Bioreactoare miniaturale: practici actuale și oportunități viitoare

Introducere

Avântul biologiei moleculare și al tehnologiei de manipulare genetică din ultimul sfert de secol a avut un efect dramatic asupra industriilor farmaceutice și de îngrijire a sănătății, o mare parte din numeroasele aplicații ale acestei tehnologii bazându-se pe capacitatea de a crea linii celulare recombinate pentru beneficiul terapeutic uman. În plus față de dezvoltarea acestor organisme modificate genetic, rămâne necesitatea de a îmbunătăți productivitatea tipului sălbatic, de a accelera screening-ul microbilor nou descoperiți și de a continua progresul sarcinilor conexe, cum ar fi îmbunătățirea mediului de creștere și optimizarea proceselor. În mod tradițional, dezvoltarea proceselor de cultivare celulară a necesitat examinarea unui număr mare de linii celulare în culturi de tip „shake flask” și, de aici, testarea ulterioară a candidaților de succes în bioreactoare de masă înainte de studii la scară pilot. Necesitatea de a efectua un număr mare de cultivări de dezvoltare a dus la avansarea și implementarea din ce în ce mai răspândită a sistemelor de bioreactoare la scară mică, care oferă o soluție miniaturizată și HT pentru dezvoltarea proceselor.

Principalele tipuri de celule utilizate pentru producerea de produse terapeutice sunt celulele bacteriene și cele de mamifere, fiecare dintre acestea posedând beneficii și limitări unice care influențează tipul de bioreactor utilizat pentru dezvoltarea proceselor. Celulele bacteriene sunt, în general, robuste și nu sunt sensibile la deteriorarea prin forfecare, ceea ce înseamnă că pot fi utilizate sisteme de rotoare radiale cu forfecare mare (de exemplu, turbine Rushton) și viteze de agitare ridicate. Acest lucru conferă acestor bioreactoare o capacitate mare de transfer de masă, permițând astfel susținerea culturilor de celule microbiene cu metabolizare rapidă și densitate celulară mare și creșterea cantității de produs pe care o pot obține astfel de bioprocese. Deși celulele de mamifere nu au un perete celular protector și, prin urmare, sunt de obicei mai sensibile la forfecare și necesită o manipulare mai blândă decât omologii lor bacterieni, majoritatea liniilor celulare utilizate în comerț pot fi cultivate în bioreactoare cu rezervor agitat, deși cu modificări de proiectare. De exemplu, în locul turbinelor Rushton se pot folosi rotoare axiale de tip marin, cu forfecare redusă, pentru a face să circule ușor celulele și nutrienții într-un mediu fără deflectoare, iar în mediile de cultură celulară se pot adăuga agenți de protecție împotriva forfecării, cum ar fi serul sau Pluronic F-68 .

În plus față de dezvoltarea medicamentelor terapeutice, MBR-urile pot fi utilizate pentru dezvoltarea mediilor de creștere; îmbunătățirea tulpinilor prin inginerie metabolică sau evoluție dirijată; și așa-numita bio prospectare a produselor naturale – toate acestea sunt procese care presupun o povară mare pentru bioreactoare, care poate fi atenuată prin utilizarea dispozitivelor miniaturale HT. În special, MBR-urile pot reduce intensitatea forței de muncă și costul materialelor pentru numărul mare de cultivări de celule necesare în dezvoltarea bioproceselor, crescând nivelul de paralelism și randamentul realizabil și, ca atare, prezintă un interes crescând. Este important ca astfel de dispozitive, atunci când sunt utilizate pentru dezvoltarea de procese, să poată fi folosite pentru a imita cu exactitate bioreactoarele la scară de laborator și la scară pilot, astfel încât cinetica de creștere și expresia produsului – optimizate la scară miniaturală – să poată crește cantitativ.

Chiar dacă sunt, fără îndoială, mai capabile să funcționeze la HT decât bioreactoarele convenționale, la scară de laborator, MBR-urile sunt, de obicei, în prezent, mai puțin instrumentate și au, de asemenea, posibilități limitate de prelevare de probe off-line din cauza volumelor mici utilizate (variind de la aproximativ 0,1 ml până la aproximativ 100 ml); acest lucru înseamnă că, în prezent, există un compromis între conținutul de informații în ceea ce privește calitatea și cantitatea de date disponibile din bioreactor, obținute atât prin măsurători online, cât și off-line, și debitul experimental, ilustrat în figura 1. Având în vedere că niciun dispozitiv nu a rezolvat încă toate provocările legate de miniaturizare, și anume imitarea cu precizie a condițiilor de proces la scară mare, păstrând în același timp întreaga funcționalitate a bioreactoarelor convenționale, intenția autorilor este de a trece în revistă evoluțiile actuale și apoi de a indica unde este posibil ca tehnologia să progreseze în viitor, astfel încât beneficiile actuale ale HT să poată fi extinse și să se reducă decalajul de informații care există în prezent între platformele de bioreactoare miniaturale și cele la scară de laborator. Această trecere în revistă a grupat diferitele MBR-uri descrise pe baza metodei de agitare (adică agitare, agitare sau gazare) cu referire la tipul de bioreactor convențional pe care îl imită sau din care sunt derivate; specificațiile și caracteristicile cheie ale dispozitivelor miniaturale de cultivare celulară prototipice și comercializate, capabile să funcționeze în paralel, sunt rezumate în tabelul 1.

Sisteme de bioreactoare miniaturale cu agitare

Sistemele cu agitare au fost utilizate în bioprocesare încă de la primele încercări de a crește culturi microbiene producătoare de antibiotice în anii 1940. Acestea sunt încă utilizate pe scară largă în industrie și în mediul academic ca instrument pentru descoperirea de medicamente; optimizarea mediilor, a tulpinilor și a produselor; și dezvoltarea proceselor . Acestea cuprind multe modele și volume diferite, de la flacoane de agitare de sute de mililitri până la plăci de microtitrare (MTP) cu un volum de câțiva microlitri.

