Efectele antiastmatice ale decoctului Sanglong Pingchuan prin inducerea unui răspuns imunitar Th1/Th2 echilibrat

Abstract

Obiectiv. Investigarea efectelor antiastmatice ale decoctului Sanglong pingchuan (SLPCD) și explorarea mecanismelor sale de acțiune. Metode. Serul, lichidul de lavaj bronhoalveolar (BALF) și țesuturile pulmonare de la șoareci cu astm alergic indus de OVA au fost colectate la 24 h după ultima administrare. Modificările patologice pulmonare au fost observate prin colorare H&E. Celulele inflamatorii din BALF au fost numărate prin citometrie în flux. Nivelurile de IgE totală în ser și citokine în BALF au fost determinate prin ELISA. Nivelurile de expresie ale ARNm al citokinelor în plămâni au fost analizate prin qRT-PCR. Rezultate. SLPCD a inhibat în mod semnificativ inflamația căilor respiratorii, a redus celulele inflamatorii din BALF, a redus nivelurile de IgE totală în ser și de citokine Th2 (IL-10 și IL-13) în BALF și a redus nivelurile de expresie ARNm ale citokinelor Th2 (IL-4, IL-5, IL-10 și IL-13) în plămânul șoarecilor astmatici. Cu toate acestea, SLPCD a crescut în mod remarcabil nivelul citokinei Th1 IFN-γ în BALF și a crescut nivelul de expresie ARNm al citokinelor Th1 (IL-2 și IFN-γ) în plămânii șoarecilor astmatici. Concluzii. SLPCD ar putea atenua inflamația căilor respiratorii și atenua patogeneza la șoarecii astmatici prin inducerea unui răspuns Th1/Th2 echilibrat și ar putea acționa ca un medicament eficient pentru tratamentul astmului.

1. Introducere

Astmul este o boală respiratorie cronică complexă, care se caracterizează prin hiperreactivitate bronșică, inflamarea și remodelarea căilor respiratorii, obstrucția fluxului de aer și infiltrarea diferitelor tipuri de celule inflamatorii induse de citokine și alți mediatori . Astmul este cauzat de factori de mediu, cum ar fi alergenii, virușii și expunerile profesionale la persoane predispuse genetic; cu toate acestea, cauza sa definitivă nu este clară . Incidența astmului a crescut semnificativ la nivel mondial, în special la copiii mici, devenind una dintre cele mai frecvente boli respiratorii . Se estimează că 300 de milioane de indivizi sunt afectați de astm în diferite țări .

În prezent, corticosteroizii sunt cele mai eficiente medicamente pentru tratamentul astmului . Deși aceste medicamente pot ameliora simptomele astmului, ele nu vindecă această boală . Acești agenți au, de asemenea, efecte secundare grave, în special la copii, inclusiv supresie imunitară, infecții secundare, atrofie musculară, osteopenie, osteoporoză, cataractă și glaucom . Prin urmare, căutarea continuă a unor medicamente noi, sigure și eficiente este de cea mai mare importanță.

Multe medicamente tradiționale chinezești au fost folosite în tratarea astmului timp de secole și sunt încă utilizate pe scară largă în țările asiatice . Recent, a fost raportat mecanismul de acțiune a numeroase formule pe bază de plante utilizate pentru tratarea astmului alergic . Diverse produse naturale derivate din plante cu proprietăți antiinflamatorii au fost, de asemenea, analizate pentru o potențială aplicare în tratamentul astmului .

Sanglong pingchuan decoction (SLPCD) este un preparat spitalicesc prescris de profesorul Qing Chang, un medic veteran național de medicină tradițională chineză moștenit mentor de studio, în Spitalul de medicină tradițională chineză din Shaoxing. SLPCD este derivat din Shegan Mahuang Tang prin adiție și substracție. Shegan Mahuang Tang este un binecunoscut medicament tradițional chinezesc cu prescripție medicală menționat pentru prima dată în Jin Kui Yao Lve. Ca formulă reprezentativă de disipare a frigului, de ameliorare a sindromului exterior, de încălzire a plămânilor, de eliminare a flegmei și de ameliorare a astmului, Shegan Mahuang Tang este utilizat pe scară largă pentru tratamentul astmului, al bronșitei la copii, al astmului bronșic, al pneumoniei, al bronșitei acute și cronice la vârstnici, al emfizemului și al rinitei alergice . Formula SLPCD a constat din treisprezece medicamente tradiționale chinezești enumerate în tabelul 1. Un studiu randomizat a demonstrat că SLPCD este eficient în tratamentul astmului, în special în ceea ce privește reducerea ratei de exacerbare. Cu toate acestea, eficacitatea SLPCD nu a fost dovedită prin experimente controlate.

