Deficiența AP endonucleazei EXO-3 determină întârzierea dezvoltării și organogeneza vulvară anormală, Pvl, prin activarea punctului de control inițiat de glicozilază ADN în Caenorhabditis elegans

Nivelul de expresie al endonucleazelor AP crește după stadiul L4

După ecloziune, C. elegans se transformă în adulți prin patru stadii larvare (L1-L4), fiecare dintre acestea fiind punctat de mutarea cuticulei. Stadiile adulte sunt încă subdivizate în două stadii: stadiul de adult tânăr și stadiul de adult gravid. Pentru a înțelege mai bine rolul endonucleazelor AP după embriogeneză, am măsurat modificarea temporală a nivelului de expresie a ARNm al exo-3 sau apn-1. La 0, 24 și 48 de ore, când majoritatea viermilor N2 se află în stadiul de ou, în stadiul L1 și, respectiv, în stadiul L4, nu s-a constatat nicio diferență în ceea ce privește nivelul de expresie a ARNm atât pentru exo-3, cât și pentru apn-1 (Fig. 1a,b). La 60 de ore, când majoritatea viermilor N2 se află în stadiul de adult tânăr, nivelurile de expresie ale exo-3 și apn-1 au fost de aproximativ 13 ori și, respectiv, de 2,3 ori mai mari decât cele de la 0 ore (Fig. 1a,b). Nivelul de expresie la 72 de ore, când majoritatea viermilor N2 se află în stadiul de adult gravid, a fost același cu cel de la 60 de ore (Fig. 1a,b). Aceste rezultate sugerează că endonucleazele AP sunt necesare după embriogeneză, în special după stadiul L4.

Mutanții exo-3 prezintă întârzieri în dezvoltare

Pentru a clarifica contribuția endonucleazelor AP la dezvoltarea viermilor din stadiul L4 până la cel de adult, viermii deficitari în una sau ambele endonucleaze AP (EXO-3 și APN-1) au fost incubați în condiții normale de creștere timp de 3 zile din stadiul de ou fertilizat (Fig. 1c). Stadiile de dezvoltare între stadiile L4, de adult tânăr și de adult gravid au fost distinse prin starea morfologiei vulvare și prin clocirea ouălor (Fig. 1d,f). Deși toți viermii N2 s-au transformat în adulți gravide, doar 14 % dintre mutanții exo-3 se aflau în stadiul de adult gravid, 85 % se aflau în stadiul de adult tânăr și 1 % se aflau în stadiul de larvă (Fig. 1g), ceea ce sugerează că deficitul de EXO-3 determină încetarea dezvoltării sau întârzierea dezvoltării. În schimb, toți mutanții apn-1 au devenit adulți gravide, iar mutanții apn-1;exo-3 se aflau aproape în aceleași stadii de dezvoltare ca și mutanții exo-3 (Fig. 1g). Douăsprezece ore mai târziu, toate mutantele exo-3 și apn-1;exo-3 au ajuns în stadiul de adult gravid (datele nu sunt prezentate), ceea ce indică faptul că deficitul de EXO-3 nu determină încetarea dezvoltării în stadiul de adult tânăr, ci doar o întârziere a dezvoltării. Pentru a investiga cu precizie cât de lungă a fost întârzierea mutanților exo-3, am măsurat timpul de atingere a stadiului de adult gravid din fiecare vierme la fiecare două ore și am calculat diferența de timp mediu între N2 (N = 8) și mutanții exo-3 (N = 16). Diferența a fost de 6 ore.

