Complexul adaptor AP-3 mediază sortarea transportatorilor de aminoacizi bazici din familia PQ-loop de la drojdii și mamiferede aminoacizi de bază din familia PQ-pool-loop-loop la membrana vacuolară/lizozomală a drojdiilor și a mamiferelor

Proteina Ypq1 poate ajunge la membrana vacuolară prin intermediul căii ALP sau endosomale

Având raportat recent că o proteină de fuziune Ypq1-GFP se localizează la membrana vacuolară6, am căutat să determinăm prin ce cale de trafic Ypq1 ajunge în acest compartiment. Proteinele din membrana vacuolară pot ajunge în vacuolă prin două căi diferite: calea ALP (fosfatază alcalină) și calea CPY (carboxipeptidază Y), cea din urmă implicând trecerea proteinelor prin endosomi (Fig. 2A). Pentru a testa dacă Ypq1 urmează calea CPY, am examinat distribuția sa intracelulară într-un mutant pep12Δ căruia îi lipsește un t-SNARE implicat în fuziunea veziculelor cu endosomul târziu13. În acest mutant, Ypq1-GFP a fost găsit exclusiv la nivelul membranei vacuolare (Fig. 2B). Într-un mutant vps27Δ lipsit de o componentă a complexului ESCRT-0 endosomal, proteinele membranare care se trafică prin endosomi sunt de obicei stivuite în compartimente de clasă E clar vizibile, care corespund unor endosomi anormal de măriți, dar proteina Ypq1-GFP a fost direcționată în mod normal către membrana vacuolară în acest mutant (datele nu sunt prezentate). Aceste rezultate arată că Ypq1 nu are nevoie de o cale CPY funcțională pentru a ajunge la vacuolă. Am testat apoi dacă Ypq1 ajunge la membrana vacuolară prin intermediul căii ALP. Este bine documentat faptul că această cale necesită complexul adaptor AP-3, despre care se presupune că acționează la trans Golgi pentru a sorta proteinele de sarcină în vezicule care ulterior fuzionează cu endosomii. Acest complex este un heterotetramer format din două subunități mari (β3a și δ), o subunitate medie (μ3a) și o subunitate mică (σ3), iar absența oricăreia dintre aceste subunități duce la un complex AP-3 deficitar14. Prin urmare, am izolat două tulpini cu deficit de AP-3, apm3Δ (lipsită de subunitatea μ3a) și apl5Δ (lipsită de subunitatea δ). În aceste mutante, Ypq1-GFP a fost găsită la nivelul membranei vacuolare, precum și în mici structuri punctate ușor de marcat cu FM4-64 și care nu au fost observate în celulele de tip sălbatic (Fig. 2B). În celulele mutante amp3Δ și apl5Δ care exprimă, de asemenea, un Sec7-mCherry funcțional pentru a marca Golgi, un procent ridicat din aceste structuri punctate au fost decorate cu Sec7-mCherry (Fig. 2C) (pentru o cuantificare a modelelor de sublocalizare, a se vedea Fig. Suplimentară S1 online). Aceste rezultate indică faptul că, atunci când calea ALP este deficitară, Ypq1 tinde să se acumuleze în Golgi, în timp ce o fracțiune semnificativă a proteinei ajunge la membrana vacuolară pe o altă cale. Pentru a testa dacă aceasta din urmă este calea CPY, am determinat localizarea Ypq1-GFP în mutanții dubli apm3Δ pep12Δ și apl5Δ pep12Δ (Fig. 2B). În mod interesant, livrarea Ypq1-GFP către vacuolă a fost în mare măsură afectată în aceste tulpini, iar proteina a fost găsită în cea mai mare parte dispersată în citosol, precum și în structuri punctate marcate cu Sec7-mCherry (Fig. 2B,C) (pentru o cuantificare a modelelor de sublocalizare, a se vedea Fig. Suplimentară S1 online). Vacuola la acești mutanți dubli a putut fi marcată în mod normal cu FM4-64. Aceste rezultate arată că Ypq1 poate fi sortat către membrana vacuolară atât prin intermediul căilor ALP, cât și CPY. În celulele de tip sălbatic, utilizează în principal calea ALP, dar atunci când această cale este deficitară, proteina rezidă mai mult timp în Golgi, dar poate totuși să ajungă eficient la membrana vacuolară prin calea CPY. Atunci când atât calea ALP, cât și calea CPY sunt deficitare, o mică parte din Ypq1-GFP este detectabilă la nivelul membranei vacuolare, sugerând că proteina poate utiliza încă o altă cale, dar una care este mult mai puțin eficientă pentru a direcționa în mod corespunzător Ypq1 către vacuolă.