Flacoane de agitare

În ultimii cincizeci de ani, oamenii de știință au folosit cultivarea celulelor în flacoane de agitare ca mijloc de dezvoltare a proceselor la scară mică, cu volume variind de la cca. 10 ml la 500 ml . Baloanele de agitare se prezintă într-o varietate de forme, pot fi fabricate din sticlă sau din plastic, iar unele au deflectoare pentru a facilita aerarea și amestecarea. Acestea pot fi agitate prin agitare orbitală sau liniară și pot fi adăpostite într-un dulap cu temperatură controlată. Printre factorii care influențează culturile în baloane de agitare se numără dimensiunea vasului, volumul de umplere, materialul de construcție, geometria deflectoarelor, frecvența de agitare și tipul de dop folosit pentru a sigila vasul. Büchs afirmă că s-a estimat că baloanele de agitare sunt utilizate pentru peste 90% din toate experimentele de cultură din industrie și din mediul academic, cultivând o gamă largă de microorganisme, de exemplu bacterii , ciuperci și drojdii, precum și celule de mamifere . Este ușor de înțeles de ce sunt atât de utilizate pe scară atât de largă: acestea reprezintă o modalitate ieftină și eficientă de a realiza în mod reproductibil multe tipuri de cultivări de celule relevante din punct de vedere industrial pentru dezvoltarea proceselor. În plus, ele sunt ușor de utilizat și sunt în mare măsură impermeabile la complicațiile mecanice. În cea mai mare parte a perioadei îndelungate de utilizare a acestora, tehnologia a suferit puține modificări semnificative, fără monitorizare online a culturilor și fără adăugări și prelevări manuale de probe. Doar recent au fost introduse baloane de agitare dotate cu instrumente, concepute pentru a măsura și, eventual, a controla online pH-ul și nivelurile de DOT. pH-ul și oxigenul dizolvat pot fi măsurate cu ajutorul unui colorant de oxid de ruteniu care devine fluorescent în mod cuantificabil în prezența ionilor de hidrogen, respectiv de oxigen, atunci când este excitat cu o lampă LED. Acest colorant poate fi fie încorporat într-un plasture și lipit în interiorul unui balon, fie poate fi aplicat pe vârful unei sonde legate prin fibră optică și scufundat în cultura de interes. Alți parametri care pot fi acum măsurați online includ rata de transfer de oxigen (OTR) și rata de evoluție a dioxidului de carbon (CER) – și din acestea se poate obține coeficientul respirator (RQ). Monitorizarea online a acestor parametri ar permite realizarea unor strategii mai sofisticate de cultivare a celulelor, cum ar fi alimentarea cu substraturi pe baza modificărilor pH-ului bulionului de cultură datorate metabolismului celular . Mai mult, Akgün et al. au dezvoltat recent un nou sistem de baloane cu agitare care este capabil să funcționeze în regim continuu și, prin urmare, mărește domeniul de aplicare al dezvoltării bioproceselor paralele folosind sisteme agitate.

Cu toate acestea, o limitare majoră a baloanelor cu agitare este dependența lor de aerisirea de suprafață, ceea ce duce la un transfer redus de oxigen în raport cu reactoarele cu rezervor agitat (STR). Wittmann și colab. au raportat valori globale ale coeficientului volumetric de transfer de masă (kLa) de până la 150 h-1 în baloane agitate. Valori kLa de 151 h-1 (600 ml, 200 rpm) până la 277 h-1 (100 ml, 200 rpm) au fost înregistrate într-un nou sistem de baloane agitate, în formă de cutie, dezvoltat de Kato și Tanaka , care sunt suficient de ridicate pentru a realiza majoritatea culturilor celulare discontinue fără a inhiba creșterea microbiană. Acești cercetători au încorporat membrane permeabile la gaz în colțurile superioare ale prototipurilor lor de baloane, ceea ce a permis un flux de gaz mai eficient în recipient în timpul agitării, depășind problema întâlnită în baloanele de agitare convenționale de a introduce mai mult aer în sistem într-un mod steril. În scopul culturilor în care cererea de oxigen este mare, introducerea deflectoarelor poate crește OTR la frecvențe de agitare mai mici ; cu toate acestea, vitezele mari pot duce la stropirea excesivă care poate provoca blocarea dopului permeabil la gaz (adesea realizat din vată de bumbac) din partea superioară a balonului prin saturarea lichidului. S-a demonstrat că o astfel de obstrucție reduce drastic capacitatea de transfer de oxigen a sistemului, ceea ce ar putea cauza probleme în cazul în care se cultivă un aerob cu respirație rapidă . Lipsa de oxigen ar putea încetini ritmul de creștere, ar putea modifica ratele de formare a producției și/sau ar putea genera subproduse toxice nedorite, de exemplu, formarea de acetat de către Escherichia coli .

Placi de microtitrare

MTP-urile (numite și plăci cu micropoțuri) au fost introduse pentru prima dată în 1951 ca platformă pentru teste de diagnosticare și sunt încă utilizate pe scară largă în științele vieții . Acestea gestionează teste de diagnosticare, cum ar fi testele imunoenzimatice care profită de capacitatea de a efectua multe reacții identice în paralel și la o scară foarte mică. Acest avantaj este cel care a dus la utilizarea MTP-urilor ca bioreactoare agitate în miniatură în etapa de screening a dezvoltării proceselor pentru evaluarea liniilor celulare . Plăcile sunt de obicei confecționate din plastic, deși există versiuni din sticlă și metal. Amestecul poate fi realizat prin aspirarea cu pipeta sau cu ajutorul unor bare de agitare cu agitare magnetică; cu toate acestea, agitarea orbitală a întregii plăci pe un bloc încălzit capabil să controleze temperatura culturii este de departe cea mai frecventă metodă. Numărul de godeuri conținute în MTP este, de obicei, de 6, 12, 24, 96 și 384, cu până la 1536 și 3456 godeuri disponibile în prezent pentru screening-ul de foarte mare capacitate (UHTS) . Puțurile pot fi dreptunghiulare sau cilindrice, geometria pătrată favorizând amestecul și transferul de oxigen prin imitarea acțiunii deflectoarelor. Plăcile cu fundul pătrat acționează în mod similar, limitând vârtejul lichidului în interiorul puțului și crescând astfel turbulența sistemului. Datorită creșterii suprafeței cauzate de o mai mare disipare a fluidului pe părțile laterale ale fiecărei microcuve și a creșterii forței de antrenare a oxigenului cauzată de o mai bună amestecare, OTR este proporțională cu amplitudinea și frecvența de agitare, prin urmare, creșterea acestor parametri poate fi benefică. În plus, Hermann și colab. au raportat că OTR este invers proporțional cu volumul de umplere, în special la frecvențe de agitare mai mari . Cu toate acestea, există un punct dincolo de care orice creștere a agitației duce la deversarea lichidului de proces (cu excepția cazului în care puțul este acoperit – ceea ce are propriile probleme, cu un transfer redus de oxigen în puț). Ca și în cazul baloanelor de agitare, capacitatea relativ scăzută de transfer de oxigen a MTP-urilor (valori kLa de până la 200 h-1 în plăcile cu 96 de godeuri) provine din faptul că acestea sunt sisteme agitate și se bazează pe aerarea de suprafață pentru transferul de masă. În schimb, Kensey et al. au raportat valori kLa folosind metoda de oxidare cu sulfit de până la 1600 h-1 într-un MTP cu 48 de godeuri, cu geometrie standard, cu o aruncare orbitală de 3 mm la 1400 rpm, folosind un volum de umplere de 300 μl, ceea ce este comparabil cu STR-urile convenționale. Utilizând o constantă de proporționalitate calculată, această echipă a reușit să raporteze capacitatea de transfer de oxigen obținută prin metoda chimică la mediile biologice.