Târzierea dezvoltării la mutanții exo-3 este dependentă de ADN-glicozilaza NTH-1

Este rezonabil să deducem că fenotipul de întârziere a dezvoltării la mutanții exo-3 este cauzat de acumularea de situsuri AP sau SSB blocate 3′ în ADN, deoarece acestea sunt substraturi pentru EXO-315. Aceste structuri din ADN pot fi generate de glicozilazele ADN. Dintre cele două ADN-glicozilaze conservate la C. elegans, UNG-1 generează situsuri AP prin activitatea monofuncțională a ADN-glicozilazei asupra uracilului din ADN, iar NTH-1 produce SSB 3′-blocate prin activitatea bifuncțională a ADN-glicozilazei asupra leziunilor pirimidinice oxidative din ADN. Prin urmare, am examinat dependența întârzierii în mutanții exo-3 de UNG-1 și NTH-1. La trei zile după ce s-au dezvoltat din ouă, 9% dintre mutanții ung-1;exo-3 se aflau în stadiul de adult gravid, 86% se aflau în stadiul de adult tânăr și 5% se aflau în stadiul de larvă, iar aceste proporții au fost aproape identice cu cele prezentate de mutanții exo-3 (11% în stadiul de adult gravid, 85% în stadiul de adult tânăr și 4% în stadiul de larvă) (Fig. 2), sugerând că întârzierea este independentă de UNG-1. În schimb, 94% dintre mutanții nth-1;exo-3 se aflau în stadiul de adult gravid și 6% în stadiul de adult tânăr. Mutanții nth-1;ung-1;exo-3 au prezentat rezultate similare (Fig. 2), sugerând că întârzierea este dependentă de NTH-1.

Încetinirea dezvoltării mutanților exo-3 este potențată de MMS și NaHSO3

Pentru a clarifica dacă agenții care generează situsuri AP pot provoca întârzieri în dezvoltare, am efectuat un test de dezvoltare folosind MMS și bisulfit de sodiu (NaHSO3) (Fig. 3a). Se știe că MMS creează indirect situsuri AP20,21 și s-a demonstrat că induce leziuni ale ADN-ului în genomul lui C. elegans22. La 3,5 zile după ce ouăle au fost depuse pe plăci care conțineau 0,94 mM MMS, 97% din N2 se aflau în stadiul de adult gravid și 3% se aflau în stadiul de larvă, în timp ce 61% din mutanții exo-3 se aflau în stadiul de adult gravid, 34% se aflau în stadiul de adult tânăr și 5% se aflau în stadiul de larvă (Fig. 3b), ceea ce sugerează că situsurile AP induse de MMS provoacă o întârziere mai mare a dezvoltării la mutanții exo-3 decât la N2. Pe de altă parte, 93% dintre mutanții apn-1 se aflau în stadiul de adult gravid, 6% se aflau în stadiul de adult tânăr și 1% se aflau în stadiul de larvă, ceea ce este similar cu rezultatele pentru N2 (Fig. 3b). NaHSO3 deteriorează ADN-ul în principal prin deaminare a citosinei în uracil23. La patru zile după ce s-au dezvoltat din stadiul de ou, toți mutanții exo-3 care nu au fost tratați cu NaHSO3 s-au transformat în adulți gravide, dar 33% dintre cei tratați cu 10 mM NaHSO3 se aflau în stadiul de adult gravid, 12% se aflau în stadiul de adult tânăr și 55% se aflau în stadiul de larvă (Fig. 3c), ceea ce indică faptul că NaHSO3 a indus o întârziere a dezvoltării la mutanții exo-3. Această întârziere a fost atenuată la mutanții ung-1;exo-3, deoarece 79% dintre cei tratați cu 10 mM NaHSO3 se aflau în stadiul de adult gravid, 14% se aflau în stadiul de adult tânăr și 7% se aflau în stadiul de larvă (Fig. 3c), ceea ce sugerează că întârzierea dezvoltării indusă de NaHSO3 s-a datorat activității UNG-1. Luate împreună, situsurile AP pot cauza întârzierea dezvoltării, precum și SSB blocat 3′ generat de NTH-1.