Un motiv acid de dileucină promovează sortarea Ypq1 către calea ALP

Sortarea dependentă de AP-3 a proteinelor transmembranare este adesea mediată de semnale bazate pe tirozină (YXXØ) sau dileucină (XXXL) (unde Ø este un reziduu hidrofob voluminos și X orice aminoacid)15. Ypq1 conține o secvență EQQPLL în cea de-a doua buclă mare orientată spre citosol. Dileucina din acest motiv este precedată de o prolină, o caracteristică observată la mai multe încărcături care utilizează calea ALP16. S-a constatat că un mutant al Ypq1 cu substituție de la dileucină la dialanină (Ypq1LL>AA) a fost direcționat către membrana vacuolară, dar și pentru a decora structuri punctate (Fig. 3A). Acest fenotip se aseamănă cu cel observat pentru Ypq1 de tip sălbatic în celulele cu deficit de AP-3, sugerând astfel că Ypq1LL>AA ajunge în vacuolă prin intermediul căii alternative CPY. În sprijinul acestui punct de vedere, Ypq1LL>AA produsă într-un mutant pep12Δ nu a reușit să fie direcționată către vacuolă și a fost ratată în structuri punctate citosolice, așa cum s-a observat pentru Ypq1 în mutanții apm3Δ pep12Δ și apl5Δ pep12Δ (Fig. 3A). Aceste rezultate arată că motivul dileucinic acid al Ypq1 este necesar pentru sortarea sa dependentă de AP-3 în vacuolă, dar nu și pentru livrarea sa dependentă de Pep12 în vacuolă. Aceste concluzii sunt în concordanță cu rezultatele unui studiu recent publicat de S. Emr și colaboratorii săi în timpul pregătirii acestui manuscris17. În continuare, am investigat mai detaliat modul în care varianta Ypq1LL>AA circulă spre vacuolă. În primul rând, am avut în vedere posibilitatea ca această proteină mutantă, din cauza faptului că nu utilizează calea ALP, să fie mai întâi deviată către membrana plasmatică înainte de a fi supusă unei endocitoze rapide și de a fi ulterior transportată în mod dependent de Pep12 către membrana vacuolară. Acest model nu a fost susținut de observațiile noastre: Ypq1LL>AA nu s-a acumulat la suprafața celulară într-un mutant end3Δ defect în endocitoză, ceea ce indică faptul că ajunge în vacuolă prin intermediul căii CPY (Fig. 3B). Am emis apoi ipoteza că livrarea Ypq1LL>AA în vacuolă ar putea implica sortarea sa de la Golgi la endosomi datorită unor adaptoare alternative, cum ar fi complexul AP-1 sau proteinele monomerice GGA. Am exprimat proteina mutantă Ypq1LL>AA în celule gga1Δ gga2Δ, lipsite de adaptorii redundanți Gga1 și Gga2 și în celule amp1Δ, amp2Δ și apl4Δ, lipsite de subunități ale complexului AP-1. La fiecare dintre aceste mutante, s-a constatat că proteina ajungea încă în vacuolă (Fig. 3B). Aceste observații sugerează fie că acești adaptatori acționează în mod redundant pentru a promova sortarea Ypq1LL>AA în vacuolă prin intermediul căii CPY, fie că sunt implicați alți adaptatori.