Există, de asemenea, metode disponibile pentru determinarea kLa la scară mică, care furnizează date direct comparabile cu valorile obținute în condiții de proces. De exemplu, Duetz et al. și Doig et al. au estimat kLa prin bilanț masic în condiții de limitare a oxigenului din creșterea liniară a lui Pseudomonas putida într-un MTP și, respectiv, a lui Bacillus subtilis într-un prototip de reactor cu coloană cu bule în miniatură (MBCR). În plus, metoda de gazare dinamică este adesea preferabilă metodei de oxidare cu sulfit pentru determinarea valorilor kLa, deoarece se realizează de obicei în apă . În consecință, acest sistem este coalescent și, deși nu este identic cu mediile biologice, este mai reprezentativ pentru condițiile de cultivare a celulelor decât condițiile total necoalescente ale metodei cu sulfit de sodiu. Cu toate acestea, această tehnică este dificil de utilizat în MTP, deoarece agitarea trebuie adesea oprită înainte de măsurarea DOT pentru a obține citiri precise, modificând astfel mediul de transfer de masă într-un moment critic. Din cauza problemelor asociate cu utilizarea metodelor consacrate de determinare a kLa în MTP, am dezvoltat recent o metodă nouă care se bazează pe biooxidarea catecolului de către enzima catecol-2,3-dioxigenază . Această metodă a dat valori similare ale kLa în comparație cu metoda de gazare dinamică și, deoarece este rapidă și nu necesită presupuneri privind cinetica, credem că această metodă este potrivită pentru evaluarea kLa în MTP-uri și alte dispozitive la scară mică.

MTP-urile suferă, de asemenea, într-o anumită măsură din cauza aceleiași caracteristici care le face atractive ca dispozitiv cu randament ridicat – volumele mici – deoarece evaporarea poate elimina o proporție semnificativă a fluidului din puț . Membrane respirabile pot fi plasate deasupra plăcilor pentru a limita această evaporare, însă atunci capacitățile de transfer de oxigen sunt reduse. Zimmermann et al. au raportat o membrană care a atins un grad moderat de retenție a apei și de transfer de oxigen; cu toate acestea, valorile kLa au fost reduse de cinci ori, ceea ce agravează și mai mult problema capacității scăzute de transfer de oxigen inerente sistemelor agitate. Deși evaporarea este o problemă potențială în toate MBR-urile, MTP-urile par a fi mai susceptibile la aceasta din cauza faptului că utilizează, de obicei, cele mai mici volume de proces. MTP-urile de 3456 de godeuri oferă cel mai mare randament dintre toate dispozitivele miniaturale de cultivare a celulelor disponibile și s-a demonstrat cantitativ că pot susține creșterea celulelor de ovar de hamster chinezesc (CHO), deși un volum de proces atât de minuscul (1 – 2,2 μl) înseamnă că acest dispozitiv nu ar putea, probabil, să imite mecanismele prin care funcționează vasele agitate mai mari; de exemplu, efectele de tensiune superficială s-ar extinde pe tot parcursul godeului, limitând grav capacitatea de amestecare. În plus, nu ar fi posibilă nici o îndepărtare a mediului pentru prelevarea de probe off-line.

Deși MTP-urile sunt utilizate pe scară largă în cercetarea de descoperire, acestea au suferit de o lipsă de instrumentație în mod similar cu baloanele de agitare, limitând gama de date care pot fi colectate. Cu toate acestea, recent au fost dezvoltate tehnici pentru a măsura pH-ul și DOT în astfel de sisteme . De exemplu, Lye și colegii săi au studiat efectul controlului pH-ului asupra producției de biomasă și a cineticii de creștere a unei bacterii filamentoase într-un MTP . În ciuda unora dintre limitările inerente ale MTP-urilor atunci când se efectuează cultivări de celule, s-au făcut progrese în caracterizarea amestecului, a transferului de masă și a instrumentației acestor recipiente, ceea ce înseamnă că avantajele unice ale acestor dispozitive în ceea ce privește potențialul de automatizare și capacitatea intrinsecă de HT conduc la utilizarea lor din ce în ce mai frecventă ca MBR-uri în stadii incipiente.

Tuburi cu rotiță

Dezvoltarea proceselor de cultivare a celulelor de mamifere la scară mică în stadii incipiente s-a realizat în mod tradițional în flacoane T și în bioreactoare la scară mică (adesea flacoane cu rotiță, de obicei cu un volum de 500 ml) . Deși inițial erau dispozitive în mare parte nedefinite, s-au efectuat lucrări de caracterizare a mediului ingineresc în flacoanele de tip spinner, ceea ce le-a făcut mai ușor de utilizat ca recipiente de reducere a dimensiunii. Cu toate acestea, rămâne faptul că volumul relativ mare al acestora le face neviabile ca tehnologie HT, ceea ce înseamnă că există o nevoie reală de bioreactoare miniaturale care să fie utilizate împreună cu celule de mamifere pentru cultivarea în paralel a celulelor. Recent, tuburile de centrifugare au fost dezvoltate și utilizate ca un instrument de dezvoltare a proceselor la scară mică pentru cultivarea celulelor de mamifere. Tuburile de centrifugare descrise pentru prima dată de De Jesus et al. par să ofere mai multe avantaje față de baloanele de centrifugare, cum ar fi volumul mai mic al procesului. De atunci, acestea au fost comercializate de ExcellGene SA (Valais, Elveția) sub denumirea TubeSpin Satellites. Aceste vase de cultură constau din tuburi de centrifugare modificate de 50 ml montate pe un agitator orbital rotativ plasat într-un incubator. Volumele de cultură sunt cuprinse între 5 ml și 35 ml per reactor, iar analiza off-line se efectuează folosind tuburi întregi pe bază de sacrificiu. Acest sistem nu dispune de instrumentarul necesar pentru a efectua culturi de celule de mamifere complet caracterizate; cu toate acestea, este un instrument util pentru optimizarea mediilor și creșterea productivității și conferă dezvoltării culturilor celulare un aspect de mare randament, dezvoltatorii acestui sistem declarând capacitatea de a procesa 1 000 de culturi diferite pe săptămână. Volumul relativ mare și ratele scăzute de evaporare întâlnite în acest dispozitiv sunt atuuri atunci când se lucrează cu celule de mamifere cu creștere lentă, unde culturile pot dura mai multe zile, însă trebuie subliniat faptul că în acest sistem nu a fost efectuată nicio caracterizare tehnică a amestecului și a transferului de masă și, prin urmare, tuburile de centrifugare sunt utilizate în mare parte pentru aplicații de screening.

