BiomedicalReports

Introducere

Carcinomul hepatocelular (HCC) este o malignitate primară a hepatocitelor, reprezentând 80% din toate cancerele hepatice primare. La nivel mondial, HCC se situează pe locul patru în topul cauzelor de deces legate de cancer (1).Pacienții cu boli hepatice cronice asociate cu infecții cu virusul hepatitei B sau virusul hepatitei C dezvoltă frecvent HCC(2). S-a înregistrat o îmbunătățire a tehnicilor chirurgicale și dezvoltarea mai multor modalități de tratament nechirurgical; cu toate acestea, îmbunătățirea pentru prognosticul extrem de slab al pacienților cu HCC rămâne limitată (3).

Investigarea extensivă a apoptozei, cunoscută și sub numele de moarte celulară programată, în ultimele decenii a evidențiat acest proces ca o metodă adecvată pentru terapia cancerului (4,5). Cu toate acestea,numeroase medicamente cu efecte apoptotice sunt în prezent limitate pentru terapia cancerului din cauza efectelor secundare. Prin urmare, identificarea unor agenți terapeutici noi și de încredere care pot induce eficient apoptoza celulelor canceroase în tratamentul pacienților cu HCC este importantă.

Recent, medicina tradițională chineză are un rol important în tratamentul tumorilor maligne datorită efectelor sale semnificativ ameliorate și efectelor secundare mai mici (6). Gecko, unul dintre medicamentele tradiționale chinezești populare, a fost folosit ca un medicament brut pentru tratarea tumorilor maligne în practica clinică (7-9). Crudipeptidele de gecko și extractul de etanol de gecko pot induce apoptoza în celulele umane de HCC și pot exercita o activitate antitumorală la șoarecii purtători de ascită H22, lucru demonstrat în studiile noastre anterioare (10,11). Scopul prezentului studiu a fost de a examina efectul apoptotic și mecanismul subiacent al amestecului de peptide de gecko (GPM) în liniile celulare de carcinom hepatic uman HepG2 in vitro.

Materiale și metode

Materiale medicale și reactivi

Gecko japonicus a fost achiziționat de la BozhouYonggang Medicinal Herbs Factory Co., Ltd., BozhouYonggang. (Anhui, China). Linia celulară umană de HCC HepG2 a fost prezentată de Medical Science ResearchInstitute of Henan (Henan, China).

Bromura de metiltiazolildifenil-tetrazolil-tetrazoliu (MTT) și Hoechst 33258 au fost achiziționate de la Sigma (St. Louis, MΟ, SUA).Kitul de testare a activității caspazei a fost achiziționat de la BeyotimeInstitute of Biotechnology (Beijing, China). Anticorpul primar împotriva factorului care induce apoptoza (AIF) a fost achiziționat de la BosterInc. (Wuhan, Hubei, China), iar anticorpul împotriva β-actinei a fost achiziționat de la Proteintech (Wuhan, Hubei, China). Anticorpul primar împotriva citocromului c (Cyt c) și anticorpul secundar conjugat cu cel de șoarece sau de iepure au fost achiziționate de la Zhongshan GoldenBridge Biotechnology Co., Ltd., China. (Beijing, China).

Lectorul de microplăci a fost produs de BioTekInstruments, Inc. (Winooski, VT, SUA). Microscoapele cu fluorescență BX41 și microscoapele inversate au fost produse de Olympus (Tokyo, Japonia).

Prepararea GPM

Pudra de gecko (100 g) a fost amestecată cu 400 ml de apă bidistilată și transformată într-un omogenat. În urmacentrifugării la 5.600 × g timp de 5 min, precipitatul a fostcolectat și înmuiat în 400 ml de soluție de etanol 55%. Supernatantul a fost obținut în urma centrifugării la 5 600 × g timp de 5 minute și a fost evaporat sub presiune redusă la 55°C. Ulterior, au fost colectate pulberi galbene în urma liofilizării lichidului rezidual. Cromatografia prin filtrare pe gel (SephadexG-25) a fost utilizată pentru a purifica pulberile galbene și, în final, a fost colectat GPM.