În studiul de față, pentru a oferi o bază experimentală pentru aplicarea clinică a SLPCD în tratarea astmului și pentru a explora mecanismele sale de acțiune, folosind modelul de șoarece cu astm alergic indus de OVA, efectele antiinflamatorii ale SLPCD au fost investigate prin examinare histologică, numărarea celulelor imune în lichidul de lavaj bronhoalveolar (BALF), cuantificarea IgE totale în ser, citokine în BALF și expresia ARNm a citokinei în țesuturile pulmonare.

2. Materiale și metode

2.1. Materiale vegetale și reactivi

Cortex Mori (număr de lot: 140901), Pheretima Aspergillum (număr de lot: 150406), Herba Ephedrae prelucrată cu miere (număr de lot: 150302), Rhizoma Belamcandae (număr de lot: 150302), Rhizoma Belamcandae (număr de lot: 141213), Semen Armeniacae Amarum (număr de lot: 150312), Fructus Perillae preparat prin amestecare (număr de lot: 150115), Scorpion (număr de lot: 150126), Semen Descurainiae (număr de lot: 150126), Semen Descurainiae (număr de lot: 150208), Flos Farfarae prăjit în miere (număr de lot: 150301), Herba Houttyniae (număr de lot: 150327), Rhizoma Fagopyri Dibotrydis (număr de lot: 150308), Radix Angelicae Sinensis (număr de lot: 150308), Radix Angelicae Sinensis (număr de lot: 150213) și Radix et Rhizoma Glycyrrhizae (număr de lot: 140917) au fost achiziționate de la Spitalul de medicină chineză din Shaoxing și au fost autentificate de profesorul Yonghai Jiang de la Institutul pentru controlul alimentelor și medicamentelor din Shaoxing, Zhejiang, China. Standardele de acid clorogenic și rutină au fost achiziționate de la Zhejiang Institute for Food and Drug Control, Hangzhou, China, iar puritatea ambilor compuși a fost mai mare de 98%.

Ovalbumina (OVA) a fost achiziționată de la Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO, SUA; kiturile ELISA de detectare a IL-10, IL-13 și IFN-γ de șoarece au fost achiziționate de la Wuhan Boster Biological Technology Co. Ltd., Hubei, China; kitul ELISA IgE de șoarece a fost de la RayBiotech Inc., Norcross, GA, SUA, ser fetal de vițel (FCS) a fost de la Gibco, Grand Island, NY, SUA. Antigenul purificat anti-șoarece CD16/CD32 (bloc de receptori Fc), Ly-6G-FITC (clona: RB6-8C5), antigenul F4/80 PE-Cy5 (clona: BM8), Ly-6C-APC (clona HK1.4), receptorul Fc epsilon Receptor 1 alfa (FceR1)-APC (clona: MAR-1), anticorpii CD117 (c-Kit)-PE-Cy5 (c-Kit, clona: 2B8) și siglec-F-PE (clona: E50-2440) au fost achiziționați de la eBioscience, Inc., San Diego, CA, SUA. Reactivul Trizol a fost achiziționat de la Invitrogen, Carlsbad, CA, SUA; transcriptaza inversă revert Aid™ M-MLV a fost de la Fermentas, Amherst, NY, SUA; inhibitorul de ribonuclează și oligo(dT)18 au fost de la Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd., China; FastStart Universal SYBR Green Master (ROX) a fost de la Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, SUA. Gelul de hidroxid de aluminiu (Alum) a fost achiziționat de la China Animal Husbandry Industry Co., Ltd., Beijing, China; dexametazona (Dex) a fost obținută de la Hubei Tianyao Pharmaceutical Co., Ltd., Xiangyang, China.

