Beta-Galactosidază (A better Miller)

înapoi la protocoale

Cuvinte

β-Galactozidaza este codificată de gena lacZ din operonul lac din E. coli. Este o proteină de dimensiuni mari (120 kDa, 1024 aminoacizi) care formează un tetramer. Funcția enzimei în celulă este de a scinda lactoza în glucoză și galactoză, astfel încât acestea să poată fi utilizate ca surse de carbon/energie. Compusul sintetic o-nitrofenil-β-D-galactosid (ONPG) este, de asemenea, recunoscut ca substrat și scindat pentru a produce galactoză și o-nitrofenol, care are o culoare galbenă. Când ONPG este în exces față de enzimă într-o reacție, producția de o-nitrofenol pe unitate de timp este proporțională cu concentrația de β-Galactozidază; astfel, producția de culoare galbenă poate fi folosită pentru a determina concentrația enzimei.

Atunci, de ce ne pasă? De obicei, experimentele sunt concepute astfel încât concentrația de β-Galactosidază din celulă să fie o citire pentru un anumit aspect al unui sistem studiat. De exemplu, un cercetător poate să fuzioneze un promotor la gena lacZ și să utilizeze nivelurile de β-Gal ca o citire a activității promotorului în diferite condiții. În 1972, Jeffrey Miller a publicat „Experiments in Molecular Genetics”, care conținea un protocol pentru determinarea cantității de β-Gal cu ONPG. Din acest motiv, testele ONPG/β-Gal sunt denumite teste „Miller”, iar o cantitate standardizată de activitate β-Gal este o „unitate Miller”.

1 unitate Miller = \displaystyle{ 1000 * \frac{(Abs_{420} – (1,75*Abs_{550}))}{(t * v * Abs_{600})} }

unde:

• Abs420 este absorbanța galbenului o-nitrofenol,
• Abs550 este împrăștierea de la resturile celulare, care, atunci când este înmulțită cu 1.75 aproximează împrăștierea observată la 420 nm,
• t = timpul de reacție în minute,
• v = volumul culturii analizate în mililitri,
• Abs600† reflectă densitatea celulară.

†Rețineți că această valoare este diferită pentru fiecare spectrofotometru utilizat și trebuie calibrată prin însămânțarea unor diluții de culturi Abs600 cunoscute pentru a determina unitățile formatoare de colonii per Abs600.

În cartea sa, dr. Miller explică faptul că această formulă dă aproximativ 1 unitate Miller pentru E. coli neindusă (producție scăzută de β-Gal) și aproximativ 1000 de unități pentru o cultură complet indusă (crescută pe lactoză sau IPTG).

Din experiența mea, culturile de MG1655 induse cu 1 mM IPTG în fază logaritmică au 1500-1800 de unități Miller. Motivul acestei diferențe nu este cunoscut, dar bănuiesc că provine din diferențele de Abs600/densitate celulară dintre spectrofotometrul lui Dr. Miller și cel pe care îl folosesc eu și din faptul că eu îmi fac testele Miller la 30 °C (pentru comoditate), în timp ce Dr. Miller și-a făcut testele la 28 °C. Am realizat fuziuni de promotori care generează ~40.000 de unități Miller; cu toate acestea, după cum se va discuta mai jos, această valoare este prea mare pentru test și, prin urmare, protocolul a fost modificat pentru a reduce această valoare.

Protocol

Protocolul pe care îl folosesc este derivat dintr-o lucrare a lui Zhang și Bremer (JBC 270, 1995, Free full text!) în care protocolul original al lui Miller a fost mult simplificat pentru a permite măsurarea mai multor probe cu mai puține manipulări.

Pe scurt, protocolul constă în măsurarea densității celulare a unei culturi de bacterii (Abs600), apoi îndepărtarea unei părți alicote de celule din cuvă și amestecarea lor cu o soluție de „permeabilizare” care conține detergent care întrerupe membranele celulare (dar lasă β-Gal-ul intact). Acest lucru ucide celulele și oprește traducerea. După incubare, se adaugă o soluție de „substrat” ONPG și se lasă să se dezvolte culoarea galbenă. Se adaugă apoi o soluție „stop” și se măsoară absorbanța o-nitrofenolului.

