Aplicații actuale ale microrețelelor de anticorpi

Datorită capacităților unice ale microrețelelor de anticorpi și aplicabilității lor într-o serie de proiecte biomedicale, au fost dezvoltate o serie de microrețele de anticorpi diferite, dintre care unele au devenit disponibile în comerț. În prezenta lucrare, am adunat câteva dintre studiile reprezentative din ultimii 7 ani (tabelul 1) și am organizat prezentarea noastră generală în două părți, în funcție de obiectivul proiectelor: studii bazate pe biologie fundamentală și cercetare clinică. Deoarece rămâne practic imposibil să acoperim toate aplicațiile recente ale microrețelelor de anticorpi, ne concentrăm asupra acelor aplicații pe care le-am considerat de mare interes și asupra constatărilor cu semnificație clinică importantă.

Cercetări de bază

Relaționate cu căile de semnalizare

Schimbările în căile de semnalizare reprezintă un semn distinctiv al multor stări de boală, inclusiv cancerul , diabetul și tulburările neurodegenerative . Construirea de rețele de anticorpi utilizând reactivi de captare care vizează proteinele din cascada de semnalizare de interes a permis cercetătorilor să investigheze schimbările în profilurile proteice și modificările în căile de semnalizare în procesele biologice normale și în stările de boală. Cercetătorii au aplicat acest concept la o serie de materiale și preparate de probe biologice, inclusiv lizate celulare , extracte de țesuturi și plasmă .

Calbindina-D28 k (CB), o proteină importantă de legare a calciului care acționează ca un tampon de calciu și care s-a constatat că este exprimată la niveluri mai scăzute în creierul șoarecilor și al oamenilor cu boala Alzheimer, dar nu se știe dacă aceste modificări contribuie la disfuncția legată de boala Alzheimer (AD). Kook et al. au generat un șoarece transgenic cu deficit de CB în Alzheimer (CBKOTg) pentru a investiga contribuția CB la căile de semnalizare în AD . Utilizând microplăci de anticorpi pentru a examina țesutul cerebral al șoarecilor, aceștia au identificat modificări semnificative în căile de moarte celulară, în transmiterea sinaptică și în căile de semnalizare MAPK în cazul eliminării CB. Aceste constatări au fost verificate prin imunohistochimie, care a arătat o creștere a markerilor apoptotici și o creștere a morții neuronale, demonstrând că microrețelele de anticorpi pot furniza informații noi, îmbunătățind înțelegerea noastră a rolului CB și implicarea sa în fiziopatologia AD.

Microrețele de anticorpi au fost utilizate pentru a descoperi rolul fiziologic în proteine foarte conservate, inclusiv factorul de alungire 4. Gao et al. au disecat mecanismul factorului de control al calității factorului de alungire mitocondrial 4 (mtEF4) în traducere folosind o microrețea de anticorpi phospho-explorer . Prin compararea lisatelor celulare între țesuturile testiculare ale șoarecilor mtEF4 knock-out și WT, aceștia au constatat că îmbogățirea fold a mTOR a fost cea mai mare dintre diferitele căi de semnalizare. Autorii au arătat că, în cazul deleției mtEF4, principalul semnal de feedback din citoplasma somatică este creșterea mTOR. Aceasta a fost însoțită de o creștere a traducerii citoplasmatice, indicând astfel că mTOR joacă un rol crucial ca efector în aval care compensează deficitul de traducere mitocondrială . Mai mult decât atât, studiul a legat o legătură încrucișată nedescrisă anterior între controlul calității dependent de mtEF4 în mitocondrii și calea mTOR în citoplasmă.