Cultura celulară și observarea morfologică

Celele HepG2 au fost cultivate în mediu Dulbecco’s modifiedEagle’s medium suplimentat cu 10% ser fetal bovin, 100 U/mlpenicilină și streptomicină la 37°C într-un incubator umidificat cu 5%CO2. Mediul de cultură a fost înlocuit la fiecare două zile, iar celulele aflate în faza de creștere logaritmică au fost utilizate pentru următoarele experimente. Celulele HepG2 (3,0×104 celule/ml) au fost incubate cu diferite concentrații de GPM timp de 24 de ore. Celulele au fost observate și imaginile au fost capturate cu un microscop cu contrast de fază inversat pentru a detecta modificările morfologice.

Dezvoltarea MTT

Celele HepG2 au fost însămânțate într-o placă cu 96 de godeuri la o densitate de 6,0×103 celule/gaiță. Diferite concentrații de GPM și 0,003 mg/ml fluorouracil (5-Fu) au fost adăugate în fiecare puț. după incubare timp de 20, 44 și, respectiv, 68 de ore, s-au adăugat 20 µl de reactivMTT (5 mg/l) pe puț și s-au incubat timp de încă 4 ore. Supernatantul a fost înlocuit cu 200 µl de dimetilsulfoxid, iar absorbția (A) la 490 nm a fost măsurată cu un cititor universal de microplăci ELX800. Rata de inhibare a proliferării celulare (IR) a fost după cum urmează: IR = (1-AGPM/Control) ×100%.

Colorarea cu Hoechst 33258

După ce au fost cultivate peste noapte într-o placă cu 6 godeuri, celuleleHepG2 au fost tratate cu diferite concentrații de GPM (0,0,06 sau 0,06 sau 0.08 mg/ml) și 0,003 mg/ml 5-Fu în mediu de cultură proaspăt la37°C timp de 24 h. Celulele au fost spălate de două ori cu fosfat-bufon-salină (PBS) și colorate cu soluție de colorare Hoechst 33258 (10µg/ml). După 15 min de incubare în întuneric, celulele au fost spălate de două ori cu PBS rece și au fost examinate cu microscopul fluorescent.

Analiza activității caspazei

Determinarea activității caspazei-3 și caspazei-9 a fost realizată cu kitul Caspase Activity Assay, conform protocolului producătorului. După expunerea la mai multe concentrații de GPM (0, 0,06 sau 0,08 mg/ml) și 0,003 mg/ml 5-Fu timp de 24 de ore, celulele au fost recoltate și resuspendate în tampon de liză. Ulterior, celulele au fost incubate în tamponul de liză timp de 20 de minute și au fost centrifugate la 16 000 × g la 4°C timp de 3 minute. Supernatanții au fost colectați și nivelurile de proteine au fost determinate prin metoda Bradford, iar activitățile caspazei-3 și caspazei-9 au fost măsurate cu ajutorul tamponului de reacție (care conține ditiotreitol) și a substraturilor caspazei, respectiv a substractopeptidelor Ac-DEVD-pNA și Ac-LEHD-pNA. Valorile obținute la densitatea optică la 405 nm au fost exprimate ca:AGPM/AControl.

Analiză Western blot

Celele HepG2 au fost tratate cu GPM (0, 0,06 sau 0,08mg/ml) și, respectiv, 0,003 mg/ml 5-Fu timp de 24 h. Pe scurt, celulele au fost tratate cu tampon de liză la gheață timp de 30 de minute și au fost centrifuge la 13 000 × g timp de 30 de minute la 4°C. Concentrația de proteine a fost determinată prin metoda Bradford. Proteinele au fost separate prin 12% SDS-PAGE și au fost transferate pe o membrană PVDF.Membrana PVDF a fost blocată cu 5% lapte degresat uscat în PBS timp de o oră la 37°C, spălată de 3 ori cu soluție salină tamponată cu Tris conținând 0,1%Tween-20 (TBST) timp de 15 minute și a fost urmată de incubarea cu anticorpi primari: Caspaza-3 (cat. nr. sc-7148; 1:200, policlonal de iepure antiuman), caspaza-9 (cat. nr. sc-8355; 1:200, policlonal de iepure antiuman), Cyt c (cat. nr. sc-13156; 1:500, monoclonal de șoarece antiuman), AIF (nr. de cat. PB0388; 1:200, policlonal de iepure antiuman) și β-actina (nr. de cat. 66009-1-Ig; 1:5.000, monoclonal de șoarece antiuman) peste noapte la 4°C.Ulterior, probele au fost spălate cu TBST timp de 30 min, iar membrana a fost incubată cu anticorpii secundari corespunzători timp de 1 h. Chemiluminescența a fost detectată cu ECL Plus (Beyotime Institute of Biotechnology).

