astfel, cercetătorii de la Thermo Fisher sunt încrezători că anticorpul anti-EGFR este specific țintei.

O serie de modificări

În nucleul celular, ADN-ul este strâns împachetat – înfășurat în jurul proteinelor histone pentru a forma cromatina. Studierea histonelor este dificilă, deoarece acestea pot fi afectate de o serie de modificări chimice, cunoscute sub numele de modificări post-translaționale (PTM). De exemplu, reziduurile de pe o histonă pot căpăta una sau mai multe grupări metil, acetil sau fosforil, fiecare dintre acestea având un efect asupra funcției celulare.

Certe tehnici, cum ar fi imunoprecipitarea cromatinei (ChIP), western blotting, imunofluorescența și imunohistochimia, utilizează anticorpi împotriva PTM-urilor specifice histonei pentru a înțelege starea histonei și legarea acesteia. Cu toate acestea, mai multe modificări histonice au modele similare de legare la ADN; un anticorp care nu a fost testat în mod riguros împotriva tuturor PTM-urilor histonice ar putea să se lege de tipul greșit și să furnizeze un rezultat fals pozitiv.

Thermo Fisher și-a testat anticorpii specifici PTM-urilor histonice folosind o serie de peptide purtând o varietate de PTM-uri. Dacă un anticorp este cu adevărat specific pentru o PTM, se va lega numai la acele puncte care poartă acea PTM. Cercetătorii Thermo Fisher au măsurat semnalele folosind un factor de specificitate: intensitatea medie a tuturor spoturilor care conțin o anumită PTM împărțită la intensitatea medie a tuturor spoturilor care nu o conțin (figura 2). Anticorpii au prezentat un factor de specificitate de 4 până la 190 de ori mai mare pentru starea lor PTM țintă decât pentru stările non-țintă, ceea ce dă încredere în faptul că sunt foarte selectivi.

Thermo Fisher are alte șapte teste de specificitate în afară de testele de eliminare genetică și de matricele peptidice. Printre acestea se numără utilizarea RNAi pentru a anula expresia genelor, un anticorp crescut diferențiat pentru a verifica în mod independent țintirea și expresia variabilă naturală pentru a confirma specificitatea. Numai prin astfel de testări atente și riguroase cercetătorii pot fi siguri că mașinile lor de lucru din laborator sunt adecvate scopului – și că munca lor va rezista la cea mai atentă examinare.

Găsește aici note de aplicare pentru acești anticorpi Invitrogen și mai multe despre abordarea de testare în două părți a Thermo Fisher Scientific.

.