Ypq2 și Ypq3 fac, de asemenea, trafic către vacuolă prin intermediul căii ALP, dar suferă destine diferite atunci când calea ALP este nefuncțională

Proteinele Ypq2 și Ypq3, foarte asemănătoare ca secvență cu Ypq1, se localizează, de asemenea, la membrana vacuolară6 și ambele conțin, de asemenea, o dileucină acidă în cea de-a doua buclă citosolică. Rezultatele din Fig. 4A arată că Ypq2 se deplasează în mod normal către vacuolă într-un mutant pep12Δ. Acest lucru s-a dovedit a fi adevărat și în cazul mutanților apm3Δ și apl5Δ cu defecte în calea ALP, unde s-a constatat, în plus, că decorează structuri punctate, un fenotip care nu se observă în celulele de tip sălbatic. O proporție mare din aceste structuri punctate au fost, de asemenea, marcate cu Sec7-mCherry (Fig. 4B), ceea ce indică faptul că Ypq2, la fel ca Ypq1, tinde să se acumuleze în Golgi atunci când calea ALP este deficitară. Atât la mutanții dubli apm3Δ pep12Δ, cât și la mutanții dubli apl5Δ pep12Δ, Ypq2 s-a localizat în mare parte greșit în mici structuri citosolice punctate, dintre care multe au fost decorate cu Sec7-mCherry, deși o fracțiune a proteinei părea să fie livrată în mod corespunzător în vacuolă (Fig. 4A, B) (pentru o cuantificare a modelelor de sublocalizare, a se vedea Fig. Suplimentară S2 online). Aceste rezultate indică faptul că Ypq2 se comportă la fel ca Ypq1 în sensul că utilizează în principal calea ALP pentru a ajunge la vacuolă. Ele arată, de asemenea, că atunci când această cale este defectuoasă, Ypq2 rezidă mai mult timp în Golgi, dar poate fi încă livrat la membrana vacuolară, în principal prin intermediul căii CPY.

Deoarece exprimarea unei gene YPQ3-GFP sub controlul promotorului natural al YPQ3 a produs un nivel abia detectabil de Ypq3-GFP, am exprimat gena de fuziune sub controlul unui promotor indus de galactoză. Pentru a reduce riscul de localizare greșită din cauza supraproducției de Ypq3-GFP, celulele au fost crescute mai întâi pe rafinoză, apoi s-a adăugat galactoză timp de 3 ore și, în final, s-a furnizat glucoză timp de două ore pentru a reprima transcripția genei YPQ3-GFP. S-a constatat că această Ypq3-GFP indusă în mod tranzitoriu, care s-a acumulat în celulă la un nivel apropiat de nivelul endogen al Ypq1-GFP (a se vedea Fig. suplimentară S3, online), se localizează la membrana vacuolară (Fig. 5A), în concordanță cu rezultatele noastre anterioare6. Această localizare vacuolară a fost observată, de asemenea, la mutantul pep12Δ. Cu toate acestea, la mutanții apm3Δ și apl5Δ, Ypq3 a fost localizat în principal în lumenul vacuolei. Această deplasare eronată a fost dependentă de Pep12, deoarece Ypq3 nu a reușit să fie direcționat către vacuolă la mutanții dubli apm3Δ pep12Δ și apl5Δ pep12Δ (Fig. 5A) (pentru o cuantificare a modelelor de sublocalizare, a se vedea Fig. Suplimentară S4 online). Aceste rezultate sugerează că, la fel ca Ypq1 și Ypq2, Ypq3 utilizează în principal calea ALP pentru a ajunge la membrana vacuolară. Atunci când lipsesc componentele complexului AP-3, Ypq3 este redirecționat într-o manieră dependentă de Pep12 către endosomi, unde este sortat în calea corpului multivesicular (MVB), ceea ce duce la livrarea sa către lumenul vacuolar. Această interpretare a fost evaluată în continuare prin izolarea unui mutant Ypq3LL>AA care nu ar trebui să fie recunoscut de complexul adaptor AP-3. În celulele de tip sălbatic, varianta Ypq3LL>AA a fost în mod clar redirecționată către lumenul vacuolar, dar într-un mutant pep12Δ a fost redirecționată către mici structuri punctate citosolice (Fig. 5B).

