Ceasuri biologice

Alternanța dintre zi și noapte a ciclului terestru este atât de fiabilă încât nu este surprinzător faptul că animalele, plantele și bacteriile își ajustează comportamentul și fiziologia (pentru o trecere în revistă, a se vedea ref. 1). Ritmurile circadiene sunt o adaptare omniprezentă a tuturor organismelor la cele mai previzibile provocări de mediu. Un ritm biologic care persistă în condiții constante și are o perioadă de ≈1 zi se numește „circadian” (circa, „în jurul”; dian, „zi”).

Până foarte recent, moleculele care stau la baza oscilației au rămas necunoscute. Perturbarea acestor oscilații de către inhibitori ai sintezei ARN sau a proteinelor sugerează că astfel de molecule sunt implicate (2).

O abordare care a avut succes în deslușirea mecanismelor este utilizarea modificărilor genetice. Primul și al doilea mutant al ceasului descoperit la musca de fructe, Drosophila melanogaster, sunt genele period și timeless (3-5).

La muștele de fructe, abundența ARNm și a produselor proteice ale genelor period și timeless ciclează timp de ≈24 de ore în locuri specifice din creierul muștelor (6). Maki Kaneko et al. au vorbit despre aceste celule pacemaker putative din creierul muștelor de fructe folosind aceste oscilații moleculare ca marker (7). În capul adult, studiile privind proteinele au arătat că per este exprimat ritmic în locuri specifice, neuronii laterali situați între creierul central și lobii optici. Neuronii laterali sunt considerați drept celule pacemaker presupuse pentru ritmul activității locomotoare a muștelor adulte.

Kaneko și colab. (7) au demonstrat că produsele lui per și tim sunt detectabile într-un număr limitat de neuroni din creierul larvelor. Modelele de expresie în câteva astfel de celule sunt ciclice. Printre acești neuroni, cinci celule situate lateral exprimă. PERIOD (PER) încă din stadiul larvar timpuriu, sugerând că acestea ar putea fi responsabile de păstrarea timpului larvar de eclosie și de activitatea locomotoare. O altă descoperire interesantă este un grup de neuroni cu expresia ciclică a per și tim în antifază față de neuronii laterali. Rezultatele implică prezența unor oscilatori multipli implicați în ritmurile diferitelor procese fiziologice sau comportamentale într-un singur organism. Kaneko et al. (7) au descris, de asemenea, caracterizarea anatomică a modelelor de cablare a neuronilor pacemaker prin utilizarea expresiei genei reporter dependente de promotor per. O astfel de abordare anatomică moleculară ar trebui să aducă o nouă perspectivă asupra cartografierii funcționale a acestui sistem cerebral. În plus, comparația dintre celulele ceasului de mamifere și cele ale muștelor ar trebui să clarifice relația evolutivă dintre aceste sisteme.

Controlul circadian al transcripției oferă un punct de intrare pentru a analiza elementele de reglementare cis și factorii de trans-acțiune prin care ceasul poate regla multe expresii genetice controlate de ceas (6). Se presupune că aceste elemente de reglare putative cu acțiune cis, denumite „time-box” (8), sunt localizate în regiunea promotorului și a enhancerului genelor controlate de ceas. Mai mult, elementul de răspuns controlat de ceas (6) sau time-box poate regla fenomenele fiziologice circadiene endogene în condiții constante. Cel mai recent, un posibil candidat pentru time-box a fost identificat în regiunea promotoare a genei period din Drosophila (9). Deși s-a propus ca per să medieze ciclul ARNm prin represiunea transcripțională, interacțiunea directă dintre per și ADN este foarte puțin probabilă din cauza lipsei unui domeniu de legare la ADN în PER. Grupul lui Hardin a analizat extensiv regiunea promotoare a genei per în studii care au folosit muște transgenice cu gena de fuziune per-lacZ (9). Aceștia au identificat un intensificator transcripțional circadian în cadrul unui fragment de ADN de 69 de pb care conține o cutie E în amonte de gena per, care este responsabil pentru activarea nocturnă a expresiei genei per. E-box-ul este un situs de legare cunoscut pentru clasa de factori de transcripție de tip basic helix-loop-helix.

Recent, cel mai puternic candidat de până acum pentru un factor de trans-acțiune în oscilator este Clock, clonat prin utilizarea unei strategii forward-genetice (10). Grupul lui Takahashi (10) a izolat și a analizat activitatea locomotoare a unor tulpini de șoareci mutanți circadieni. Mutantul Clock a prezentat o perioadă lungă, devenind aritmic după câteva zile în întuneric constant. Takahashi și colegii săi (10) au clonat cu succes gena responsabilă și au identificat mutația în regiunea codificatoare de proteine a genei Clock. În mod interesant, proteina Clock conține un domeniu de legare a proteinei (PAS), care se află în gena per din Drosophila și un motiv de bază helix-loop-helix pentru legarea de ADN. Mai mult, Takahashi și colegii săi (10) au reușit să salveze complet perioada lungă și fenotipul aritmic al șoarecilor mutanți clock prin transferul genei clock normale.

