Descoperirea, activitatea și caracterizarea unei polizaharide litice AA10 din simbiontul viermilor de mare Teredinibacter turnerae

Expresia și caracterizarea enzimatică a LPMO AA10 din T. turnerae

Gamma-proteobacteria T. turnerae este singurul endosimbiont găsit în branhiile viermilor de mare care a fost izolat, cultivat și al cărui genom a fost cartografiat cu succes. Prin adnotare automată și căutări manuale BLAST ale proteomului prezis al T. turnerae, am identificat o genă (Secvența de referință NCBI: WP_019602454.1) care codifică pentru un LPMO AA10 (denumit în continuare TtAA10A). Secvența proteică prezisă prezintă o peptidă semnal N-terminală, domeniul LPMO și o regiune de legătură bogată în serină, urmată de un domeniu al modulului de legare a carbohidraților (CBM) 10 (Fig. 1a). S-au găsit AA10 cu domenii CBM2, CBM3, CBM5, CBM10, CBM12, CBM18 și CBM73 anexate (Bernard Henrissat, comunicare personală) și se știe că sunt active pe celuloză sau chitină. Se crede că domeniile CBM10 se leagă de celuloză și astfel pot asigura recunoașterea celulozei care este puțin probabil să fie asociată cu un eveniment catalitic . Deși este diferit de CBM-urile care se găsesc în mod obișnuit atașate la proteinele AA10 , prezența sa în structura domeniului genei TtAA10A oferă o indicație că această proteină poate fi activă în principal pe polizaharidele pe bază de glucoză.

După multiple încercări de exprimare a genei cu diferite afinități, etichete de solubilitate și diferite semnale de secreție, în cele din urmă a fost obținută o proteină suficientă pentru analiză prin producerea unui domeniu catalitic LPMO marcat cu streptoză C-terminală (de la His25 la Gly228) în E. coli (Fig. 1b). Proteina marcată purificată a fost încărcată cu exces de cupru, desalinizată prin cromatografie de excludere a mărimii, analizată pentru puritate prin SDS-PAGE (Fig. 1c) și identificarea proteinei pe baza spectrometriei de masă (nu este prezentată) și utilizată pentru experimentele ulterioare.

TtAA10A recombinat (numai domeniile catalitice, 25-228) prezintă semnele distinctive ale unui AA10 pliat corect. Analiza deplasării termice (Thermofluor) a TtAA10A purificat, încărcat cu Cu, indică o temperatură de topire (Tm) de 50,4 °C. Îndepărtarea cuprului cu 10 mM EDTA scade Tm la 42,5 °C, sugerând un efect de stabilizare a proteinei de către cofactorul metalic, așa cum s-a raportat în literatura anterioară pentru alte LPMO (de exemplu, Fig. 1d). Am observat, de asemenea, o variabilitate în preparatele proteice, unele preparate conținând un singur Cu (centru activ), în timp ce altele conțineau doi atomi de Cu, descriși mai jos.

Sesizările de activitate, atât pe eșantioane cu un singur situs de Cu, cât și pe eșantioane cu dublu situs de Cu, au fost efectuate pe o serie de substraturi polizaharidice comerciale (Avicel, β-chitină din pene de calmar, α-chitină din carapace de creveți, cellohexaoză, amidon de porumb, pachiman, xilan din lemn de fag, glucomanan, xiloglucan, lichenan, galactan, galactomanan și manan) în prezența cofactorului reducător, acidul galic. Probele au fost analizate după 24 de ore prin MALDI-TOF MS, iar masele de vârf ale produselor de reacție au fost comparate cu datele publicate anterior, dezvăluind un model de oxidare mixt C1-C4, exclusiv pe celuloză și dependent de prezența donatorului de electroni (Fig. 2a, b). Produsele nu au fost detectate în niciunul dintre controalele negative (Fișier suplimentar 1: Figura S1). Analiza MALDI-TOF MS a extractului brut din testele de activitate efectuate cu TtAA10A încărcat cu Cu în prezența a 10 mM EDTA nu a reușit să detecteze eliberarea de produse (datele nu sunt prezentate), ceea ce indică faptul că, așa cum era de așteptat, cuprul este esențial pentru activitate.