Sisteme de bioreactoare agitate miniaturale

Bioreactoare agitate miniaturale (MSBR) bazate pe STR convenționale au fost dezvoltate ca o alternativă la sistemele MBR agitate pentru dezvoltarea proceselor în stadii incipiente și caracterizarea celulelor. În mod obișnuit, aceste dispozitive sunt modelate îndeaproape pe bioreactoare la scară de laborator și, prin urmare, permit un potențial mai mare de monitorizare și control decât alte platforme de bioreactoare miniaturale. Acestea au, de obicei, un volum de proces intermediar între MTP și flacoanele cu agitare, iar materialele de construcție variază foarte mult, fiind utilizate Perspex, Pyrex, polimetilmetacrilat (PMMA) și oțel inoxidabil. Figura 2 ilustrează prototipul nostru MSBR cu un volum de lucru de 18 ml, construit din oțel inoxidabil și Pyrex și echipat cu sonde optice pentru măsurarea online a pH-ului și a DOT-ului. Acest recipient a fost caracterizat din punct de vedere al eficienței de amestecare și al capacității de transfer de oxigen. S-a demonstrat că este capabil să imite STR convenționale în culturile de celule cu reologie, sensibilitate la forfecare și cerere de oxigen variabile (de exemplu, bacteria filamentoasă Saccharopolyspora erythraea care produce eritromicină și E. coli recombinant care produce ADN plasmidic și, respectiv, fragment de anticorp). Dispozitivul ar putea crește cu succes o serie de organisme datorită valorilor kLa relativ ridicate (480 h-1 la 7000 rpm utilizând metoda dinamică de gazare) și a timpilor de amestecare scurți (4,8 s la 7000 rpm – de peste două ori mai rapid decât un vas de 7 L, pe baza unei puteri specifice egale). Ratele ridicate de transfer de oxigen au sprijinit creșterea organismelor care respiră rapid (E. coli), în timp ce amestecarea eficientă a permis vasului să mențină condiții omogene atunci când se tratează bulionii de fermentare vâscoși – întâlniți adesea la creșterea organismelor filamentoase. Rata de agitare a putut fi, de asemenea, controlată foarte strict, ceea ce a ajutat la prevenirea deteriorării organismelor miceliene sensibile la forfecare prin aportul excesiv de energie. În plus, consumul de energie gazoasă al vasului a fost măsurat, ceea ce a dus la calcularea numărului de putere al rotorului pe o gamă largă de condiții de funcționare și, prin urmare, a permis ca culturile de celule să fie redimensionate în mod fiabil pe baza unei intrări de putere specifice egale . Deși acest MSBR este un prototip, ar fi posibilă multiplexarea unui astfel de dispozitiv pentru a obține un randament mai mare.

Prin asigurarea agitației și aerisirea activă a vasului, au fost raportate în literatura de specialitate rate de transfer de masă apropiate de un STR convențional, la scară de laborator, pentru alte MSBR-uri. De exemplu, Lamping et al. au raportat valori kLa de 360 h-1 la 1 VVM și 3000 rpm folosind metoda dinamică de evacuare a gazelor într-un prototip MSBR similar ca design cu cel prezentat în figura 2. În plus, aceeași echipă a modelat cu succes transferul de oxigen într-un prototip de bioreactor miniatural utilizând o analiză de dinamică computațională a fluidelor (CFD), care s-a bazat pe parametrii ingineresti relevanți ai câmpului de viteză, dimensiunea bulelor, reținerea gazului și ratele de disipare a energiei în interiorul MBR.

Puskeiler et al. au raportat recent valori kLa de peste 700 h-1 (volum de 12 ml) și de până la 1600 h-1 (volum de 8 ml) pentru un MSBR agitat la 2300 rpm. Acest sistem utilizează un rotor nou de inducție a gazului care are ca rezultat o capacitate foarte mare de transfer de oxigen. În acest studiu, s-a utilizat metoda dinamică de evacuare a gazelor pentru a măsura kLa, deși s-au folosit condiții de necoalescență, ceea ce face dificilă comparația directă cu valorile obținute din medii de cultivare a celulelor sau fluide coalescente. În aceeași lucrare a fost descrisă capacitatea sistemului de a susține culturile de celule pe loturi hrănite, ceea ce ilustrează potențialul tehnologiilor de bioreactoare miniaturale de a sprijini astfel de strategii importante din punct de vedere industrial. În plus, a fost demonstrată fezabilitatea pentru monitorizarea și controlul online. Dispozitivul descris în raportul respectiv, proiectat în asociere cu H+P Labortechnik AG (Oberschleissheim, Germania), este o unitate integrată („bloc de bioreactor”) capabilă să susțină până la 48 de culturi celulare simultan. Un sistem integrat de manipulare a lichidelor a permis măsurarea în linie a pH-ului cu o frecvență de o oră prin distribuirea de eșantioane de 20 μl în MTP-uri disponibile în comerț care conțin patch-uri de pH fixate. Opt minute mai târziu, același sistem de prelevare a lichidelor a ajustat apoi pH-ul folosind NaOH 4 M. În timp ce utilizarea manipulării automate a lichidelor pentru a controla pH-ul este o soluție bună, autorii au recunoscut că acest lucru poate fi nepractic dacă este utilizat cu organisme sensibile care necesită o ajustare mai rapidă a pH-ului. Cu toate acestea, raportul precizează că un sistem de monitorizare îmbunătățit este în curs de dezvoltare împreună cu parteneri industriali pentru a asigura o monitorizare mai frecventă, ceea ce ar putea crește numărul de fermentații simultane care pot fi monitorizate în mod eficient. DOT a fost măsurat în sistem cu ajutorul unui bloc de senzori prototip cu sonde optice, deși doar 8 reactoare din cele 48 de vase de cultivare au fost monitorizate simultan . Un astfel de dispozitiv poate fi, de asemenea, integrat cu echipamente robotizate standard pentru a efectua sarcini de manipulare a lichidelor, cum ar fi inocularea, alimentarea și prelevarea de probe .

Utilizând o abordare diferită, Fluorometrix Corporation (Stow, Massachusetts, SUA) a dezvoltat o construcție MSBR cu vase multiple numită Cellstation®. Acest MBR utilizează tehnologia optică pentru a permite monitorizarea on-line in situ a până la 12 cultivări paralele pentru pH , DOT și densitate optică (OD), iar agitația este asigurată de rotoare duble de tip palete. Fiecare recipient are un volum de lucru de până la 35 ml și este atașat la un carusel care se rotește, permițând ca toate recipientele să fie prelevate și monitorizate secvențial. Sistemul de senzori optici a fost validat prin demonstrarea consistenței senzorilor de pH și DO pe o perioadă de 70 de ore într-un proces de cultivare a celulelor de mamifere. În plus, grupul de cercetare al lui Rao de la Universitatea din Maryland, care are legături strânse cu compania, a publicat recent detalii despre două prototipuri de sisteme MSBR cu 24 de puțuri care îmbunătățesc și mai mult randamentul acestei tehnologii .