Analiză statistică

Datele experimentale sunt reprezentate ca medie ± abatere standard. Diferențele dintre grupuri au fost examinate cu analiza varianței pe o singură cale folosind sistemul SPSS 19.0 (IBM Corp., Armonk, NY, SUA). P<0,05 a fost considerat ca indicând o diferență semnificativă din punct de vedere statistic.

Rezultate

GPM inhibă proliferarea celulelor HepG2

Efectul GPM asupra creșterii celulelor HepG2 a fost evaluat prin testul MTT. Rezultatele au arătat că GPM a inhibat în mod semnificativ proliferarea celulelor HepG2 într-o manieră dependentă de doză și timp (Fig. 1). După tratamentul cu GPM timp de 24, 48 sau 72 de ore, valorileIC50 au fost de 0,154, 0,133 și, respectiv, 0,051 mg/ml.Celulele tratate cu GPM au prezentat o morfologie rotunjită, contracție și pierdere de atașament (Fig. 2).

Efectele GPM asupra nuclearmorfologiei

Morfologia apoptotică a celulelor a fost identificată prin colorarea cuHoechst 33258. După cum se arată în Fig.3, modificările morfologice ale caracteristicilor apoptotice, cum ar fi condensarea nucleară, condensarea cromozomială și corpurile apoptotice granulare în celulele tratate cu GPM au fost, de asemenea, observate prin microscopie cu fluorescență.

Efectele GPM asupra activității caspazei

Ca inițiatori și executanți ai morții celulare, proteazele cu cisteină au un rol important în procesul apoptotic(12). După cum se arată în Fig. 4, tratamentul cu GPM a provocat o creștere semnificativă, dependentă de doză, a activității caspazei-3 și caspazei-9,sugerând un efect apoptotic al GPM în celulele HepG2.

Efectele GPM asupra nivelurilor de expresie a proteinelor apoptotice

După cum se arată în Fig. 5,Western blotting a demonstrat că eliberarea de Cyt c șiAIF din mitocondrii în citosol a crescut, în timp ce nivelurile de expresie ale caspazei-3 și caspazei-9 au fost crescute de tratamentul cu GPM într-o manieră dependentă de doză. Modificările la nivelul proteinelor au fost semnificativ diferite în comparație cu grupul de control (Fig. 6) (P<0,05).

Discuție

În ultimele decenii, incidența cancerului a crescut în mod semnificativ, ceea ce cauzează daune grave sănătății umane(13). Deși strategiile terapeutice contemporane au demonstrat o capacitate anticancerigenă evidentă, efectele secundare severe rămân inevitabile. Căutarea de noi agenți antitumorali care să fie mai eficienți, dar mai puțin toxici, a atras o atenție din ce în ce mai mare (14).Extragerea peptidelor din medicamentele naturale pentru terapia cancerului a fost raportată pe scară largă în întreaga lume și este promițătoare în tratamentul cancerului. Peptidele ar putea avea un rol în diferite moduri, cum ar fi inhibarea proliferării tumorilor, oprirea ciclului celular, suprimarea angiogenezei tumorale și inducerea apoptozei (15). Gecko a fost utilizat pe scară largă în medicina tradițională chineză timp de sute de ani. În studiile noastre anterioare, peptidele brute de gecko au arătat o activitate antitumorală eficientă asupra șoarecilor purtători de H22 și a liniei celulare HepG2 (16,17).Cu toate acestea, efectele GPM asupra hepatocitelor umane nu au fost încă elucidate. Prin urmare, scopul prezentului studiu a fost de a dezvălui în continuare mecanismul molecular de bază prin care GPM induceapoptoza în linia celulară umană de HCC HepG2.

În studiul de față, testul MTT a arătat că GPM ar putea inhiba creșterea celulelor HepG2 într-o manieră dependentă de doză și de timp. Experimentele ulterioare au demonstrat că aceastăinhibiție s-a datorat tratamentului cu GPM, care a indus o moarte celulară dependentă de doză cu modificări morfologice tipice. Aceste date sugerează că GPM poate fi un agent potențial eficient pentru tratamentul cancerului.Folosind colorarea cu Hoechst 33258, s-a demonstrat că moartea celulară indusă de GPM în celulele HepG2, care aparține apoptozei, pentru nivelurile de expresie ale caspazei-3 și caspazei-9 a crescut după tratamentul cu GPM. Analiza Western blotting a arătat, de asemenea, că GPM ar putea stimula eliberarea de Cyt c și AIF din mitocondrii în citosol, sugerând că apoptoza indusă de GPM în celulele HepG2 este mediată de calea apoptotică mitocondrială.