Experimentele de sinergie au fost efectuate prin coincubarea TtAA10A și a glicozid hidrolazelor comerciale (GH6 și GH9) în prezența Avicelului și a acidului galic, iar mono- și oligozaharidele rezultate au fost cuantificate cu ajutorul cromatografiei de schimb anionic de înaltă performanță (HPAEC). În timp ce reacțiile care conțin fie LPMO, fie GH singure au eliberat cantități neglijabile de zaharuri libere, reacțiile de coincubare au arătat un puternic efect sinergic, sporit și mai mult de prezența donatorului de electroni (Fig. 2c, d, Fișier suplimentar 2: Figura S2). Este demn de remarcat faptul că ambele GH comerciale (GH6 și GH9) testate în timpul acestor experimente aparțin unor familii care au fost identificate ca fiind printre cele mai abundente în proteomul digestiv al viermilor de corabie , ceea ce întărește relevanța biologică a testelor de activitate menționate anterior în contextul digestiei lemnului în mediul viermilor de corabie.

Spectroscopia de rezonanță paramagnetică a electronilor

Prima noastră dovadă că unele preparate proteice conțineau două situsuri de Cu a venit din analizele EPR. Spectrul CW-EPR în bandă X în soluție congelată (165 K) al TtAA10A saturată cu Cu (Fig. 3) a prezentat două seturi de vârfuri hiperfine în regiunea paralelă a spectrului, indicând prezența a două geometrii de coordinare a cuprului distincte, care provin fie din medii de coordinare diferite în cadrul unui singur sit (de exemplu, diferențe în stările de protonare ale liganzilor), fie dintr-un al doilea sit distinct de legare a cuprului. Într-adevăr, o simulare precisă a regiunii paralele a spectrului a putut fi obținută cu două specii diferite, fiecare dintre acestea oferind un set diferit de parametri hamiltonieni de spin, gz = 2,267 și |Az| = 425 MHz (specia 1) și gz = 2,314 și |Az| = 465 MHz (specia 2), Tabelul 1, cu un raport între speciile 1 și 2 de aproximativ 3:2. Valoarea gz a speciei 2 este ridicată în comparație cu cea la care ne-am putea aștepta pentru coordonarea tipică a cuprului LPMO AA10 în situsul activ (spectroscopia LPMO-urilor recent analizată în Ref. ), pe baza căreia atribuim specia 1 unui cupru legat de situsul activ al brățării canonice a histidinei. Valorile hamiltoniene de spin ale acesteia sunt tipice pentru o geometrie de coordinare axială a Cu care conține un amestec de liganzi donatori de N și O . (Rețineți că specia 2 nu poate proveni de la o specie de cupru liber în soluție, deoarece toate speciile de molecule mici sunt eliminate în timpul preparării proteinei; prin urmare, toate semnalele de cupru din EPR provin de la cuprul legat de proteină.)

Pentru a determina dacă cele două semnale provin de la un singur situs de legare a cuprului cu geometrii de coordinare diferite sau de la două situsuri de cupru distincte, s-a efectuat un experiment de titrare CW-EPR în bandă X. Proteina a fost tratată în prealabil cu EDTA (10× concentrația proteinei) pentru a elimina orice cupru și apoi a fost schimbată în tampon pentru a elimina orice EDTA. Această probă de proteină fără cupru a fost testată și, așa cum era de așteptat, nu a prezentat niciun semnal pe bază de cupru. Adăugarea a 0,2 echivalenți de cupru (în comparație cu concentrația proteinei) a arătat un singur semnal în regiunea paralelă, atribuit ionului de cupru (II) din cadrul situsului activ al brățării histidinei (specia 1). Adaosurile ulterioare de cupru au crescut acest semnal de cupru al brațului de histidină, cu o creștere concomitentă a semnalului pentru specia 2, deja evident după 0,4 echivalenți de cupru (Fișier suplimentar 3: Figura S3). Aceste experimente de titrare au fost efectuate la un pH fix și arată că cele două specii din spectrul EPR al TtAA10A saturate cu cupru reprezintă două situsuri diferite de legare a cuprului cu afinități de legare a cuprului ușor diferite, unde specia 1 este situsul cu afinitate mai mare. În plus, proba de TtAA10A cu 0,4 echivalenți de Cu a fost lăsată la 4 °C timp de 48 de ore, iar spectrul său EPR a fost reexaminat. Această probă nu a arătat nicio diferență în raportul dintre speciile de cupru, demonstrând că diferitele situsuri de legare nu au apărut din cauza unor diferențe mari în cinetica de legare a cuprului.