Mecanismul medicamentului

Cu ajutorul testelor de microarray de anticorpi, cercetătorii pot investiga mecanismele medicamentelor într-un mod sistematic și eficient. Printre numeroasele aplicații posibile, a fost studiată angiogeneza indusă de tumori, deoarece joacă un rol esențial în progresia cancerului . P11, un nou ligand peptidic care conține un motiv de legare PDZ (Ser-Asp-Val) cu afinitate ridicată pentru integrina αvβ3, a fost identificat dintr-o bibliotecă hexapeptidică (PS-SPCL) folosind un microarray de anticorpi . Mecanismul farmacologic al P11, a fost elucidat folosind o abordare farmacoproteomică microarray special concepută care conține 48 de anticorpi legați de cancer . Studiul a arătat că P11 inhibă proliferarea celulelor endoteliale din venele ombilicale umane indusă de bFGF prin inhibarea proteinei kinazei activate de mitogen și a kinazei reglementate de semnalul extracelular. În plus, microarray-ul a arătat că P11 a provocat creșterea markerului apoptotic p53, a dus la inducerea apoptozei prin activarea sistemului caspaselor, ceea ce indică faptul că P11 poate juca un rol-cheie în prevenirea progresiei tumorale. Legătura dintre P11 și p53 prezintă cercetătorii clinici și fundamentali în domeniul cancerului va ajuta la elucidarea unor indicii suplimentare despre rolul lui P11 și ținta sa inhibitoare.

Lovastatina, un produs natural derivat din Aspergillus terreus sau Monascus ruber, a fost utilizat pe scară largă ca medicament pentru scăderea colesterolului în clinică. Yang et al. au utilizat un microarray de anticorpi care conținea 656 de anticorpi cu accent pe diferite căi celulare funcționale, ceea ce a sugerat că lovastatina are, de asemenea, proprietăți anticancerigene, prin mecanisme slab definite. Există o nevoie stringentă de a găsi tratamente eficiente împotriva cancerului și de a înțelege mecanismele de acțiune ale acestora. Cu ajutorul unui microarray, celulele cancerului de sân au fost studiate în condiții hipoxice pentru a investiga mecanismele moleculare prin care Lovastin își exersă efectul. Aceștia au arătat 17 proteine reglate în sus și 20 de proteine reglate în jos pentru celulele de cancer de sân tratate cu lovastatină, în comparație cu cele de control, iar rezultatele au fost ulterior validate prin PCR în timp real . Semnătura proteică a inclus proteine implicate în apoptoză, proliferare celulară și metastaze tumorale, legând modularea acestor căi de acțiunea farmacologică a lovastinei.

Medicamentul pentru diabet de tip 2, metformină, a propus, de asemenea, să aibă proprietăți anticancerigene. Lee et al. au investigat potența unor noi derivați de metformină folosind un microarray de anticorpi construit pentru a studia moleculele legate de ciclul celular. Autorii au arătat că metformin-butiratul (MFB) a avut o eficacitate antitumorală mai bună decât metformin-HCl, printr-o activitate neoplazică mai mare și o eficiență mai bună în ceea ce privește afectarea progresiei ciclului celular în timpul fazelor S și G2/M, pe lângă faptul că pare să aibă efecte citotoxice preferențiale asupra populațiilor de celule stem ale cancerului de sân . Aceste constatări evidențiază modul în care matricele de anticorpi pot furniza dovezi proteomice care să susțină dezvoltarea de medicamente cu o eficacitate mai bună.

Pentru cercetarea biologică de bază, microrețelele de anticorpi pot servi la detectarea proteinelor de semnalizare și a proteinelor asociate unui anumit fenotip. Matrițele cu detectare paralelă a proteinelor creează oportunitatea de a investiga mai multe căi de semnalizare într-un singur experiment, oferind informații despre mecanisme noi, cum ar fi studiul progresiei bolii, interacțiunea medicamentelor și răspunsul la infecții.