Apoptoza este mecanismul major de control prin care celulele mor în numeroase condiții, cum ar fi repararea incorectă a leziunilor ADN (18). Acest proces celular autodistructiv este esențial pentru dezvoltarea organelor, remodelarea țesuturilor, reglarea imunitară și mai multe stări de boală (19). Numeroși agenți antitumorali își exercită efectele terapeutice prin inducerea apoptozei (20-24). Mitocondriile au un rol esențial în reglarea apoptozei celulare și există anumite proteine care sunt strâns asociate cu apoptoza celulară în interiorul membranei (25).

Ultrastructura mitocondrială este normală în timpul apoptozei celulare, dar funcția sa s-a schimbat semnificativ.Disfuncția mitocondrială induce deschiderea porilor de tranziție a permeabilității mitocondriale și eliberează proteine mitocondriale apoptogene, cum ar fi AIF (26) și Cyt c (27). În mod normal, proteinele AIF și Cyt c sunt localizate în spațiul intermembranar al mitocondriilor, în timp ce sub acțiunea diferitelor AIF, acestea sunt eliberate din mitocondrii în citoplasmă. AIF se transferă în cele din urmă în nucleu, provocând modificările caracteristice apoptozei. AIF a fost prima proteină descoperită care a mediat moartea celulară independentă de caspază (28). Cyt c este eliberat în citosol și induce apoptoza dependentă de caspază, ceea ce duce la activarea caspaselor și la apoptoză (29,30). AIF ar putea crește semnalele apoptotice prin promovarea eliberării mitocondriale a Cyt c. Deși apoptoza indusă de AIF nu depinde de caspază, există o acțiune încrucișată, o sinergie și chiar un antagonism între AIF, caspază și Cyt c. Datorită diverselor semnale de moarte și tipuri de celule, reglarea apoptozei celulare se realizează de fapt prin diverse interacțiuni și prin întreaga rețea de semnale, care necesită studii suplimentare.

Caspaza, o familie de proteaze cu cisteină, este o secțiune integrantă a căii apoptotice. Inducereaapoptozei este asociată cu activarea caspazei (31). Caspaza-3 se află în aval de celulopatie, iar caspaza-9 este caspaza apicală în calea apoptozei inițiate de mitocondrie (32). Activarea caspazei-3 este corelată cu activarea caspazei-9 (33).Eliberarea de Cyt c declanșează activarea caspazei-9 prin formarea apoptosomei. Activarea ulterioară a inițiatorului caspazei-9 determină scindarea caspazei efectoare-3, care ulterior activează DNaza și provoacă fragmentarea ADN în nucleu (34). Pe scurt, caspaza-3 este o caspază executantă care poate fi activată prin următoarea cale mitocondrială care implică activarea caspazei-9 datorită eliberării Cyt c în citosol (35), provocând în final moartea celulară programată.

În concluzie, GPM a indus probabil moartea celulară apoptotică în celulele HepG2 prin activarea căii apoptotice mitocondriale. Aceste rezultate demonstrează că GPM poate fi un potențial agent terapeutic pentru tratamentul HCC.

Recunoștințe

Studiul de față a fost sprijinit de un grant din partea programelor cheie pentru dezvoltarea științei și tehnologiei din provincia Henan (nr. 142102310031).

Glosar

Abbreviații

Abbreviații:

GPM	amestec de peptide de gecko
Cyt c	citocrom c

	Abrams P și Marsh JW: Abordarea actuală a carcinomului hepatocelular. Surg Clin North Am. 90:803-816. 2010.Vezi articolul : Google Scholar : PubMed/NCBI
	But DY, Lai CL și Yuen MF: Naturalhistory of hepatitis-related hepatocellular carcinoma. World JGastroenterol. 14:1652-1656. 2008. Vezi articolul : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Faivre S, Bouattour M și Raymond E: Noi terapii moleculare în carcinomul hepatocelular. Liver Int.31(Suppl 1): 151-160. 2011. Vezi articolul : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Kang TH, Bang JY, Kim MH, Kang IC, Kim HMși Jeong HJ: Atractylenolide III, un sesquiterpenoid, induceapoptoza în celulele de carcinom pulmonar uman A549 pe calea morții mediată de viamitocondrii. Food Chem Toxicol. 49:514-519.2011. Vezi articolul : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Liao N, Ao M, Zhang P și Yu L: Extractsof Lycoris aurea induce apoptoza în celulele de sarcom murin S180.Molecules. 17:3723-3735. 2012. Vezi articolul : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Wang YX, Gu XX, Geng D, Sun HY, Wang CM,Jiang GX, Hou XN și Ma CH: Diferențierea celulelor de hepatocarcinom uman bel-7402 indusă de extractele apoase de gecko proaspăt (AG) și activitatea sa anti-tumorală in vivo. J Ethnopharmacol.155:1583–1588. 2014. Vezi articolul : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Song P: Wang XM și Xie S: Experimentalstudy on mechanisms of lyophilized powder of fresh gekko Chinenisin inhibiting H22 hepatocarcinoma angiogenesis. Zhongguo Zhong XiYi Jie He Za Zhi. 26:58-62. 2006 (în chineză). PubMed/NCBI
	Yang JX și Wang XM: Progress study andresearch on treating tumor of Gecko. Chinese Journal of Digestion.14:2428-2431. 2006.
	Wu BD: Treatment of 105 cases of esophagustumor by compound recipe of Gecko. Zhongguo Zhongxiyi Jiehe Za Zhi.19:5021999.(În chineză).
	Song Y, Wang JG, Li RF, Li Y, Cui ZC, DuanLX și Lu F: Peptidele brute de Gecko induc apoptoza în celulele de carcinom hepatic uman in vitro și exercită o activitate antitumorală într-un model de xenogrefă de mouseascites H22. J Biomed Biotechnol. 2012:7435732012.Vezi articolul : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Cui CC: Research of antitumor effect ofGecko ethanol extract II. Henan University of Science andTechnology. 2013.(În chineză).
	Jiang CP, Ding H, Shi DH, Wang YR, Li EGand Wu JH: Pro-apoptotic effects of tectorigenin on humanhepatocellular carcinoma HepG2 cells. World J Gastroenterol.18:1753-1764. 2012. Vezi articolul : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Olefson S and Moss SF: Obesity and relatedrisk factors in gastric cardia cardia adenocarcinoma. Gastric Cancer.18:23-32. 2015. Vezi articolul : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Wang N, Tan HY, Li L, Yuen MF și Feng Y:Berberine and Coptidis Rhizoma as potential anticanceragents: Actualizări recente și perspective viitoare. J Ethnopharmacol.176:35-48. 2015. Vezi articolul : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Costantino VV, Lobos-Gonzalez L, Ibañez J,Fernandez D, Cuello-Carrión FD, Valenzuela MA, Barbieri MA, SeminoSN, Jahn GA, Quest AF și Lopez LA: Dehidroleucodina inhibă creșterea tumorală într-un model preclinic de melanom prin inducerea ciclului celulararrest, senescență și apoptoză. Cancer Lett. 372:10-23. 2016.Vezi articolul : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Xu XL, Wang JG, Li RF, Li SP, Qiu XJ andDuan LX: Efectul inhibitor al amestecului de peptide Gecko asupra creșterii liniei celulare de carcinom scuamos esofagian uman EC109. ZhongguoLin Chuang Yao Li Xue Za Zhi. 29:602-604. 2013.
	Song Y, Wang JG, Cui CC, Qian X, Li RF,Duan LX, Liu L și Xi SM: Mecanismul apoptotic al crudepeptidelor gecko pe linia celulară de carcinom hepatic uman HepG2. Zhong Yao Cai.35:863-866. 2012 (în chineză). PubMed/NCBI
	Lowe SW și Lin AW: Apoptosis in cancer.Carcinogenesis. 21:485-495. 2000. Vezi articolul : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Bhatia D, Mandal A, Nevo E și Bishayee A: Efectele de inducere a apoptozei ale extractelor din plantele din deșert în celulele de hepatocarcinom uman HepG2. Asian Pac J Trop Biomed. 5:87-92.2015. Vezi articolul : Google Scholar