În mod vizibil, în mai multe preparate pe care le-am produs, a fost izolată o probă de TtAA10A care a prezentat un singur semnal de cupru în spectrul EPR. Motivele pentru această diferență în stoichiometria cuprului din proteina izolată nu sunt clare, deoarece aceste probe au fost aparent preparate folosind condiții identice cu cele care au permis obținerea TtAA10A cu două semnale distincte de Cu în spectrul EPR în banda X (specia 1 și specia 2). Nu am reușit să detectăm nicio diferență de activitate pentru aceste preparate cu o singură ocupație de cupru în raport cu eșantioanele anterioare, dar am putut profita de aceste eșantioane pentru a măsura atât spectrele CW-EPR în banda X, cât și în banda Q pentru Cu din centrul activ al TtAA10A (Fig. 4) cu doar brățara de histidină ocupată, după cum se apreciază prin referire la spectrele anterioare. Prin urmare, acest eșantion ne-a permis să efectuăm o potrivire simultană atât a spectrelor în banda X, cât și a celor în banda Q pentru a obține parametri hamiltonieni de spin mai exacți pentru ionul de cupru din situsul activ al bretelei de histidină (specia 1). Aceste valori sunt raportate în tabelul 2. Adăugarea de PASC la TtAA10A nu a provocat nicio modificare a spectrelor EPR (datele nu sunt prezentate).

Structura 3D a TtAA10A

Pentru a înțelege mai bine bazele moleculare ale proprietăților biochimice ale TtAA10A și pentru a cerceta această structură dublă Cu, potențial neobișnuită, am determinat structura cristalină pentru proteina exprimată prin recombinare la o rezoluție de 1,4 Å (Fișierul suplimentar 4: Tabelul S1). Structura generală a evidențiat un pliu central asemănător cu cel al imunoglobulinei, decorat cu bucle și un pachet elicoidal, așa cum se observă în mod obișnuit la enzimele din această familie (Fig. 5). Într-adevăr, comparațiile structurale utilizând serverul DALI dezvăluie cele mai apropiate corespondențe structurale cu Cellvibrio japonicus AA10A (PDB ID 5fjq) și Serratia marcescens CBP21 (PDB ID 2bem) cu RMSD de 2,4 Å și 2,3 Å pe 180 și, respectiv, 170 de poziții Cα, reprezentând doar 30 % identitate la nivel de secvență. Având în vedere activitatea ridicată a TtAA10A pe celuloză, poate fi oarecum surprinzător faptul că cele două cele mai apropiate corespondențe structurale cu această enzimă sunt AA10-uri active pe chitină. Cu toate acestea, a treia cea mai apropiată potrivire structurală a fost AA10 de la Streptomyces coelicolor (ScAA10, PDB ID 4oy7 ), care este o AA10 specifică celulozei, oferind un RMSD de 2,5 Å pe 160 de atomi de Cα. TtAA10A și ScAA10 au o identitate de secvență de numai 26 %, chiar dacă sunt active pe același substrat, ceea ce evidențiază și mai mult dificultatea de a relaționa specificitatea substratului LPMO doar pe baza secvenței și a structurii generale (discutată în continuare în contextul AA9 în Ref. ).

Ca și în cazul tuturor LPMO-urilor studiate până în prezent (așa cum sunt definite de activitatea lor), situsul activ al TtAA10A este format de motivul „bretelei de histidină” care este situat în centrul unei suprafețe aproape plate (Fig. 5a, b). Un singur ion de cupru a fost modelat în această poziție, coordonat într-o geometrie tipică în formă de T de terminația amino și lanțul lateral al His 1 și de imidazolul lanțului lateral al His 107. În pozițiile axiale din jurul ionului de cupru din situsul activ, TtAA10A are Phe 195 și Gly 105. Aceste poziții sunt adesea ocupate de o fenilalanină/tirozină și, respectiv, de un lanț lateral de alanină, în alte AA10. Acesta din urmă a fost implicat în crearea unui mediu steric care conduce la formarea geometriei distorsionate de coordonare a situsului activ observată în AA10s specifice chitinei în starea de oxidare Cu(II) . Aici, înlocuirea lui Ala cu Gly permite cuprului din situsul activ să adopte o geometrie de coordonare ușor mai axială, mai apropiată de cea tipică pentru AA9s și AA10s activi în celuloză și în concordanță cu parametrii hamiltonieni de spin ai speciei 1 din analiza noastră EPR descrisă anterior, Fig. 4. Structurile cristaline LPMO sunt deseori afectate de foto-reducere ca urmare a deteriorării prin radiații, astfel încât geometria de repaus a situsului activ nu poate fi observată direct în structurile cristaline (exemplele includ ). Analiza sferei care înconjoară ionul de cupru din TtAA10A relevă doar o densitate slabă pentru o moleculă de apă aflată la 2,6 Å de cupru și o densitate mai mare pentru o a doua moleculă de apă aflată la 3,2 Å distanță, care se leagă de Glu 53 prin hidrogen. Aceste molecule de apă sunt prea îndepărtate de cupru pentru a fi considerate ca fiind de coordonare directă. Prin urmare, se pare că cuprul din această enzimă a suferit, de asemenea, o fotoreducere la starea de oxidare Cu(I).