1. Creșteți culturile în orice condiții doriți să testați.
2. În timpul creșterii, măsurați în prealabil alicote de 80 μL de soluție de permeabilizare în 1.5 ml de tuburi de microcentrifugă și închideți-le.
3. Măsurați Abs600 și ÎNREGISTRAȚI-O!
4. Remergeți o alicotă de 20 μL din cultură și adăugați-o la cei 80 μL de soluție de permeabilizare.

Eșantionul este acum stabil pentru câteva ore. Acest lucru vă permite să efectuați experimente în timp.

1. După prelevarea ultimei probe, mutați probele și soluția de substrat în camera caldă la 30 °C timp de 20-30 de minute.
2. Adaugați 600 μL de soluție de substrat în fiecare tub și NOTAȚI ORA ADĂUGĂRII.
3. După ce s-a dezvoltat suficientă culoare, adăugați 700 μL de soluție de oprire, amestecați bine și NOTAȚI ORA DE OPRIRE.
4. După oprirea ultimei probe (unele pot dura mai mult decât altele, dar, în general, se termină în 30-90 de minute), transferați tuburile într-o microcentrifugă și centrifugați-le timp de 5-10 minute la viteză maximă.
5. Îndepărtați cu grijă tuburile din centrifugă și transferați soluția din partea superioară a tuburilor în cuva (cuvele) dumneavoastră. Încercați să evitați să aveți particule în cuvă, astfel încât împrăștierea să nu influențeze citirea.
6. Înregistrați Abs420. Acesta ar trebui să fie mai mic de 1 și mai mare de 0,05. Dacă este puțin în afara acestui interval, nu vă faceți griji.

Calculați unitățile Miller ca:

\displaystyle{ 1000 * \frac{(Abs_{420})}{((Abs_{600} \text{ de cultură prelevată})*(\text{volum } )*(\text{timp de reacție}))}}. }

Comentarii privind testul

• Reshma 11:28, 15 octombrie 2007 (CDT): Miller recomandă o cultură cu OD600 = 0,28 până la 0,70. Cu toate acestea, el susține că se pot folosi și culturi de o noapte, dar că celulele care cresc exponențial dau teste mai precise .

• Când se face reacția? Nu am găsit niciodată un răspuns bun la această întrebare în literatura de specialitate. Dacă am lăsat o reacție să se termine, am măsurat un Abs420 de ~2-3. Desigur, acest lucru este în afara intervalului de încredere al spectrofotometrului, dar dă o indicație despre cât de departe poate merge reacția. Am obținut date reproductibile atunci când culoarea galbenă era doar detectabilă înainte de adăugarea soluției de oprire până la aproximativ culoarea bulionului LB înainte de oprire. Nu uitați, aveți nevoie de substrat pentru a satura enzima pe parcursul reacției, așa că nu le lăsați să meargă prea departe. Eu fac în mod obișnuit trei măsurători separate pentru fiecare cultură și le fac media.
  • Reshma 11:28, 15 octombrie 2007 (CDT): Miller recomandă ca citirea OD420nm să fie în mod ideal de 0,6-0,9 .

• Frecvent, oamenii folosesc cuvete de plastic de unică folosință pentru a măsura atât turbiditatea culturii cât și galbenul o-nitropenol. Din experiența mea, cuvetele de unică folosință au o optică ORIBILĂ: da, sunt transparente, dar traseul luminii este distorsionat în mod patetic (este suficient să vă uitați printr-una la un obiect îndepărtat). Aceasta nu este o mare problemă dacă se folosește aceeași cuvă pentru blanc și pentru probă și dacă aceasta este orientată în același mod în spectrofotometru. Problema apare atunci când multe probe diferite sunt măsurate în cuve diferite. Valorile pot varia foarte mult chiar și pentru aceeași cultură măsurată în cuvete diferite. Vă recomand să folosiți fie o cuvă de sticlă sau de cuarț de înaltă calitate, fie să măsurați probele într-un cititor de plăci folosind plăci cu 96 de godeuri cu fund plat. Am constatat că eroarea mea de pipetare a 150 μL de cultură pentru măsurătorile Abs600 a fost MULT mai mică decât în cazul utilizării cuvetelor de unică folosință. Desigur, turbiditatea măsurată ar trebui calibrată la celule/mL ca și în cazul unei cuvete de 1 cm.