Cercetare clinică

Analiza probelor clinice la nivel de proteine va permite îmbunătățirea markerilor de diagnosticare și direcționarea opțiunilor de tratament. Deoarece proteinele sunt implicate în majoritatea proceselor celulare, analiza proteinelor poate oferi o semnătură biologică a bolii, generând informații detaliate despre starea actuală a unei celule, a unui organ sau a unui sistem. Microrețelele de anticorpi pot oferi un ghid în timp real al modificărilor actuale ale proceselor biologice în timpul sănătății și al bolii. În această secțiune, vom exemplifica modul în care microrețelele de anticorpi au fost utilizate pentru a investiga cohorte clinice, analizând în principal probe de ser și plasmă. Nu este posibil să acoperim toate aspectele microplăcilor de anticorpi pentru cercetarea clinică, în prezentul document, ne concentrăm doar asupra câtorva dintre cele mai importante boli, și anume bolile autoimune, bolile infecțioase, cancerul și bolile neurodegenerative.

Bolile autoimune

Diagnosticul lupusului eritematos sistemic (LES) este o provocare din cauza prezentării sale clinice eterogene și a lipsei unor biomarkeri puternici pentru a-l distinge de boala activă și inactivă, precum și de alte boli autoimune. Lin et al. au efectuat un screening DotScan™ cu microarray de anticorpi din celulele mononucleare din sângele periferic de la 60 de pacienți cu LES cu activitate variabilă a bolii, 25 de pacienți cu poliartrită reumatoidă, 28 de probe de alte boli autoimune și 24 de controale sănătoase. Profilurile microarray de anticorpi au putut distinge pacienții cu LES activi de controalele sănătoase. Utilizarea unei matrice de captare a leucocitelor a îmbunătățit capacitatea de discriminare a diagnosticului convențional al LES, prin verificarea anticorpilor serici anti-dsDNA, a complemenților C3 și C4, microrețelele au crescut capacitatea de discriminare a LES semiactiv și activ, informații care vor ajuta la o mai bună gestionare a bolii.

Într-un alt studiu, Carlsson et al. au construit 135 de variabile de fragmente de lanț unic recombinante umane (scFv) care vizează proteine imune pentru a construi o microrețea de anticorpi internă. În acest studiu, ei au examinat pacienți cu scleroză sistemică (SSc), LES și 15 voluntari sănătoși. SSc este o tulburare autoimună care afectează țesutul de legătură, care poate fi dificil de diagnosticat diferențiat de LES. Matricea a identificat 40 de proteine exprimate diferențiat, creând o semnătură proteomică candidată pentru a delimita LES și gravitatea acestuia de SSc. Această semnătură proteică a reprezentat o mai bună clasificare a bolii decât un singur parametru clinic convențional sau chiar combinații de parametri clinici convenționali, inclusiv ANA, anti-DNA, SLEDAI-2 k, C1q, C3, C4 și CRP, ilustrând potențialul de utilizare a microrețelelor de anticorpi pentru a crea noi semnături de boală care vor adăuga valoare clinică la gestionarea bolii.

Boli infecțioase

Infecțiile activează sistemul imunitar în mod diferit, iar aceste mecanisme pot fi investigate cu ajutorul rețelelor de anticorpi la nivel de proteom. Helicobacter pylori este un agent patogen care colonizează aproximativ o jumătate din populația lumii și care provoacă gastrită cronică. Sukri et al. au utilizat microrețeaua de anticorpi DotScan™ pentru a determina toleranța sistemului imunitar față de celulele tumorale în cancerul gastric, folosind 144 de anticorpi CD pentru a trasa profilul distribuției markerilor CD între celulele de adenocarcinom gastric infectate cu Helicobacter pylori și cele neinfectate. În mod interesant, au constatat că linia celulară de adenocarcinom gastric AGS infectată cu H. pylori cagA + a prezentat o expresie CD27 crescută, care este esențială pentru menținerea populației de celule T, iar markerii CD crescuți au fost detectați, de asemenea, la pacienții cu cancer gastric infectați cu H. pylori. Acest studiu sugerează nu numai toleranța sistemului imunitar față de cancerul gastric, ci și variațiile răspunsului imunitar exploatate de diferite tulpini de H. pylori.