Structura noastră dezvăluie poziția celui de-al doilea situs de legare a cuprului care a fost observat în spectrele EPR. Acest site se află la 14,4 Å (Cu…Cu) de la ionul de cupru al bretelei de histidină într-un mare petic încărcat negativ pe suprafața proteinei (Fig. 5a, b; Fișier suplimentar 5: Figura S4). Acest al doilea ion de cupru este coordonat direct de His 165, Glu 5, Asp 101, o moleculă de apă și His 207*, care este furnizat de Strep-tag-ul dintr-o moleculă adiacentă din cristal. Datorită observării acestei interacțiuni, am verificat starea oligomerică a proteinei în soluție cu ajutorul SEC-MALLS (Fișier suplimentar 6: Figura S5). Acest lucru a confirmat faptul că proteina este monomerică, sugerând că interacțiunea cupru-His207* este un artefact al cristalului (deși unul care poate sugera o potențială interacțiune proteină-proteină). Cu toate acestea, adăugată la datele EPR, structura sugerează că acest al doilea situs este ocupat în soluție, His 207* fiind probabil înlocuit de o moleculă de apă. Alinierea secvenței multiple a primilor 500 de ortologi TtAA10A identificați prin căutările BlastP arată că, în timp ce un reziduu acid în poziția 5 nu este neobișnuit printre AA10, reziduurile 101 și 165 sunt în mare măsură conservate doar în cadrul LPMO-urilor din bacteriile care sunt strâns înrudite cu Teredinibacter.

Au existat dezbateri considerabile cu privire la posibilele poziții în care donatorii de electroni, atât molecule mici cât și proteice, se pot lega de LPMO-uri pentru a permite cataliza atunci când enzima este legată de suprafața substratului solid (a se vedea, de exemplu ). Într-adevăr, examinarea structurii TtAA10A pentru posibilele căi de transfer de sarcină cu ajutorul programului EHPath arată că între histidina 1 și tirozina 3 (la o distanță de 10 Å) există o cale clară și rapidă de săritură a găurilor, cu un timp mediu de ședere a găurilor de numai 20 ms. Tirozina 3 este adiacentă (5,3 Å) celui de-al doilea sit de Cu, oferind astfel o cale eficientă de transfer de sarcină între cele două situri de cupru. Prin urmare, având în vedere calea potențială de transfer de sarcină între cele două situsuri de cupru, am investigat dacă cel de-al doilea sit metalic (în cazul nostru ocupat de cupru, deși nu am putut deplasa Cu cu săruri de Fe, Ni, Zn și Mn) reprezintă un situs de legare pentru un partener redox proteic (legarea unei alte proteine la acest situs este sugerată de asocierea Strep-tag cu o moleculă vecină în rețeaua cristalină) și am încercat să extragem proteinele din T. turnerae care ar putea interacționa în mod stabil cu TtAA10A utilizând coloana de afinitate (StrepTrap HP) cu TtAA10A imobilizată. Aceste experimente (datele nu sunt prezentate) nu au condus la izolarea niciunui activator candidat pe bază de proteină pentru TtAA10A, dar nu poate fi exclusă posibilitatea ca o enzimă activatoare să se lege tranzitoriu în această regiune pentru a permite transferul de electroni către LPMO și, prin urmare, inițierea catalizei. Cu toate acestea, trebuie remarcat faptul că, în timpul rafinării structurii, am identificat, de asemenea, un situs de legare a sodiului pe suprafața proteinei (Fișier suplimentar 7: Figura S6). Rămâne o întrebare deschisă dacă aceste situsuri de legare suplimentare sunt un rezultat al încărcăturii crescute pe care această proteină ar putea să o aibă pentru a fi stabilă în mediul salin în care T. turnerae locuiește. Cu toate acestea, aceste caracteristici de suprafață ale TtAA10A ar putea fi de interes pentru inginerii enzimatici în cazul în care LPMO-urile trebuie să fie stabilizate sau adaptate la condiții specifice pentru a fi implementate în bioreactoare industriale.

.