În paralel cu aceste dezvoltări MSBR, Dasgip AG (Jülich, Germania) a introdus Stirrer-Pro Flask, parte a seriei lor de cultivare celulară Fedbatch-Pro®, care cuprinde până la 16 vase de cultură (volum de lucru de 200-275 ml) și oferă o capacitate de transfer de oxigen acționată prin agitare și o capacitate de alimentare pe loturi. pH-ul și DOT-ul pot fi monitorizate cu ajutorul unor sonde standard sterilizabile și controlate independent pentru fiecare vas prin adaosuri automate de lichid acid/bază și, respectiv, variația debitului de aer/agitație. Adăugarea de substrat poate fi legată fie de punctele de declanșare DOT, fie de pH, permițând o capacitate de alimentare pe loturi complet automatizată. Combinația dintre agitația mecanică (între 10 și 1 000 rpm) și pulverizarea gazului indică faptul că acest sistem este capabil să susțină culturi bacteriene cu creștere rapidă până la o densitate celulară ridicată și, prin urmare, ar fi util în dezvoltarea unor astfel de bioprocese. Cu toate acestea, volumul de lucru utilizat este relativ mare în comparație cu majoritatea celorlalte sisteme discutate, iar configurarea este complicată de prezența unui număr mare de tuburi și cabluri pentru adaosuri și măsurători. O variantă a acestui sistem care conține până la 16 flacoane de agitare echipate cu sonde de pH a fost, de asemenea, dezvoltată, permițând alimentarea intermitentă și controlul paralel al pH-ului.

Ca o alternativă mai mică la sistemele STR la scară de laborator capabile să funcționeze în paralel, cum ar fi sistemul Sixfors® dezvoltat de Infors AG (Bottmingen, Elveția), cercetătorii de la University College London, în asociere cu BioXploreactor BioXplore Group’s Bioreactor business al HEL Group (Barnet, Regatul Unit) au dezvoltat și caracterizat un sistem MBR cu 4 – 16 camere cu control complet integrat și automatizat al DOT și pH-ului. Deși fiecare vas are un volum maxim de lucru de 100 ml, situându-se astfel la capătul superior al tehnologiei MSBR, dezvoltarea unui software autonom pentru monitorizarea unor astfel de bioreactoare reprezintă un pas înainte spre înzestrarea MBR cu același grad de control și automatizare care există în cazul bioreactoarelor convenționale.

Reactoare miniaturale cu coloane cu bule

Coleinele cu bule utilizează pulverizarea gazului în loc de agitare ca mijloc de promovare a amestecului și a transferului de masă de oxigen pentru cultivarea celulelor. Ca o alternativă la dispozitivele agitate sau scuturate, am dezvoltat un reactor miniatural cu coloană cu bule (MBCR) care se bazează pe un MTP cu membrane poroase (frituri) care acționează ca întreaga bază pentru fiecare puț individual . Aerul pătrunde prin fritele și curge în sus prin fiecare puț, furnizând oxigen pentru fiecare cultură în creștere. Cu condiția ca fiecare frită să fie fabricată conform unor specificații înalte și să aibă un grad identic de porozitate, debitul către fiecare coloană este egal și poate fi calculat. Astfel, se evită ca variația debitului de aer să afecteze în mod artificial rezultatele.

Doig et al. detaliază construcția și caracterizarea unui prototip de MBCR cu 12 puțuri care este capabil să susțină cultivarea aerobă a culturilor de Bacillus subtilis, fiecare coloană având un volum de lucru de 2 ml. Au fost raportate valori de kLa de până la 220 h-1 folosind metoda dinamică de gazare la o viteză superficială a gazului de 0,02 ms-1. Unul dintre avantajele acestui tip de dispozitiv este că, spre deosebire de un MTP, aerarea se face prin pulverizare directă. Acest lucru are ca efect creșterea capacității de transfer de masă de oxigen a sistemului în comparație cu un MTP, deoarece pulverizarea crește suprafața disponibilă pentru transferul de masă gaz-lichid în comparație cu aerarea superficială. Deși unele date kLa pentru MTP detaliate în această analiză sunt substanțial mai mari decât valorile MBCR măsurate, trebuie subliniat faptul că multe dintre valorile MTP au fost obținute în condiții mai degrabă artificiale, concepute pentru a maximiza transferul de oxigen, în timp ce valorile kLa pentru MBCR prezentate mai sus ar putea fi reproduse în condiții de cultivare a celulelor.

În plus față de suprafața mare disponibilă pentru transferul de oxigen, lipsa agitației în MBCR-uri înseamnă că aportul de energie și, prin urmare, transferul de oxigen este mai ușor de modelat decât în STR-uri, deoarece există mai puțini parametri de luat în considerare, viteza superficială a gazului și distribuția dimensiunilor bulelor fiind parametrii cheie în extinderea/reducerea coloanelor cu bule . În plus, dispozitivul este staționar, spre deosebire de agitație, ceea ce permite o instrumentare mai ușoară, deoarece agitația majorității sistemelor MTP trebuie oprită înainte de a se putea efectua măsurători într-un cititor de plăci. Simplitatea mecanică, împreună cu transferul potențial ridicat de oxigen și ușurința de prelevare a probelor fac ca MBCR-urile să fie potrivite pentru cultivarea celulelor în paralel. Aceasta ar putea avea ca scop, printre altele, îmbunătățirea mediului sau a tulpinii și dezvoltarea de procese în stadii incipiente. De asemenea, MBCR-urile ar putea fi utilizate pentru a imita și a prezice performanța reactoarelor la scară largă. În acest sens, am demonstrat recent o bună corelație a ratei de transfer de oxigen cu consumul de energie volumetrică (P/V) pentru coloanele cu bule miniaturale (2 ml) și de laborator (100 ml), utilizând difuzoare de gaz cu aceeași dimensiune a porilor, care permite predicția kLa în funcție de P/V . În aceeași lucrare am arătat, de asemenea, o performanță comparabilă de cultivare a celulelor utilizând MBCR în raport cu un STR la scară de laborator bazat pe valori kLa egale. Aceste rezultate indică potențialul MBCR ca dispozitiv la scară redusă. Acest prototip de dispozitiv MBCR nu a fost instrumentat, deși, în lucrări ulterioare, am echipat acest dispozitiv cu patch-uri de fluorescență optică și l-am utilizat pentru a măsura DOT în timpul cultivării celulelor. Temperatura a putut fi controlată prin conectarea dispozitivului la o baie de apă și prin circulația apei cu temperatură controlată prin spațiul închis dintre coloane (a se vedea figura 3). MBCR-uri similare au fost dezvoltate anterior de alții ; cu toate acestea, aceste recipiente utilizează volume de aproximativ 200 ml și, prin urmare, sunt cu două ordine de mărime mai mari decât dispozitivul descris de Doig et al. , limitând gradul de funcționare paralelă realizabil.