În plus, matricele de anticorpi pot fi utile în urmărirea unei modificări continue a mediului fiziologic, inclusiv a stării de boală și a răspunsului la terapii și intervenții. După transplantul de ficat, la 94% dintre pacienți s-au constatat leziuni histologice induse de virusul hepatitei C (VHC), unii pacienți suferind o recidivă severă a bolii . Există o nevoie urgentă de biomarkeri predictivi pentru a identifica severitatea bolii recurente. Utilizând un microarray de anticorpi CD, sângele periferic de la pacienții definiți ca fiind pre-transplant, grupuri de transplant timpuriu, mediu și târziu au fost investigate pentru a prezice severitatea recurenței VHC după transplant . Probele seriale de sânge prelevate de la pacienți înainte și după transplantul de ficat au permis urmărirea mediului bolii, cu propriile sale controale interne. Cinci markeri CD (CD27, CD182, CD260, CD41 și CD34) au fost semnificativ crescuți în cazul recidivei severe în comparație cu recidiva ușoară. Acest rezultat arată că matricele de anticorpi pot ajuta la evaluarea severității bolii HCV recurente după transplantul de ficat.

Ellmark et al. au conceput o microrețea de anticorpi recombinanți cu cadru unic (SinFabs) care conține 127 de anticorpi diferiți împotriva antigenelor imunoreglatoare selectate din biblioteca n-CoDeR pe adenocarcinom gastric. Aceștia au elucidat faptul că semnăturile distincte de expresie a proteinelor asociate tumorilor și infecțiilor, cum ar fi IL-9, IL-11 și MCP-4, ar putea fi identificate din proteomul plasmatic și ar putea servi ca potențiali biomarkeri. Aceste constatări pot ajuta la îmbunătățirea înțelegerii cancerului indus de H-pylori și pot deschide calea pentru diagnostice rafinate în viitor.

Amestecurile de anticorpi pe bază de bile au fost efectuate pentru a investiga profilurile proteice diferențiale în plasmă la copiii care suferă de malarie și complicații legate de malarie . Din 1000 de proteine analizate, 41 de proteine au avut o expresie diferențială între copiii infectați cu malarie și controalele din comunitate. Alte 13 proteine au fost legate de severitatea malariei și a bolii. Aceste constatări indică implicarea inflamației, precum și a metabolismului dezechilibrat al glucozei în formele severe ale bolii, iar cele mai mari modificări au fost observate în două dintre proteinele musculare (anhidraza carbonică 3 și creatin-kinaza), ceea ce indică leziuni musculare și leziuni la copiii cu malarie cerebrală. Aceste constatări pot ajuta la dezvoltarea unor teste simple pentru clasificarea copiilor infectați cu malarie în grupul care prezintă un risc mai mare pentru forma severă a bolii.

Cancer

Microarray-urile de anticorpi au fost aplicate pentru cercetarea cancerului în principal pentru a studia progresia cancerului și proteinele candidate care pot servi ca biomarkeri de diagnosticare . Cancerul pancreatic este o boală agresivă cu prognostic slab, iar biomarkerii specifici bolii care oferă un diagnostic precoce și precis sunt necesari de urgență. Utilizând o platformă de microarray de anticorpi recombinanți dezvoltată intern, Wingren et al. au analizat seruri de la 148 de pacienți cu cancer pancreatic, pancreatită cronică, pancreatită autoimună (AIP) și controale sănătoase. Aceștia au identificat un panou de 25 de proteine-țintă, inclusiv IL-2, IL-11, IL-12, TNF-, care au contribuit la distingerea cancerului pancreatic de controalele sănătoase. Această semnătură de 25 de proteine prezintă un potențial de diagnostic ridicat (AUC de 0,88). În plus, grupul a extins recent analiza panoului lor la seturi de probe suplimentare, inclusiv limfom , cancer de prostată și cancer de sân în lizate celulare și plasmă . Aceste constatări sunt utile pentru a ajuta la dezvoltarea unor metode de diagnosticare noi și multivariate.