2.2. Prepararea SLPCD

Medicamentele prescrise de SLPCD (440 g) au fost macerate în 8 alicote de apă distilată timp de 30 min și apoi apă fiartă timp de 1 h. După primul decoct, drojdiile au fost fierte în 6 alicote de apă distilată timp de încă 30 min. Supernatantul obținut din cel de-al doilea decoct a fost filtrat printr-un tifon steril și concentrat cu ajutorul unui rotavapor (Buchi, Elveția) sub presiune redusă la 65°C până la o concentrație finală de 1,1 g de medicament brut/ml. Decoctul concentrat a fost păstrat la -20°C și ulterior diluat cu apă distilată la mai multe concentrații diferite înainte de utilizare.

2.3. Analiza prin cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC) a SLPCD

Analiza HPLC a fost efectuată utilizând o coloană Diamon C18 (250 mm × 5 mm, 5 μm) și un detector Waters 2996 PDA pe instrumentul HPLC Water 600E. Faza mobilă a fost un amestec de acetonitril (A) și acid fosforic 0,1% (B). S-a efectuat o eluție în gradient liniar, după cum urmează: 0-8 min la 2 % A, 8-35 min la 6 % A, 35-40 min la 8 % A, 40-45 min la 13 % A, 45-70 min la 14 % A, 70-80 min la 17 % A și 80-90 min la 17-2 % A. Debitul a fost de 1 ml/min, iar volumul de injecție a fost de 10 μl. Temperatura coloanei a fost menținută constant la 30°C. Analiza HPLC a standardelor (acid clorogenic și rutină) și a probelor a fost efectuată în condițiile experimentale stabilite, așa cum s-a menționat mai sus.

2.4. Animale experimentale

Soareci BALB/c femele în vârstă de 5 săptămâni au fost achiziționați de la Shanghai Experimental Animal Center of Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China (certificat nr. SCXK 2007-0005). Șoarecii au fost aclimatizați timp de 1 săptămână înainte de utilizare. Hrana de laborator pentru rozătoare și apa de la robinet au fost furnizate ad libitum și au fost menținute în condiții controlate, cu o temperatură de 24 ± 1°C, umiditate de 50 ± 10% și un ciclu lumină/întuneric de 12/12 ore. Toate procedurile au fost în strictă conformitate cu legislația din Republica Populară Chineză privind utilizarea și îngrijirea animalelor de laborator și cu orientările stabilite de Institutul pentru Animale Experimentale al Universității Zhejiang și au fost aprobate de comitetul universitar pentru experimente pe animale.

2.5. Sensibilizarea, provocarea și tratamentul șoarecilor

Soarecii BALB/c de sex feminin au fost împărțiți în șase grupuri: grupul de control normal (NC), grupul de control model (MC), grupul de control pozitiv (tratat cu Dex, 2 mg/kg) și grupurile SLPCD (5,5, 11 și 22 g/kg). Fiecare grup a fost alcătuit din zece șoareci. Inflamația căilor respiratorii ale șoarecilor a fost indusă de OVA. Animalele au fost imunizate prin injectarea intraperitoneală a unei soluții care conținea 50 μg de OVA și 200 μg de hidroxid de aluminiu timp de 3 zile. În ziua 14 a fost administrată o sensibilizare de amplificare. La o săptămână după ultima sensibilizare, șoarecii au fost expuși la OVA 2% aerosolizat cu ajutorul nebulizatorului PARI TurboBOY N (1205) (PARI GmbH, Germania) timp de 1 h pe zi, timp de 8 zile. Cu patru zile înainte de a fi provocați, șoarecilor sensibilizați li s-a administrat pe cale orală SLPCD în doze de 5,5, 11 și 22 g/kg sau au fost injectați intraperitoneal cu 2 mg/kg de dexametazonă (Dex) în fiecare zi, timp de 12 zile. Grupurile model de control au primit același volum de soluție salină. Volumul dozei a fost de 0,2 ml/10 g greutate corporală. Zece șoareci, ca grup de control normal, au fost doar sensibilizați și provocați cu soluție salină. Procedurile utilizate pentru sensibilizarea și provocările cu OVA, precum și tratamentul cu SLPCD, au fost prezentate în figura 1.

Figura 1

Protocol experimental pentru modelul de astm indus de OVA și procesele de tratament.