Am considerat că comportamentul diferit al Ypq3 în comparație cu Ypq1 și Ypq2 în tulpinile cu deficit de AP-3 s-ar putea datora faptului că Ypq3-GFP a fost sintetizată în celulele care cresc în prezența galactozei, sau pentru că transcrierea genei YPQ3-GFP a fost indusă cu ajutorul promotorului puternic GAL. Totuși, acest lucru pare puțin probabil, deoarece proteinele Ypq1-GFP și Ypq2-GFP induse tranzitoriu în tulpinile de tip sălbatic și mutant cu ajutorul aceluiași promotor GAL s-au localizat în celule ca și atunci când au fost exprimate sub promotorii propriilor gene (a se vedea Fig. suplimentară S5 online). Mai mult, deși semnalul fluorescent a fost abia detectabil, am obținut dovezi că Ypq3-GFP exprimată cu ajutorul promotorului genei naturale YPQ3 a marcat membrana vacuolelor în tulpina de tip sălbatic, dar nu și în mutantul apl5Δ, un fenotip clar diferit de cele obținute cu Ypq1-GFP și Ypq2-GFP. În acest mutant, Ypq3-GFP a fost prezentă în structuri punctate care probabil corespund Golgi, iar ratarea sa în lumenul vacuolar nu a fost clar vizibilă, probabil pentru că fluorescența a fost prea slabă (a se vedea Fig. suplimentară S6 online).

În concluzie, așa cum s-a arătat mai sus pentru Ypq1, proteinele Ypq2 și Ypq3 folosesc în principal calea ALP pentru a ajunge la membrana vacuolară și sunt deviate către endosomi atunci când această cale este defectuoasă. Cu toate acestea, în timp ce Ypq1 și Ypq2, care tranzitează prin endosomi, ajung în mod eficient la membrana vacuolară, Ypq3 este mai predispusă să fie sortată în calea MVB, ceea ce duce la direcționarea sa către lumenul vacuolar.

PQLC2 produsă în drojdie utilizează calea ALP și motivul său dileucină pentru a ajunge la membrana vacuolară

Într-un studiu anterior, s-a constatat că PQLC2 de șobolan se localizează în lizozomi în celulele HeLa, dar mutantul său PQLC2LL>AA, în care dileucina C-terminală este înlocuită cu o dialanină, a prezentat o distribuție mai difuză prin celulă și a fost parțial ratat la membrana plasmatică6. Mai mult, s-a constatat că PQLC2 produsă în drojdie se localizează la membrana vacuolară, unde este funcțională, deoarece s-a constatat că aceasta completează fenotipul de creștere al unui mutant ypq2Δ6. Rezultatele din Fig. 6A arată că PQLC2 a fost direcționat în mod corespunzător către vacuola de drojdie într-un mutant pep12Δ, dar a deviat către lumenul vacuolar în cazul mutanților apm3Δ și apl5Δ. Această direcționare către lumenul vacuolar a fost afectată în cazul mutanților dubli apm3Δ pep12Δ și apl5Δ pep12Δ, unde s-a constatat că PQLC2 a fost distribuit în mod difuz prin citosol (pentru o cuantificare a modelelor de sublocalizare, a se vedea Fig. suplimentară S7 online). Am exprimat, de asemenea, în tulpini de drojdie de tip sălbatic și mutant, mutantul PQLC2LL>AA. În drojdia de tip sălbatic, s-a constatat că PQLC2LL>AA se localizează în lumenul vacuolar, dar s-a constatat că este distribuit în tot citosolul în mutantul pep12Δ (Fig. 6B). Sortarea încărcăturilor către calea corpului multivesicular este de obicei afectată în cazul unui mutant vps27Δ căruia îi lipsește o componentă cheie a complexului ESCRT-018. În mutantul vps27Δ, PQLC2LL>AA a fost stivuit într-un compartiment perivacuolar mare: compartimentul de clasă E observat de obicei în această categorie de mutanți (Fig. 6B). Aceste rezultate arată că PQLC2 produs în drojdie se comportă la fel ca Ypq3 endogen: este sortat în vacuolă prin intermediul căii ALP într-o manieră care depinde de recunoașterea adecvată a motivului său de dileucină de către complexul adaptor AP-3. Atunci când această recunoaștere este afectată deoarece motivul dileucinei este mutat sau lipsește o componentă a complexului AP-3, PQLC2 este deviat către endosomi, unde este sortat eficient în calea MVB, ajungând în cele din urmă în lumenul vacuolar.