Alte dispozitive miniaturale

Utilizând conceptul de placă cu senzori integrați, MicroReactor Technologies (Mountain View, CA, SUA) a dezvoltat un sistem hibrid de cultivare a celulelor bazat pe un MTP cu 24 de godeuri, agitat și deflectat, cu o configurație a godeurilor care permite transferul uniform de căldură în întreaga placă. Volumul de lucru sugerat pentru fiecare fântână variază între 3 și 5 ml, iar aerul este introdus în faza lichidă prin pulverizare prin sinterele situate la baza fiecărei fântâni, ceea ce sporește capacitatea de transfer de oxigen în comparație cu sistemele agitate de concepție similară. Acest dispozitiv de cultivare recent comercializat (licențiat în Europa de Applikon Biotechnology AB, Țările de Jos) este instrumentat cu ajutorul unor sonde de fibră optică pentru a monitoriza online DOT și pH-ul în toate godeurile simultan. Dispozitivul permite, de asemenea, controlul independent al temperaturii, al DOT, al pH-ului (prin pulverizare de gaz) și al debitului de aer pentru toate cele 24 de godeuri. Dispozitivul depășește una dintre problemele fundamentale în cazul dispozitivelor HT bazate pe MTP – și anume cum să se monteze instrumentația pe toate godeurile conținute în placă – prin atașarea tuturor patch-urilor de senzori la baza fiecărui gode și apoi prin plasarea întregii plăci pe o platformă de incubator cu agitare care dispune de circuite de instrumentație integrate, permițând astfel ca fiecare gode să fie monitorizat independent. Aplicația principală este probabil să fie pentru etapele timpurii ale dezvoltării procesului (de exemplu, selectarea tulpinilor și optimizarea mediului). Nu există încă date disponibile în mod public privind caracterizarea inginerească a amestecului și a transferului de oxigen și compararea performanțelor de cultivare cu datele din bioreactoare la scară de laborator.

Au existat dezvoltări recente care vizează reducerea scalei MBR-urilor la volume de proces sub mililitru. Deși aceste sisteme miniaturale oferă cele mai mari posibilități de aplicare a HT, există o limită practică la cât de mici pot deveni volumele de cultură. Dispozitivele care utilizează un volum de proces prea mic pot considera că nu este fezabil să efectueze culturi cu o monitorizare și o eșantionare suficiente. Deși OD, DOT și pH-ul pot fi monitorizate online, alți parametri critici, cum ar fi concentrația de substrat și randamentul produsului, adesea nu sunt monitorizați; cu toate acestea, ar putea fi posibil să se ocolească această problemă pentru anumite procese prin încorporarea de markeri, cum ar fi proteina verde fluorescentă în produs . Evaporarea poate deveni o problemă semnificativă în astfel de volume de cultură extrem de mici dacă se lucrează cu procese lungi de cultivare a bacteriilor și a celulelor de mamifere; de asemenea, având în vedere volumul extrem de mic al procesului, ar fi dificil din punct de vedere tehnic să se controleze cu precizie pH-ul prin adăugarea de lichid. Cu toate acestea, scara de funcționare reprezintă un progres radical în proiectarea MBR-urilor și sporește semnificativ potențialul de utilizare a acestora pentru cultivarea în paralel a celulelor HT.

În acest sens, grupul de cercetare al lui Jensen de la MIT a dezvoltat un prototip MBR sub-mililitru care a fost modificat și extins la un sistem multiplexat capabil să efectueze opt cultivări de micro-celule instrumentate cu volume de lucru de 150 μl . Utilizând metode standard de microfabricare, puțurile de cultivare realizate din PMMA și poli(dimetilsiloxan) (PDMS) sunt imobilizate pe o bază de aluminiu care conține toate elementele senzoriale, iar transferul de oxigen este permis prin difuzie printr-o membrană permeabilă la gaze și agitatoare magnetice capabile să controleze agitația în mod individual pentru fiecare reactor în parte, respectiv pentru fiecare reactor. DOT, pH-ul și OD pot fi monitorizate online cu ajutorul sondelor optice. Grupul a raportat că dispozitivul poate susține cultivări discontinue de E. coli, însă DOT a scăzut la 0% după 2-3 ore, posibil ca urmare a limitării oxigenului . Acest lucru este probabil, având în vedere că valoarea maximă a kLa măsurată în acest MBR a fost de numai 75 h-1. Cu toate acestea, autorii au demonstrat că comportamentul de creștere a fost comparabil cu cel obținut folosind o serie de dispozitive mai mari de cultivare a celulelor . Același grup de cercetare a detaliat, de asemenea, analiza expresiei genice prin microarray ADN a E. coli cultivate într-un MBR de 50 μl . Această lucrare marchează un progres real în dezvoltarea MBR, deoarece nu numai că demonstrează o dovadă de principiu, dar permite, de asemenea, o analiză extrem de paralelă a expresiei genice și ar putea fi utilizată pentru a îmbunătăți înțelegerea fiziologiei celulare în timpul cultivării folosind o abordare la nivel de sistem . Maharbiz et al. au raportat dezvoltarea unui dispozitiv bazat pe o matrice care combină reactoarele de micropoțuri cu tehnologia de microfabricare a siliciului, care este capabil să susțină cultivarea E. coli în opt puțuri de 250 μl simultan. Similar reactorului MIT (descris mai sus), puțurile au fost situate pe o placă de bază care conținea senzori pentru măsurători de pH și OD (DOT nu a fost măsurat, dar autorii afirmă că acest lucru ar fi fezabil). Oxigenul a fost generat electrochimic în fiecare cultură, iar agitația a fost asigurată de o perlă din oțel inoxidabil care a amestecat cultura, dispersând oxigenul și rupând spuma de suprafață. Cu toate acestea, această echipă de cercetare nu a furnizat date comparative la scară de banc cu care să se poată determina dacă ar fi fezabilă extinderea la scară mai mare a unui astfel de dispozitiv.