Târzierea de dezvoltare a mutanților exo-3 este indusă de CHK-2

Am presupus în continuare că întârzierea de dezvoltare inițiată de glicozilaza ADN a mutanților exo-3 se datorează activării punctului de control al deteriorării ADN determinată de produsele de clivaj produse de glicozilaza ADN. Genele punctului de control al deteriorării ADN, cum ar fi chk-2 și clk-2, au fost descrise la C. elegans24. Pentru a ne testa ipoteza, testul de dezvoltare a fost efectuat în condiții chk-2 (RNAi) sau clk-2 (RNAi) (Fig. 4a). Deși 14 % dintre viermii exo-3;control (RNAi) se aflau în stadiul de adult gravid și 84 % se aflau în stadiul de adult tânăr, iar viermii exo-3;clk-2 (RNAi) au demonstrat proporții similare (18 % în stadiul de adult gravid și 82 % în stadiul de adult tânăr), 93 % dintre viermii exo-3;chk-2 (RNAi) se aflau în stadiul de adult gravid (Fig. 4b). Astfel, reducerea chk-2 a salvat întârzierea dezvoltării la mutanții exo-3, sugerând că CHK-2 induce întârzierea dezvoltării la mutanții exo-3.

EXO-3 previne formarea Pvl indusă de dut-1 (RNAi)

DUT-1 este o nucleotidohidrolază de deoxiuridină trifosfat (dUTPază), care hidrolizează dUTP în dUMP. Prin urmare, dut-1 (RNAi) duce la creșterea dUTP în fondul de nucleotide, care este încorporat în ADN prin replicarea ADN în locul dTTP, ceea ce determină acumularea de uracil în ADN25,26. S-a raportat că dut-1 (RNAi) induce o organogeneză vulvară anormală, Pvl, la viermii N2 de tip sălbatic, și că Pvl indusă de dut-1 (RNAi) este dependentă de UNG-127. Am speculat că deficitul de EXO-3 determină o creștere a incidenței Pvl induse de dut-1 (RNAi) deoarece EXO-3 este necesar pentru a repara situsurile AP după scindarea uracilului din ADN de către UNG-1. Pentru a confirma acest lucru, formarea Pvl indusă de dut-1 (RNAi) a fost observată în mutanții cu deficit de endonucleaze AP (Fig. 5a-c). Dintre adulții supraviețuitori la 4 zile după ce s-au dezvoltat din ouă, 52% au fost mutanți exo-3 cu Pvl indusă de dut-1 (RNAi) și 13% au fost viermi N2 cu Pvl (Fig. 5d), sugerând că deficitul de EXO-3 determină o creștere a Pvl indusă de dut-1 (RNAi). Pe de altă parte, 15% dintre mutanții apn-1 aveau Pvl, ceea ce este similar cu proporția de viermi N2 cu Pvl (Fig. 5d). Mutanții apn-1;exo-3 și mutanții exo-3 au avut o proporție similară, cu 52% având Pvl (Fig. 5d).

Creșterea Pvl indusă de dut-1 (RNAi) în mutanții exo-3 este dependentă de UNG-1, indiferent de NTH-1

Pentru a examina dacă creșterea Pvl indusă de dut-1 (RNAi) în mutanții exo-3 a avut loc prin activitatea UNG-1, am investigat dependența fenotipului de UNG-1. Procentul de mutanți ung-1;exo-3 cu Pvl a fost de 2%, care a fost același cu cel al mutanților ung-1 cu Pvl (1%) (Fig. 6a), ceea ce sugerează că creșterea Pvl în mutanții exo-3 se datorează doar expresiei UNG-1.

În continuare, am examinat dacă produsele de clivaj produse de UNG-1 sunt necesare pentru a induce Pvl, adică dacă situsurile AP sunt transformate în SSB blocate în 3′ prin intermediul activității de liza AP a NTH-1. Procentul de mutanți exo-3 cu Pvl a fost comparabil cu cel al mutanților nth-1;exo-3 (Fig. 7b), sugerând că NTH-1 nu este necesar pentru Pvl indus de dut-1 (RNAi).