• Prin centrifugarea probelor și îndepărtarea cu grijă a unei probe din supernatant, evitați să fiți nevoiți să măsurați dispersia la 550 nm și să ghiciți ce ar fi la 420 nm.

• Dacă reacția dvs. are prea mult β-Gal, tubul va deveni galben în câteva minute (sau chiar secunde). Acest lucru este prea rapid. Una dintre cele mai mari contribuții la eroare va fi estimarea de către dumneavoastră a timpului de reacție. Având condițiile de reacție setate astfel încât să dureze aproximativ o oră, erorile de timp devin nesemnificative. Dacă aveți nevoie să încetiniți reacția, puteți utiliza mai puține celule și puteți crește cantitatea de tampon de permeabilizare astfel încât volumul să fie tot de 100 μL. Alternativ, puteți reproiecta situsul de legare la ribozom al construcției β-Gal pentru a-l slăbi. Am constatat că, dacă celulele mele produceau 40.000 de unități Miller de β-Gal, erau foarte bolnave din cauza stresului de traducere. În acest caz, era mai bine să slăbești traducerea ARNm β-Gal.
  • Fac aceste reacții ca și cum aș face cinetica enzimatică. Încep probele la interval de 10 secunde (cu numărătoarea inversă a timpului), astfel încât este posibil să obțineți timpi de reacție exacți chiar dacă lăsați reacțiile să dureze doar câteva minute. Obțin rezultate foarte reproductibile cu timpi de reacție de 1,5-30 min. Odată ce vă faceți o idee despre cât timp vor avea nevoie reacțiile dumneavoastră, este ușor să grupați eșantioanele care vor avea nevoie de același timp de reacție. Efectuarea fiecărei probe în triplu exemplar vă va da o oarecare încredere că timpul dumneavoastră este reproductibil.–Kathleen 16:43, 14 decembrie 2005 (EST)

• Iată un exemplu de date reale pe care le-am obținut folosind acest test. A fost un experiment de tip „timecourse”. La fiecare dată, am prelevat 1 ml din fiecare dintre culturile mele, am măsurat OD600, am luat trei alicote de 20 µL direct din cuvă și am adăugat fiecare la 80 µL de soluție de permeabilizare. Am efectuat testul exact așa cum am descris mai sus, iar toate probele au fost păstrate la temperatura camerei până la terminarea cronometrării. OD600 pentru aceste culturi a variat de la 0,4 la 4 (în specificația mea) pe parcursul acestui experiment, iar timpii de reacție pentru testele β-Gal au variat de la 2-25 min. Cele trei teste β-Gal individuale pentru fiecare punct de timp pentru fiecare cultură (simboluri roșii sau negre) sunt reprezentate în grafic pentru a ilustra reproductibilitatea testului în cadrul fiecărui experiment.–Kathleen

Rețete

Soluție de permeabilizare

Aveți nevoie de 80 μL pentru fiecare probă.

• 100 mM fosfat de sodiu dibazic (Na2HPO4)
  • (Protocolul Zhang are 200 mM fosfat de sodiu. Nu am putut niciodată să-l pun în soluție cu celelalte componente, indiferent ce am încercat, așa că l-am redus la 100 mM. Am folosit chiar și 50 mM fără nicio schimbare detectabilă)
• 20 mM KCl
• 2 mM MgSO4
• 0,8 mg/mL CTAB (bromură de hexadeciltrimetilamoniu)
• 0.4 mg/mL deoxicolat de sodiu
• 5,4 μL/mL beta-mercaptoetanol

Soluție de substrat

Este nevoie de 600 μL pentru fiecare probă.

• 60 mM Na2HPO4
• 40 mM NaH2PO4
• 1 mg/mL o-nitrofenil-β-D-Galactosid (ONPG)
• 2.7 μL/mL β-mercaptoetanol

(Protocolul Zhang are, de asemenea, 20 μg/mL CTAB și 10 μg/mL deoxicolat. Le-am omis pe acestea gândindu-mă că mai există încă destul din soluția de permeabilizare și, dacă nu sunt încă moarte, nu vor fi.)

Soluție de oprire

Aveți nevoie de 700 μL pentru fiecare probă.

• 1 M Carbonat de sodiu (Na2CO3)

Ph-ul ridicat al soluției de oprire denaturează β-Gal și dublează aproximativ culoarea galbenă a reacției.

.