Auxotrofie

GeneticsEdit

Colonii A, B, C și D placate pe medii diferite pentru a testa auxotrofia și calea biosintetică (vezi fig. 2B și 2C)

În genetică, se spune că o tulpină este auxotrofă dacă este purtătoare a unei mutații care o face incapabilă să sintetizeze un compus esențial. De exemplu, un mutant de drojdie cu o genă inactivată a căii de sinteză a uracilului este auxotrof (de exemplu, dacă gena Orotidină 5′-fosfat decarboxilază a drojdiei este inactivată, tulpina rezultată este auxotrofă la uracil). O astfel de tulpină este incapabilă să sintetizeze uracilul și va putea crește numai dacă uracilul poate fi preluat din mediul înconjurător. Aceasta este opusul unei tulpini prototrofe uracilofile sau, în acest caz, a unei tulpini de tip sălbatic, care se poate dezvolta și în absența uracilului. Markerii genetici auxotrofi sunt adesea utilizați în genetica moleculară; aceștia au fost utilizați în mod faimos în lucrarea lui Beadle și Tatum, câștigătoare a premiului Nobel, privind ipoteza „o genă – o enzimă”, care face legătura între mutațiile genelor și mutațiile proteinelor. Acest lucru permite apoi cartografierea căilor biosintetice sau biochimice care poate ajuta la determinarea enzimei sau enzimelor care au suferit mutații și sunt disfuncționale în tulpinile auxotrofe de bacterii studiate.

Cercetătorii au folosit tulpini de E. coli auxotrofe pentru aminoacizi specifici pentru a introduce analogi de aminoacizi nenaturali în proteine. De exemplu, celulele auxotrofe pentru aminoacidul fenilalanină pot fi cultivate în medii suplimentate cu un analog, cum ar fi para-azido fenilalanina.

Multe viețuitoare, inclusiv oamenii, sunt auxotrofe pentru clase mari de compuși necesari pentru creștere și trebuie să obțină acești compuși prin alimentație (vezi vitamina, nutrient esențial, aminoacid esențial, acid gras esențial).

Programul complex de evoluție a auxotrofiei vitaminice în arborele eucariot al vieții este intim legat de interdependența dintre organisme.

Figura 2B Calea de biosinteză (biochimică) pentru exemplul din figura 2A

Testul de mutagenitate (sau testul Ames)Edit

Fig 2C Tabel care rezumă și relaționează informațiile din exemplele din figurile 2A și 2B.

Testul de mutageneză cu Salmonella (testul Ames) utilizează mai multe tulpini de Salmonella typhimurium care sunt auxotrofe la histidină pentru a testa dacă o anumită substanță chimică poate provoca mutații prin observarea proprietății sale auxotrofe ca răspuns la un compus chimic adăugat. Mutația pe care o substanță sau un compus chimic o provoacă se măsoară prin aplicarea acestuia la bacteriile de pe o placă ce conține histidină, apoi prin mutarea bacteriilor pe o nouă placă fără suficientă histidină pentru o creștere continuă. În cazul în care substanța nu modifică genomul bacteriei de la auxotrofic la histidină la prototrofic la histidină, atunci bacteriile nu vor prezenta creștere pe noua placă. Astfel, prin compararea raportului dintre bacteriile de pe noua placă și cele de pe vechea placă și a aceluiași raport pentru grupul de control, este posibil să se cuantifice cât de mutagena este o substanță sau, mai degrabă, cât de probabil este ca aceasta să provoace mutații în ADN. O substanță chimică este considerată pozitivă pentru testul Ames dacă provoacă mutații care măresc rata de reversie observată și negativă dacă prezintă valori similare cu cele din grupul de control. Există un număr normal, dar mic, de colonii de reversie așteptat atunci când o bacterie auxotrofă este plasată pe un mediu fără metabolitul de care are nevoie, deoarece aceasta ar putea suferi mutații pentru a reveni la prototrofie. Șansele ca acest lucru să se întâmple sunt scăzute și, prin urmare, determină formarea unor colonii foarte mici. Cu toate acestea, dacă se adaugă o substanță mutagenă, numărul de reversii ar fi vizibil mai mare decât în lipsa substanței mutagenice. Practic, testul Ames este considerat pozitiv dacă o substanță crește șansele de mutație în ADN-ul bacteriei suficient de mult pentru a provoca o diferență cuantificabilă între numărul de reversii din placa cu mutagen și placa cu grupul de control. Un test Ames negativ înseamnă că posibilul mutagene nu a provocat o creștere a numărului de reversibili, iar un test Ames pozitiv înseamnă că posibilul mutagene a crescut șansele de mutație. Aceste efecte mutagene asupra bacteriilor sunt cercetate ca un posibil indicator al acelorași efecte asupra unor organisme mai mari, cum ar fi oamenii. Se sugerează că, dacă o mutație poate apărea în ADN-ul bacterian în prezența unui agent mutagen, atunci același efect ar putea avea loc și în cazul organismelor mai mari, provocând cancer. Un rezultat negativ al testului Ames ar putea sugera că substanța nu este un agent mutagen și nu ar provoca formarea de tumori în organismele vii. Cu toate acestea, doar câteva dintre substanțele chimice rezultate pozitive la testul Ames au fost considerate nesemnificative atunci când au fost testate în organisme mai mari, dar testul Ames pozitiv pentru bacterii nu a putut fi încă legat în mod concludent de manifestarea cancerului în organisme mai mari. Deși poate fi un posibil factor determinant al tumorilor pentru organismele vii, oameni, animale și așa mai departe, trebuie finalizate mai multe studii pentru a se ajunge la o concluzie.

Metode bazate pe auxotrofie pentru a încorpora aminoacizi nenaturali în proteine și proteomuriEdit

Un număr mare de aminoacizi nenaturali, care sunt asemănători cu omologii lor canonici în ceea ce privește forma, dimensiunea și proprietățile chimice, sunt introduși în proteinele recombinante prin intermediul gazdelor de expresie auxotrofe. De exemplu, tulpinile Escherichia coli auxotrofe de metionină (Met) sau triptofan (Trp) pot fi cultivate într-un mediu minimal definit. În această configurație experimentală este posibilă exprimarea proteinelor recombinante ale căror reziduuri canonice de Trp și Met sunt complet înlocuite cu diferiți analogi înrudiți în mediu. Această metodologie conduce la o nouă formă de inginerie proteică, care nu se realizează prin manipularea codonilor la nivelul ADN-ului (de exemplu, prin mutageneză dirijată de oligonucleotide), ci prin reașezări de codoni la nivelul traducerii proteinelor sub o presiune selectivă eficientă. Prin urmare, metoda este denumită presiune selectivă de încorporare (SPI).

Niciun organism studiat până în prezent nu codifică alți aminoacizi în afară de cei douăzeci canonici; doi aminoacizi canonici suplimentari (selenocisteina, pirrolizina) sunt introduși în proteine prin recodificarea semnalelor de terminare a traducerii. Această limită poate fi depășită prin evoluția adaptivă în laborator a unor tulpini microbiene auxotrofe stabile din punct de vedere metabolic. De exemplu, în 2015 a avut loc prima încercare clar reușită de a evolua Escherichia coli care poate supraviețui numai cu ajutorul aminoacidului nenatural tienopirrolil) alanină ca unic înlocuitor al triptofanului.

.