2.6. Histopatologie pulmonară

Tesuturile pulmonare au fost colectate la 24 h după ultima administrare și apoi fixate cu paraformaldehidă 4%, încorporate în parafină și secționate la grosimi de 5 μm. O serie de microsecțiuni a fost colorată cu hematoxilină și eozină (H&E) pentru evaluare histologică.

2.7. Recoltarea lichidului de lavaj bronhoalveolar (BALF) și citometrie în flux

BALF a fost colectat prin spălarea plămânului cu soluție tamponată cu fosfat (PBS) administrată printr-un cateter endotraheal la 24 h după ultima administrare. BALF a fost centrifugat timp de 5 min și celulele au fost spălate cu PBS rece ca gheața conținând 2% FCS. Celulele au fost blocate cu 0,5 μg de anticorp purificat anti-mouse CD16/CD32 (bloc FcR) timp de 10 min la gheață pentru a inhiba colorarea nespecifică și apoi au fost colorate cu combinația de anticorpi anti-mouse Ly-6G-FITC, antigen F4/80-PE-PE-Cy5 și Ly-6C-APC, sau FceR1-APC, CD117-FITC și Siglec-F-PE la temperatura camerei timp de 30 min la întuneric. Celulele colorate au fost spălate cu PBS rece ca gheața și resuspendate în PBS. O sută de mii de celule viabile pentru fiecare tratament au fost analizate cu ajutorul unui citometru în flux BD FACScan, utilizând software-ul CellQuest.

2.8. Măsurarea anticorpilor IgE totali în ser

Serul a fost colectat la 24 h după ultima administrare. Anticorpul IgE total a fost detectat în probele individuale de ser cu ajutorul kitului RayBio® mouse IgE ELISA. Eșantioanele de ser diluate la 1:1250 sau standardul IgE au fost adăugate la plăci cu 96 de godeuri acoperite cu anticorpi specifici anti-IgE de șoarece. Plăcile au fost incubate timp de 2,5 h la temperatura camerei și apoi au fost spălate de patru ori. Anticorpul de detectare a fost adăugat în fiecare gode. Plăcile au fost incubate la temperatura camerei timp de 1 h înainte de adăugarea de ABC conjugat cu peroxidază de hrean. După o incubare de 45 de minute, plăcile au fost spălate și developate cu TMB timp de 30 de minute la temperatura camerei. Reacția a fost oprită prin adăugarea a 20 μl de soluție de oprire. Absorbția a fost măsurată pe cititorul ELISA (BIO-RAD 680) la 450 nm.

2.9. Măsurarea citokinelor în BALF

Concentrațiile citokinelor Th2 (IL-4, IL-5, IL-10 și IL-13) și Th1 (IFN-γ și IL-2) în BALF au fost detectate folosind kituri ELISA comerciale, așa cum s-a procedat anterior.

2.10. PCR cantitativă în timp real (qRT-PCR)

Nivelurile de expresie ARNm ale citokinelor Th2 (IL-4, IL-5, IL-10 și IL-13) și Th1 (IFN-γ și IL-2) în țesuturile pulmonare au fost determinate cu ajutorul qRT-PCR. ARN-ul total a fost izolat din țesuturile pulmonare omogenizate cu ajutorul reactivului Trizol, în conformitate cu protocolul de fabricație, iar transcrierea inversă a fost efectuată așa cum s-a făcut anterior . Apoi, amplificarea a fost efectuată în reacții de 20 μl cu ajutorul FastStart Universal SYBR Green Master. PCR în timp real a fost efectuată cu ajutorul unui sistem ABI 7400 Real-Time PCR System. Amorsele pentru qRT-PCR au fost sintetizate de Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. (China), iar secvențele au fost enumerate în tabelul 2. Ciclul qPCR a fost efectuat după cum urmează: denaturare inițială la 95°C timp de 10 minute, urmată de 40 de cicluri de denaturare la 95°C timp de 10 s, aneantizare la 60°C timp de 1 minut. GAPDH a fost utilizat ca și control endogen. Eficiența și specificitatea amplificării amorselor au fost verificate pentru fiecare set de primeri. Nivelurile de expresie ale genelor testate în raport cu GAPDH au fost determinate folosind metoda și ca inducție fold .