Un alt sistem comercial pentru funcționarea HT a fost dezvoltat de Bioprocessors Corp. (Woburn, MA, SUA). Acest dispozitiv de cultivare a celulelor (numit SimCell®) este capabil să opereze și să controleze independent până la 1500 de culturi, permițând astfel utilizarea metodelor de proiectare experimentală factorială completă pentru optimizarea procesului . Acest dispozitiv de tip „reactor pe un cip” se bazează pe un design microfluidic cu o membrană permeabilă la gaze care permite transferul de oxigen, iar amestecul este asigurat prin rotirea cipurilor de matrice de micro-bioreactoare în incubatoare cu mediu controlat, folosind aer umidificat pentru a minimiza evaporarea. Acest sistem poate fi foarte bine automatizat și este integrat cu un robot pentru transferul plăcilor de la un incubator la o stație de detecție pentru măsurarea pH-ului, a DOT-ului și a densității celulare, precum și cu o stație fluidică în care se pot face adăugiri de mediu pentru funcționarea pe loturi alimentate și de acid/bază pentru controlul pH-ului. Volumele din fiecare reactor variază de la cca. 300 μl la cca. 700 μl, în funcție de aplicație (celule microbiene sau de mamifere) și fiecare reactor poate fi operat în regim discontinuu, de alimentare discontinuă sau de perfuzie. S-a demonstrat că dispozitivul este compatibil cu culturile de E. coli și de drojdie, oferind cinetici de creștere comparabile cu cele obținute cu ajutorul STR convenționale. Compania a descris, de asemenea, creșterea celulelor CHO fără limitare de oxigen la o densitate celulară ridicată și a utilizat simulări de dinamică computațională a fluidelor (CFD) pentru a arăta modul în care a fost recreat mediul fizic observat în bioreactoarele cu palete de mari dimensiuni. kLa în sistem a fost modelat prin CFD și estimat între 60 și 500 h-1, valori similare cu cele găsite în flacoanele de agitare și în STR-urile suboptime .

MBRs ca instrument de reducere a scalei

Ar trebui remarcat faptul că nu toate sistemele miniaturale de cultivare a celulelor sunt concepute pentru creșterea/scăderea scalei bioproceselor existente; s-a menționat în această analiză modul în care astfel de dispozitive pot fi utilizate pentru multe aplicații, cum ar fi evaluarea organismelor recombinate/ de tip sălbatic în stadii incipiente, îmbunătățirea tulpinilor și dezvoltarea mediului de creștere. Cu toate acestea, sistemele miniaturale utilizate în etapele ulterioare de dezvoltare a procesului, de exemplu, pentru optimizarea funcționării și a condițiilor de cultură, ar trebui să fie scalabile. Din acest motiv, este esențial să se exploreze metodele bine stabilite, bazate pe „reguli empirice”, utilizate în mod frecvent în industrie pentru a trece de la procesele de pe bancă la vasele de producție, pentru a vedea dacă acestea pot fi utilizate pentru a crește la scară din MBR. Aceste metode dovedite includ scalarea pe baza puterii de gazare pe unitate de volum; viteza vârfului agitatorului; DOT constant; capacitatea de transfer de masă a oxigenului (kLa); sau timpul de amestecare. Cu toate acestea, nu există o abordare unică pentru toate și, prin urmare, trebuie subliniat faptul că nu există o singură bază de echivalență care să poată fi aplicată în mod universal la toate MBR-urile. Niciunul dintre sistemele detaliate în această analiză nu ar putea utiliza toate metodologiile stabilite de extindere/reducere la scară descrise mai sus. De exemplu, o valoare constantă a DOT este dificil de obținut în sistemele agitate în comparație cu sistemele STR convenționale, deoarece lipsa agitației mecanice (și a spargerii – în cazul sistemelor bazate pe MTP) înseamnă că, din punct de vedere tehnic, controlul nivelurilor de DOT peste un nivel critic în aceste dispozitive este foarte dificil. Această particularitate nu reprezintă în sine o problemă atâta timp cât celulele cultivate au o creștere suficient de lentă (fie în mod natural, fie prin utilizarea unui mediu de creștere slab și/sau operarea la o temperatură care nu favorizează o rată de creștere maximă), dar limitează utilizarea unor astfel de sisteme pentru realizarea multor procese cu densitate celulară ridicată care implică microorganisme cu creștere rapidă și cerere mare de oxigen.

O indicație cu privire la criteriul de reducere a dimensiunii care ar trebui utilizat pentru un anumit bioproces (și, prin urmare, o indicație cu privire la platforma de miniaturizare care este preferabilă pentru acel proces) poate fi obținută prin examinarea caracteristicilor celulare și a condițiilor de proces ale bioprocesului în cauză. Pentru un organism cu creștere rapidă, cum ar fi E. coli sau Bacillus subtilis, transferul de oxigen devine, de obicei, limitativ, în timp ce stresul de forfecare nu este probabil să fie o problemă majoră; prin urmare, reducerea dimensiunii unei astfel de culturi celulare ar putea fi proiectată pe baza unei intrări de putere specifică egale sau pe baza unui kLa egal. Cu toate acestea, o cerință a alegerii unui kLa egal este posibilitatea de a estima cu exactitate puterea de intrare în bioreactorul miniatural. Lucrările efectuate la UCL într-un MBR de 10 ml confirmă lucrările anterioare ale lui Bujalski et al. care au arătat că numărul de putere al rotorului scade concomitent cu diametrul vasului. Prin urmare, este important să nu se utilizeze numerele de putere ale rotoarelor la scară convențională pentru estimarea aportului de putere în MBR-uri, deoarece acest lucru ar putea duce la limitarea oxigenului microbilor cu respirație rapidă prin supraestimarea puterii transferate sistemului.

O provocare deosebită este creșterea organismelor filamentoase din cauza morfologiei complexe a acestora. Bulionii de fermentație care conțin astfel de organisme au o vâscozitate relativ mare și necesită un aport suplimentar de energie pentru a menține o amestecare și un transfer de masă adecvate. În plus, organismele filamentoase sunt mult mai mari decât bacteriile unicelulare și pot fi mai sensibile la deteriorarea prin forfecare. De exemplu, Heydarian et al. au raportat că lungimea medie a hifelor bacteriei Saccharopolyspora erythraea, producătoare de eritromicină, a depășit microscala Kolmogorov de turbulență într-un bioreactor standard de 7 L într-o gamă largă de condiții de funcționare. În cazul S. erythraea s-a demonstrat că, în cazul în care miceliile sunt excesiv de forfecate, rezultând o lungime prea scurtă a hifelor, atunci formarea produsului eritromicină poate fi afectată . Din acest motiv, ar putea fi recomandabil să se aleagă viteza vârfului ca bază pentru reducerea dimensiunii atunci când se utilizează organisme filamentoase. Deși mecanismele care guvernează formarea granulelor în culturile filamentoase nu sunt bine cunoscute, Vecht et al. au raportat o corelație între scăderea OTR și o reducere a dimensiunii medii a granulelor la Streptomyces tendae . Ei au concluzionat că formarea granulelor în acest organism se datorează în principal interacțiunilor hidrofobe controlate de DOT. Având în vedere efectul dăunător pe care formarea granulelor îl poate avea asupra producției de metaboliți secundari în multe organisme filamentoase – din cauza inhibării absorbției de oxigen în centrul granulelor, care crește odată cu diametrul granulelor – este clar că, pentru reducerea la scară a proceselor de cultivare a celulelor filamentoase, MBR trebuie să mențină nivelurile de oxigen dizolvat găsite în procesul la scară mare pe care se bazează reducerea la scară, pentru a menține randamentul produsului. Egalitatea kLa este dificil de utilizat pentru reducerea la scară, deoarece este de obicei calculată în sisteme model care se aseamănă foarte puțin cu bulionii de fermentare reali. În plus, kLa este influențat de schimbările în coalescența și reologia bulionului de cultură pe parcursul unui proces de cultivare – schimbări care sunt foarte greu de măsurat și de luat în considerare. Cheia atunci când se alege o bază pentru reducerea la scară a bioreactorului este de a nu expune celulele la tensiuni mai mari decât cele întâlnite la scară mare.