Creșterea Pvl indusă de dut-1 (RNAi) în mutanții exo-3 este condusă de CHK-2

Am emis ipoteza că creșterea dependentă de UNG-1 a Pvl indusă de dut-1 (RNAi) în mutanții exo-3 poate avea loc prin activarea punctului de control al ADN condusă de produsele de clivaj produse de UNG-1, în plus față de întârzierea dezvoltării. S-a raportat, de asemenea, că Pvl indusă de dut-1 (RNAi) este cauzată de kinaza de punct de control CLK-227. Prin urmare, am examinat dacă creșterea Pvl indusă de dut-1 (RNAi) în mutanții exo-3 a fost dependentă de CHK-2 și CLK-2. Deși 49% dintre viermii exo-3;control (RNAi) au avut Pvl indusă de dut-1 (RNAi), doar 10% dintre viermii exo-3;chk-2 (RNAi) au avut-o (Fig. 6b). Pe de altă parte, proporția de viermi exo-3;clk-2 (RNAi) cu Pvl a fost aproape aceeași (44%) cu cea a viermilor exo-3;control (RNAi). Prin urmare, blocarea chk-2 a salvat creșterea Pvl indusă de dut-1 (RNAi) la mutanții exo-3, așa cum s-a observat pentru întârzierea dezvoltării. Aceste rezultate sugerează că creșterea Pvl indusă de dut-1 (RNAi) la mutanții exo-3 se produce prin intermediul expresiei CHK-2.

Agenții de deteriorare a ADN-ului oxidativ au sporit proporția de Pvl în mutanții exo-3 doar atunci când au fost combinați cu dut-1 (RNAi)

Pentru a investiga alți agenți de deteriorare a ADN-ului care determină o creștere a Pvl în mutanții exo-3, am evaluat dacă formarea Pvl este sporită de agenți de deteriorare a ADN-ului oxidativ, cum ar fi ndx-1 (RNAi), ndx-2 (RNAi) și metil viologen (MV). NDX-1 și NDX-2 hidrolizează 8-oxo-dGDP în 8-oxo-dGMP24,28. În consecință, ndx-1 (RNAi) și ndx-2 (RNAi) conduc la o creștere a 8-oxo-dGDP în fondul de nucleotide. Prezența 8-oxo-dGDP reduce activitatea de 8-oxo-dGTPază a NDX-4, determinând acumularea de 8-oxo-dGTP în grup24. 8-oxo-dGTP este încorporat în ADN în timpul replicării ADN, ceea ce duce la acumularea de 8-oxoG în ADN24,28. MV generează radicali superoxid, care ulterior provoacă leziuni oxidative în ADN29. Cu toate acestea, un singur tratament cu ndx-1 (RNAi), ndx-2 (RNAi) sau MV nu a avut niciun efect asupra incidenței Pvl la mutanții exo-3. (datele nu sunt prezentate). În continuare, am examinat dacă, atunci când este combinat cu tratamentul cu dut-1 (RNAi), fiecare agent de deteriorare oxidativă a ADN-ului a sporit și mai mult creșterea Pvl în mutanții exo-3 (Fig. 7a). Fiecare tratament testat a sporit creșterea Pvl indusă de dut-1 (RNAi) în mutanții exo-3 cu aproximativ 10 % (Fig. 7b), sugerând că leziunile oxidative din ADN pot provoca, de asemenea, o creștere a Pvl.

În experimentele in vitro, s-a constatat că NTH-1 posedă o activitate slabă de glicozilază ADN față de 8-oxoG în ADN, în plus față de activitatea sa mult mai mare față de leziunile oxidative de pirimidină30. Astfel, bănuim că creșterea mai mare a Pvl indusă de dut-1 (RNAi) de către agenții oxidativi suplimentari depinde de activitatea NTH-1. Deși am confirmat dependența fenotipului de NTH-1, deficitul de NTH-1 nu a modificat proporția de viermi care prezintă Pvl (Fig. 7b).

.