	Li CJ, Huang SY, Wu MY, Chen YC, Tsang SF, Chyuan JH și Hsu HY: Inducerea apoptozei de către extractul etanolic de frunze de Corchorus olitorius în celulele de carcinom hepatocelular uman (HepG2) prin intermediul unei căi dependente de mitocondrie. molecule. 17:9348-9360. 2012. Vezi articolul : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Yang B, Wang YQ, Cheng RB, Chen JL, ChenJ, Jia LT și Zhang RS: Inducerea citotoxicității și apoptozei în celula de cancer gastric uman SGC-7901 de către izovaltratul acetoxihidrinisolat din Patrinia heterophylla bunge implică o cale mitocondrială și arestarea ciclului celular în faza G2/M. Asian Pac J Cancer Prev.14:6481-6486. 2013. Vezi articolul : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Kim TM, Shin SK, Kim TW, Youm SY, Kim DJși Ahn B: Elm tree bark extract inhibits HepG2 hepatic cancer cellgrowth via pro-apoptotic activity. J Vet Sci. 13:7-13. 2012.Vezi articolul : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Nho KJ, Chun JM și Kim HK: Extractul de etanol din Dianthus chinensis L. induce apoptoza în celulele de carcinom hepatocelular uman HepG2 in vitro. Evid BasedComplement Alternat Med. 2012:5735272012. Vezi articolul : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Li L, Chen GG, Lu YN, Liu Y, Wu KF, GongXL, Gou ZP, Li MY și Liang NC:Ent-11α-Hydroxy-15-oxo-kaur-16-en-19-oic-acid inhibă creșterea celulelor A549 de cancer pulmonar uman prin oprirea ciclului celular și declanșareaapoptozei. Chin J Cancer Res. 24:109-115. 2012. Vezi articolul : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Cao MR, Li Q, Liu ZL, Liu HH, Wang W, LiaoXL, Pan YL și Jiang JW: Harmina induce apoptoza în celulele HepG2prin intermediul căii de semnalizare mitocondriale. Hepatobiliary Pancreat DisInt. 10:599-604. 2011. Vezi articolul : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Susin SA, Lorenzo HK, Zamzami N, Marzo I,Snow BE, Brothers GM, Mangion J, Jacotot E, Costantini P, LoefflerM, et al: Molecular characterization of mitochondrialapoptosis-inducing factor. Nature. 397:441-446. 1999. Vezi articolul : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Liu X, Kim CN, Yang J, Jemmerson R andWang X: Inducerea programului apoptotic în extracte libere de celule: Necesitatea pentru dATP și citocrom c. Cell. 86:147-157. 1996.Vezi articolul : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Norberg E, Orrenius S and Zhivotovsky B:Mitochondrial regulation of cell death: Prelucrarea factorului care induce apoptoza (AIF). Biochem Biophys Res Commun.396:95-100. 2010. Vezi articolul : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Chandra D, Liu JW și Tang DG: Earlymitochondrial activation and cytochrome c up-regulation duringapoptosis. J Biol Chem. 277:50842-50854. 2002. Vezi articolul : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Zhang P, Xu Y, Li L, Jiang Q, Wang M andJin L: Efecte protectoare in vitro ale chinonei de pirrolochinolină asupra neurotoxicității induse de metilmercur. Environ Toxicol Pharmacol.27:103-110. 2009. Vezi articolul : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Li LK, Rola AS, Kaid FA, Ali AM și AlabsiAM: Goniotalamina induce oprirea ciclului celular și apoptoza în carcinomul cu celule scuamoase orale H400human: O cale mediată de caspază dependentă de mitocondriale cu downregulation a NF-κβ. ArchOral Biol. 64:28-38. 2016. Vezi articolul : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Li Y, Hu J, Huang H și He Y: Efectul capsulei Jinlong asupra proliferării și apoptozei celulelor canceroase pancreatice umane BxPC-3. J Tradit Chin Med. 33:205-210. 2013.Vezi articolul : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Du RH, Cui JT, Wang T, Zhang AH și TanRX: Trichothecin induce apoptoza celulelor HepG2 prin activarea mediată de caspaza-9 a căii de moarte mitocondriale. Toxicon.59:143-150. 2012. Vezi articolul : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Kang MH și Reynolds CP: Inhibitori Bcl-2: direcționarea căilor apoptotice mitocondriale în terapia cancerului. ClinCancer Res. 15:1126-1132. 2009. Vezi articolul : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Jin Q, Nan JX și Lian LH: antitumoralitatea frunzelor din potentilla discolor pe linia celulară de carcinom hepatocelular uman HepG-2. Chin J Nat Med. 9:61-64. 2011.