Una dintre cele mai importante întrebări în biologia cancerului, este determinarea invazivității unei tumori. Un studiu a dezvoltat o platformă personalizată de microarray de anticorpi care conține 4096 de caracteristici pentru a interoga eșantioane de plasmă care acoperă bolile preinvazive și invazive de la un model de șoarece de adenocarcinom ductal pancreatic (PDA) . Aceștia au găsit o semnătură proteică, care cuprinde expresia diferențială a trei proteine, ERBB2, TNC și ESR1, care ar putea fi utilizată pentru a îmbunătăți ASC de la 0,86 (interval de încredere de 95% 0,76-0,96) la 0,97 (IC 95% 0,92-1,0) atunci când este inclus markerul PDA CA19-9.

Majoritatea cazurilor nou diagnosticate de cancer de vezică urinară sunt în stadiu scăzut, de grad scăzut, non-invazive muscular . După rezecția transuretrală standard, 50-70% dintre tumori recidivează, cu toate acestea 10-30% dintre tumori vor evolua spre boală musculo-invazivă . Înțelegerea mecanismului de progresie a tumorii ar putea oferi mai multe informații utile în domeniul clinic. Srinivasan et al. au studiat lizate celulare cu un microarray de anticorpi care conține 810 anticorpi legați de cancer, construit de laboratorul Hoheisel . Autorii au construit un clasificator multivariat care conținea 20 de proteine, care a facilitat predicția recidivei cu o sensibilitate de 80% și o specificitate de 100%. În mod interesant, ei au constatat reprimarea căii de semnalizare TGF-β în cazul cancerului recurent. Factorii de semnalizare IFNG, TNF-α și THBS1 au fost mai puțin exprimați, iar abundența inhibitorului MAPK3 (cunoscut și sub numele de ERK1) a fost mai mare, în timp ce SMAD2, SMAD3 și SMAD4 au fost din nou semnificativ subreprezentate . Datele au indicat că inhibitorii căii de semnalizare TGF-β pot reduce recidiva cancerului de vezică urinară .

Puig-Costa et al. au utilizat microplăci de anticorpi pentru a descoperi biomarkeri pentru cancerul gastric (GC). În special, microarray-ul de anticorpi conținea anticorpi care vizau diferite proteine funcționale bine cunoscute care joacă un rol crucial în progresia cancerului, inclusiv 120 de citokine, 43 de factori angiogenici, 41 de factori de creștere, 40 de factori inflamatori și 10 metaloproteinaze. Analiza Ingenuity Pathway a confirmat faptul că unii biomarkeri, cum ar fi ICAM-1 și angiogenina, au indicat un răspuns inflamator ridicat la pacienții cu CG. S-a constatat că mișcarea celulară și țintele traficului de celule imune, cum ar fi proteina chemoatractivă a monocitelor (MCP)-1, sunt suprareprezentate în cadrul pacienților cu CG. Valorile predictive pozitive și predictive negative în această cohortă de validare au fost de 75% (IC 95% 53-90) și, respectiv, 80% (IC 95% 56-94). În cele din urmă, analizele de microarray de anticorpi ale proteomului inflamator asociat GC au identificat o semnătură a cancerului gastric bazată pe 21 de proteine inflamatorii (INPROGAS) care a discriminat cu acuratețe GC de mucoasa gastrică necanceroasă și poate oferi noi piste pentru analiza progresiei cancerului.

În cazul cancerului de prostată, Schwenk et al. au folosit array-uri de anticorpi pe array-uri de bile de suspensie pentru a compara nivelurile plasmatice ale proteinelor între diferite grupuri pentru a găsi biomarkeri suplimentari pe lângă antigenul specific prostatic (PSA). Pe lângă clasificarea pacienților pe baza PSA, aceștia au identificat niveluri plasmatice scăzute ale CNDP1, iar în cadrul unor studii ulterioare mai mari s-a demonstrat că aceasta se asociază cu forme mai agresive ale bolii. A fost dezvoltat un imunodozator sandwich pentru a valida aceste constatări la peste 1200 de pacienți, iar asocierea scăderii CNDP1 cu metastazele ganglionilor limfatici a fost elucidată în continuare . Acest lucru demonstrează unul dintre foarte puținele studii care au validat cu succes o indicație inițială prin intermediul pipeline-ului microarray de anticorpi și dezvoltarea unui test țintit. Într-o investigație ulterioară a cașexiei cancerului, s-a constatat că nivelurile plasmatice ale CNDP1 au scăzut la pacienții cașexici, indicând astfel un rol metabolic al modificărilor nivelurilor CNDP1 .