Diminuarea unei subunități AP-3 afectează livrarea PQLC2 către lizozomi

PQLC2-GFP produsă în celulele HeLa se colocalizează în mare măsură cu markerul lizozomal LAMP1. Localizarea PQLC2 la membrana lizozomală a fost susținută în continuare prin analiza semi-cantitativă prin spectrometrie de masă a proteinelor din preparatele puternic îmbogățite în membrane lizozomale din celule hepatice de șobolan6. Pentru a determina dacă adaptorul AP-3 contribuie la sortarea PQLC2 către lizozomi, am utilizat ARN mic de interferență (siRNA) pentru a inhiba sinteza subunității μ3A a AP-3 în celulele HeLa. Analiza imunoblot a confirmat faptul că cele două benzi tipice care corespund subunităților μ3A19 au fost abia detectabile în celulele tratate cu ARNi μ3A, spre deosebire de celulele de control (Fig. 7A). Această epuizare a μ3A a perturbat puternic localizarea PQLC2-GFP (Fig. 7B): proteina s-a localizat în mare parte în numeroase structuri punctate intracelulare care nu au fost marcate de colorantul Lyso Tracker care se acumulează în lizozomi și a fost, de asemenea, găsită la suprafața celulară, inclusiv la microvilli, indicând că o parte a proteinei a fost, de asemenea, direcționată greșit către membrana plasmatică. Acest lucru contrastează cu localizarea PQLC2 în celulele tratate cu mock, unde proteina a fost prezentă în structuri punctate, de asemenea puternic marcate de colorantul Lyso Tracker, așa cum era de așteptat. Aceste rezultate sugerează că complexul AP-3 contribuie la localizarea corectă a PQLC2 în lizozomi. Am investigat, de asemenea, localizarea mutantului PQLC2LL>AA (Fig. 7C). În celulele HeLa de control, PQLC2LL>AA a fost găsit distribuit în structuri punctate intracelulare care nu au fost marcate sau au fost foarte slab marcate de colorantul Lyso Tracker și a fost, de asemenea, clar prezent la suprafața celulară, în conformitate cu observațiile anterioare6. Această localizare nu a fost perturbată în mod semnificativ în celulele tratate cu ARN-hibitoriu μ3A, susținând opinia că rolul motivului de dileucină al PQLC2 este de a media traficul intracelular prin intermediul complexului AP-3. Am examinat în continuare dacă PQLC2LL>AA este redirecționat către lumenul compartimentelor endosomale/lizozomale, ca atunci când este produs în drojdie. Celulele HeLa care exprimă PQLC2-GFP au fost tratate timp de două ore cu vacuolin-1, un compus care induce fuziunea homotipică a compartimentelor sistemului endosomal/lizozomal, ceea ce duce la formarea unor structuri mari, umflate (Fig. 8). S-a constatat că PQLC2-EGFP se localizează, așa cum era de așteptat, la membrana limitativă a acestor compartimente endosomale/lizozomale mărite. Același lucru a fost valabil și în celulele care produc PQLC2LL>AA, sugerând că proteina mutantă nu este sortată eficient în calea MVB. În concluzie, complexul adaptor AP-3 pare să joace un rol important în direcționarea PQLC2 către lizozom, cel mai probabil prin recunoașterea dileucinei sale C-terminale. Atunci când această recunoaștere este afectată, proteina este deviată spre suprafața celulară și spre membrana limitativă a compartimentelor interne.

.