Brainbow
Tehnicile Brainbow se bazează pe recombinarea Cre-Lox, în care proteina Cre recombinaza conduce inversiunea sau excizia ADN-ului între situsurile loxP. Metoda originală Brainbow include atât Brainbow-1, cât și Brainbow-2, care utilizează diferite forme de recombinare cre/lox. Brainbow-3, o versiune modificată a Brainbow-1, a fost dezvoltată în 2013. Pentru toate subtipurile Brainbow, expresia unei anumite XFP este un eveniment stocastic, sau aleatoriu.
Brainbow-1 utilizează construcții de ADN cu diferite gene de proteine fluorescente (XFP) separate de forme mutante și canonice de loxP. Acest lucru creează un set de posibilități de excizie care se exclud reciproc, deoarece recombinarea mediată de cre are loc numai între situsuri loxP identice. După ce are loc recombinarea, proteina fluorescentă care rămâne direct după promotor este exprimată în mod unic. Astfel, o construcție cu patru XFP-uri separate de trei situsuri loxP diferite, trei evenimente de excizie și construcția originală poate produce patru proteine fluorescente diferite.
Brainbow-2 utilizează excizia și inversia Cre pentru a permite posibilități multiple de exprimare într-o construcție dată. Într-un segment de ADN cu două XFP orientate opus, Cre va induce un eveniment de inversie aleatorie care lasă o proteină fluorescentă în orientarea adecvată pentru exprimare. În cazul în care două dintre aceste secvențe inversabile sunt aliniate, sunt posibile trei evenimente de inversie diferite. Atunci când se iau în considerare și evenimentele de excizie, una dintre cele patru proteine fluorescente va fi exprimată pentru o anumită combinație de excizii și inversiuni Cre.
Brainbow-3 păstrează formatul loxP Brainbow-1, dar înlocuiește genele RFP, YFP și CFP cu mOrange2, EGFP și mKate2. mO2, EGFP și mK2 au fost alese atât pentru că spectrele lor fluorescente de excitație și emisie se suprapun la minimum, cât și pentru că au o omologie minimă a secvențelor, ceea ce permite proiectarea de anticorpi selectivi care pot fi utilizați pentru a le detecta în protocoalele imunohistochimice. Brainbow-3 abordează, de asemenea, problema umplerii inegale a neuronilor cu XFP-uri prin utilizarea derivaților farnesilați ai XFP-urilor, care sunt traficați mai uniform în membranele neuronale.
Brainbow este implementat in vivo prin încrucișarea a două tulpini de organisme transgenice: una care exprimă proteina Cre și alta care a fost transfectată cu mai multe versiuni ale unei construcții loxP/XFP. Utilizarea mai multor copii ale transgenei permite ca XFP-urile să se combine într-un mod care poate da una dintre cele aproximativ 100 de culori diferite. Astfel, fiecare neuron este etichetat cu o nuanță diferită pe baza expresiei sale combinatorii și stocastice date de proteine fluorescente.
Pentru a elucida modelele de expresie XFP diferențiale într-o formă vizibilă, felii de creier sunt imaginate cu microscopie confocală. Atunci când este expus la un foton cu lungimea sa de undă de excitație particulară, fiecare fluorofor emite un semnal care este colectat într-un canal roșu, verde sau albastru, iar combinația de lumină rezultată este analizată cu un software de analiză a datelor. Suprapunerea neuronilor colorați diferențiat permite dezlegarea vizuală a circuitelor neuronale complicate.
Brainbow a fost testat predominant la șoareci până în prezent; cu toate acestea, tehnica de bază descrisă mai sus a fost, de asemenea, modificată pentru a fi utilizată în studii mai recente de la apariția metodei originale introduse în 2007.
MiceEdit
Creierul de șoarece are 75.000.000 de neuroni și este mai asemănător cu un creier uman decât drosofila și alte organisme utilizate în mod obișnuit pentru a modela această tehnică, cum ar fi C. elegans. Șoarecii au fost primele organisme la care metoda Brainbow de neuroimagistică a fost utilizată cu succes. Livet et al. (2007) au dezvoltat două versiuni de șoareci Brainbow, folosind Brainbow-1 și Brainbow-2, care sunt descrise mai sus. În utilizarea acestor metode pentru a crea o hartă completă și a urmări axonii unui mușchi de șoarece, este necesar să se colecteze zeci de mii de imagini și să se compileze în stive pentru a crea o schemă completă. Este apoi posibilă urmărirea fiecărui axon motor și a contactelor sinaptice ale acestuia pentru a construi un conectom complet al mușchiului.
Mai multe exemple de neuroni examinați cu ajutorul tehnicii Brainbow la șoarecii transgenici sunt localizați în nervul motor care inervează mușchii urechii, în traiectele axonice din trunchiul cerebral și în girusul dentat al hipocampului.
DrosophilaEdit
Complexitatea creierului de Drosophila, format din aproximativ 100.000 de neuroni, îl face un candidat excelent pentru implementarea tehnicilor de neurofiziologie și neuroștiință precum Brainbow. De fapt, Stefanie Hampel et al. (2011) au combinat Brainbow împreună cu instrumente de direcționare genetică pentru a identifica neuronii individuali din creierul de Drosophila și diverse linii neuronale. Unul dintre instrumentele de direcționare genetică a fost un sistem de expresie binar GAL4/UAS care controlează expresia UAS-Brainbow și direcționează expresia către grupuri mici de neuroni. Utilizarea metodelor „Flip Out” a crescut rezoluția celulară a construcției reporterului. Expresia proteinelor fluorescente, ca și în cazul Brainbow original, a depins de recombinarea Cre corespunzătoare cu situsurile lox potrivite. Hampel et al. (2011) au dezvoltat, de asemenea, propria variantă a Brainbow (dBrainbow), bazată pe marcarea epitopilor de către anticorpi mai degrabă decât pe fluorescența endogenă. Două copii ale construcției lor produc șase culori strălucitoare, separabile. Acest lucru, împreună cu simplificări în atribuirea culorilor, le-a permis să observe traiectoriile fiecărui neuron pe distanțe lungi. În mod specific, ei au urmărit neuronii motori de la lobul antenal până la joncțiunile neuromusculare, permițându-le să identifice țintele musculare specifice ale neuronilor individuali.
În cele din urmă, această tehnică oferă capacitatea de a cartografia în mod eficient circuitele neuronale la Drosophila, astfel încât cercetătorii să poată descoperi mai multe informații despre structura creierului acestei nevertebrate și despre modul în care aceasta se leagă de comportamentul său care rezultă.
.