Ravi Allada et al. au descris componentele moleculare comune concentrându-se pe Clock, care este responsabil pentru generarea ritmului circadian atât la muște, cât și la oameni (11). Allada și colegii săi (11) au examinat muștele mutagenetizate chimic în căutarea unor mutanți care modifică sau anulează ritmicitatea circadiană a activității locomotoare și au găsit un nou mutant aritmic, denumit inițial Jrk. Muștele Jrk exprimă niveluri scăzute ale proteinelor periodice și atemporale din cauza nivelurilor reduse de transcripție. Gena a fost identificată și prezintă o conservare frapantă a secvenței cu gena ritmului circadian al mamiferelor, Clock; prin urmare, Allada și colab. (11) au redenumit această genă de muscă dClock. La fel ca și ceasul de șoarece, ceasul din Drosophila conține domeniile basic helix-loop-helix și PAS, precum și un domeniu de activare transcripțională.

Lucrări recente atât la mamifere cât și la muște sugerează că partenerii proteici ai CLOCK sunt, de asemenea, conservați din punct de vedere evolutiv (numiți BMAL) (12, 13). S-a demonstrat că dimerii CLOCK-BMAL se leagă de regiunea promotoare a genelor period și timeless și că transactivează ambele gene la muște. Mai mult, expresia PERIOD-TIMELESS (PER-TIM) reprimă inducerea reporterilor mediată de CLOCK-BMAL. Astfel, a fost propus un model de feedback negativ (Fig. 1).

La mamifere, SCN din hipotalamus este considerat a fi un stimulator major pentru fenomenele de ritm circadian, așa cum au demonstrat numeroase studii anatomice și fiziologice (14). Recent, trei omologi ai genei period din Drosophila au fost raportate la șoarece și la om (15). În ciuda existenței a trei omologi ai perioadei la mamifere care prezintă o oscilație circadiană a ARNm în nucleul suprachiasmatic din creierul de șoarece, nu a fost raportată nicio implicație funcțională a comportamentului de locomotivă circadiană.

Pentru a clarifica dacă omologul per de mamifere ar putea fi implicat în ritmul circadian al comportamentului de locomotoare al mamiferelor, grupul lui Ishida a clonat un omolog per de șobolan și a realizat șobolani aritmici cu leziunea SCN pentru a monitoriza ritmurile circadiene în țesuturile periferice (16).

Pentru a testa dacă expresia ritmică a ARNm de șobolan PERIOD 2 (RPER2) este observată și în alte țesuturi decât SCN, s-a efectuat o analiză Northern blot pe țesuturi din ochi, creier, inimă, splină plămâni, ficat și rinichi. În mod interesant, toate țesuturile testate au prezentat o expresie ritmică a ARNm RPER2, deși raportul noapte/zi a fost diferit în fiecare țesut. RPER2 se comportă ca un omolog la mamifere al genei period din Drosophila (16), deoarece expresia sa circadiană a fost ridicată pe timp de noapte într-o mare varietate de țesuturi, așa cum este perioada la Drosophila.

Pentru că SCN este considerat un stimulator al ceasului circadian la mamifere, grupul lui Ishida (16) a testat dacă expresia circadiană a ARNm RPER2 în mai multe țesuturi este afectată de o leziune a SCN. În mod surprinzător, natura ritmică a expresiei multiple de țesut a RPER2 a fost complet abolită de leziunea SCN. Prin urmare, expresia tisulară multiplă a RPER2 se află sub controlul SCN. Acesta este primul raport care indică faptul că ritmul circadian multițesut este guvernat de un ceas cerebral al mamiferelor, SCN din hipotalamus. Datele sugerează, de asemenea, că un omolog per mamifere (RPER2) ar putea fi implicat în ritmul circadian al comportamentului de locomoție la mamifere, deoarece pierderea expresiei circadiene a ARNm RPER2 în întregul corp a avut loc atunci când activitatea circadiană de locomoție a șobolanilor a fost pierdută. Pentru a clarifica o astfel de problemă, trebuie să realizăm animale transgenice care au o mutație de pierdere a funcției sau de câștig a funcției în gena RPER2. Faptul că expresia ritmică a ARNm RPER2 în mai multe țesuturi depinde complet de SCN sugerează că sunt necesare anumite semnale pentru a menține în mod coordonat ritmul întregului organism (Fig. 2). Un studiu de transplant de SCN sugerează, de asemenea, importanța factorilor umorali din SCN (17). Astfel de factori umorali din SCN ar putea fi importanți pentru a genera expresia ritmică circadiană a genei RPER2 în țesuturile periferice. Astfel, se pare, ca și în cazul biologiei dezvoltării, că moleculele cheie ale acestui ceas biologic sunt bine conservate între muște și mamifere. Mecanismul comun al ceasului molecular de la bacterii (18) la om ar putea fi preconizat în viitorul apropiat.