Într-un studiu privind tumorile neuroendocrine ale intestinului subțire, Darmanis et al. au investigat nivelurile plasmatice din două seturi de studii independente (77 și 132 de probe) și o matrice de bile țintite pentru 124 de proteine unice. Aceștia au putut obține o acuratețe de clasificare de până la 85% folosind un panou de proteine și au concluzionat cu propunerea unor noi candidați pentru clasificarea tumorilor. Dintre candidații preselectați, cum ar fi pentru IGFBP2 și IGF1, grupul a efectuat teste ELISA pentru a confirma indicațiile. Aceste constatări indică o asociere metabolică a proteinelor plasmatice cu cancerul și susțin luarea în considerare a acestor ținte în viitoarele studii privind cancerul.

Boli neurodegenerative

Analiza expresiei proteinelor oferă o posibilitate de a extinde cunoștințele actuale privind fiziopatologia neurodegenerativă . Progresele recente în domeniul proteomicii au oferit potențialul de a căuta noi biomarkeri folosind microrețele de anticorpi . Progresele în dezvoltarea de protocoale au permis cercetătorilor să studieze nu numai sângele, ci și lichidul cefalorahidian (LCR) .

În cadrul neuroproteomicii, laboratorul Nilsson a efectuat mai multe studii prin utilizarea anticorpilor din Human Protein Atlas împreună cu testele de matrice de bile de suspensie. Profilând LCR de la pacienții cu scleroză multiplă (SM), aceștia au descoperit GAP43, o proteină citoplasmatică implicată în formarea și regenerarea neuronilor, deci un biomarker promițător pentru bolile creierului. Mai recent, Remnestål et al. au comparat nivelurile de proteine din 441 de probe de LCR colectate din diferite seturi de probe de boli neurodegenerative, precum și din LCR colectate post-mortem. Dintre cei 376 de anticorpi, s-a constatat că proteinele sinaptice GAP43 și NRGN au fost asociate cu pacienții cu AD în comparație cu cei de control.

Utilizând probe de plasmă, LCR și țesut cerebral de la pacienți care suferă de SM, s-a efectuat un screening pe scară largă care a pornit de la utilizarea a 4500 de anticorpi pe matrice de bile . S-a constatat că un set de proteine a fost asociat cu subtipurile de SM în LCR și plasmă. Utilizarea unora dintre anticorpii candidați crescuți împotriva IRF8, IL7 și METTL14, de asemenea, pentru analiza prin imuno-fluorescență a țesutului cerebral a arătat colorarea neuronilor în apropierea leziunilor de SM. Acest lucru indică faptul că anticorpii selectați din testele bazate pe matrice pentru analiza fluidelor corporale pot oferi, de asemenea, dovezi suplimentare la nivelul țesutului afectat.

În cele din urmă, matricele de bile au fost utilizate pentru a realiza profilul plasmei de la pacienții care suferă de scleroză laterală amiotrofică (ALS) , unde 367 de pacienți cu ALS și 101 controale au fost analizate pentru 278 de proteine. Studiul concluzionează cu propunerea polipeptidei medii a neurofilamentelor (NEFM), a familiei 25 de purtători de solut (SLC25A20) și a regulatorului de semnalizare a proteinelor G 18 (RGS18) ca proteine valoroase, deoarece sunt implicate în procese legate de fiziopatologia bolii, care justifică o validare suplimentară în seturi de probe independente.

.