Dintre dispozitivele miniaturale discutate în această recenzie, este clar că unele caută să reproducă bioreactoarele la scară mare în geometria lor. De exemplu, majoritatea MSBR-urilor și MBCR-urilor sunt facsimile geometrice ale bioreactoarelor la scară mare. Menținerea similitudinii geometrice prezintă avantaje pentru o comparație eficientă la scară, deoarece permite ca unele ipoteze-cheie să rămână valabile; de exemplu, menținerea unui raport de aspect egal ajută la predicția presiunii hidrostatice și, prin urmare, a solubilității oxigenului la diferite scări de funcționare. Acest lucru oferă un avantaj acestor dispozitive, deoarece mecanismele lor de realizare a transferului și amestecului de oxigen și de calcul al puterii absorbite se pot baza pe aceleași principii stabilite la scară mare. Dinamica fluidelor va fi similară, deși este important de remarcat faptul că unele numere adimensionale care descriu dinamica fluidelor, de exemplu numărul Reynolds în vasele agitate, par să aibă o influență mai mică la scări atât de mici . În mod mai fundamental, se pune problema cât de eficiente pot fi MBR-urile atunci când ajung la dimensiuni atât de mici încât proprietățile de curgere și mecanismele de transfer de masă și de amestecare sunt diferite de cele întâlnite în bioreactoarele la scară mare pe care încearcă să le imite. MTP-urile sunt deosebit de vulnerabile în această privință, deoarece lipsa de agitație mecanică înseamnă că efectele tensiunii superficiale sunt mai importante decât în MSBR-uri, unde rotoarele pot diminua acest efect și pot contribui la menținerea unui amestec eficient al fluidelor. În plus, există pericolul, atunci când se utilizează condiții extreme cu MTP (în ceea ce privește frecvența de agitare și volumul de umplere), ca tot lichidul de proces să formeze o peliculă subțire de-a lungul suprafeței interioare a puțului, limitând astfel în mod grav amestecul și exacerbând efectul dăunător al tensiunii superficiale. Diferitele regimuri de curgere în MBR, cauzate de diferite metode de agitare, pot avea un impact asupra capacității acestor sisteme de a realiza în mod reproductibil cultivări de celule; în cazul în care condițiile sunt diferite la scară mică și la scară mare în ceea ce privește amestecul și transferul de masă gaz-lichid, acest lucru ar putea duce la probleme, de exemplu, la selectarea clonelor care nu sunt adecvate pentru producție sau la diferențe în ceea ce privește calitatea produsului, în special în cazul proteinelor recombinate. Pe de altă parte, lucrările lui Micheletti et al. indică faptul că trecerea de la sisteme agitate la sisteme agitate este fezabilă dacă criteriile de extindere sunt alese cu atenție. Utilizând o corelație recent introdusă pentru predicțiile kLa în MTP, aceștia au reușit să extindă cu succes cultivarea E. coli care supraexprimă o enzimă transcetolază dintr-un sistem de microcuve (volum de 1 ml) într-un STR de 1,4 L pe baza constantei kLa. Același grup furnizează, de asemenea, date inițiale privind extinderea satisfăcătoare a unui proces de cultivare a celulelor de mamifere folosind o rată medie constantă de disipare a energiei.

Automatizarea MBR-urilor

Automatizarea MBR-urilor este cheia pentru extinderea capacității HT. Mai multe dintre sistemele miniaturale dezvoltate recent utilizează un MTP modificat ca punct de plecare (de exemplu, și Applikon MicroReactor®). În prezent, aceste sisteme par a fi foarte promițătoare datorită ușurinței cu care se pot integra în platformele de automatizare robotizate existente. MTP-urile pe care sunt concepute astfel de sisteme se bazează pe o amprentă standard, sunt simple din punct de vedere mecanic, iar standardizarea însăși a designului lor le face ideale pentru a fi integrate în platforme automatizate și robotizate care să ducă cu adevărat astfel de tehnologii în domeniul HT, conferindu-le capacitatea de a efectua sute de culturi de celule în paralel, utilizând o amprentă nu mult mai mare decât cea a unui bioreactor convențional la scară pilot. Alternativa este de a dezvolta un sistem de bioreactor miniatural care se pretează la rândul său la automatizare. Tehnologiile pe care le-a dezvoltat grupul lui Weuster-Botz în colaborare cu H + P Labortechnik și Bioprocessors Corp. sunt exemple ale acestei abordări. Astfel de dispozitive oferă un grad de capacitate HT, precum și o robotică sofisticată încorporată, în cazul sistemului SimCell® al Bioprocessors Corp.

Dispozitivele robotice utilizate împreună cu MBR-urile au, de obicei, capete de pipetare multiple montate pe brațe care sunt capabile să se deplaseze în trei dimensiuni pe întreaga zonă de lucru. Capetele de pipetare pot face față, de asemenea, diferitelor geometrii MBR, iar brațele robotizate separate pot prelua și plasa echipamente auxiliare oriunde în spațiul de lucru. Această capacitate de preluare și plasare înseamnă că un singur robot poate inocula, controla pH-ul, preleva probe și face adăugiri la un MBR, oferind o soluție cu adevărat integrată. În plus, roboții pot conecta platformele de cultivare a celulelor cu instrumente analitice (de exemplu, sisteme HPLC) și pot efectua teste complexe, cum ar fi ELISA pentru produse de anticorpi, folosind probe în timp real – teste care profită de capacitatea robotului de a efectua mii de operațiuni de manipulare a lichidelor într-o perioadă scurtă de timp. Condițiile aseptice de cultivare a celulelor pot fi menținute prin adăpostirea robotului într-o cabină de biosecuritate construită la comandă.