2.11. Analiză statistică

Datele au fost exprimate ca medie ± deviație standard (SD) și au fost examinate pentru semnificația statistică a diferențelor cu ANOVA și un test Tukey post hoc. -valorile mai mici de 0,05 au fost considerate ca fiind semnificative din punct de vedere statistic.

3. Rezultate

3.1. Profilul HPLC al SLPCD

Conținuturile de acid clorogenic și rutină în SLPCD au fost analizate cu ajutorul HPLC. În comparație cu compușii de referință standard, acidul clorogenic și rutina au fost identificate și determinate (figura 2). Ecuațiile de regresie din curba de calibrare a standardelor au fost A = 3719,7C – 102166 (R2 = 0,9999) și A = 9137,3C – 408038 (R2 = 0,9996) pentru acidul clorogenic și, respectiv, rutină. Concentrațiile de acid clorogenic și rutină în SLPCD au fost de 1,4 mg/g și, respectiv, 0,15 mg/g.

(a)

(b)

.
(a)
(b)

Figura 2

Cromatograme HPLC ale SLPCD. Au fost prezentate cromatograme reprezentative ale compușilor standard de referință (a) și ale SLPCD (b). ① Acid clorogenic și ② rutină.

3.2. SLPCD a atenuat inflamația căilor respiratorii la șoarecii astmatici

Efectul SLPCD asupra inflamației pulmonare la șoarecii astmatici induse de OVA a fost observat prin colorația H&E, iar rezultatele au fost prezentate în figura 3. Șoarecii model de astm au prezentat o infiltrare mai gravă a celulelor inflamatorii interstițiale, peribronhiolare și perivasculare în plămân, în comparație cu șoarecii de control normali. Ca un control pozitiv, Dex a ameliorat semnificativ infiltrarea celulelor inflamatorii interstițiale, peribronhiolare și perivasculare din plămâni la șoarecii cu astm. Infiltratele inflamatorii din plămânii șoarecilor provocați cu OVA au fost, de asemenea, atenuate semnificativ de SLPCD în comparație cu modelul de control.

(a)

(b)

(c)

.

(d)

(e)

(f)

(f)

.
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)

3.3. SLPCD a redus celulele inflamatorii în BALF-ul șoarecilor astmatici

Pentru a verifica efectele SLPCD asupra infiltrării celulelor inflamatorii în plămânul șoarecilor astmatici induși de OVA, numărarea celulelor inflamatorii, inclusiv a eozinofilelor (Sigilec F+), a bazofilelor (CD117+), a neutrofilelor (Ly-6C+y-6), a macrofagelor (F4/), a monocitelor (Ly6G-Ly6C+) și a mastocitelor (FcER1+) în BALF a fost realizată prin citometrie în flux. După cum se arată în figura 4, numărul de eozinofile (de 1756 ori), macrofage (de 114 ori), neutrofile (de 110 ori), bazofile (de 91,7 ori), monocite (de 45,8 ori) și mastocite (de 6,9 ori) în BALF de la șoarecii astmatici a fost semnificativ crescut în comparație cu șoarecii de control normali. Dex a scăzut semnificativ numărul unei varietăți de celule inflamatorii testate în BALF-ul șoarecilor astmatici (), aproape aproape de nivelurile șoarecilor normali. Numărul acestor celule inflamatorii din BALF de la șoarecii astmatici a fost redus semnificativ în funcție de doză de către SLPCD în comparație cu grupul de control model (, , sau ).

Figura 4

Efectul SLPCD asupra recrutării celulelor inflamatorii în BALF la șoarecii cu astm indus de OVA. BALF-ul a fost colectat la 24 h după ultima administrare și compoziția celulară a fost analizată prin FACS descrisă în text. Valorile sunt prezentate ca medii ± SD (). Diferențele semnificative în comparație cu grupul de control al modelului astmatic (MC) sunt desemnate ca , , și . Dex: dexametazonă (control pozitiv), NC: grup de control normal.

3.4. SLPCD a diminuat nivelul seric al IgE totale la șoarecii astmatici

Efectele SLPCD asupra nivelului seric al IgE totale la șoarecii astmatici au fost prezentate în figura 5. Nivelurile serice totale de anticorpi IgE la șoarecii astmatici au fost semnificativ mai mari decât la șoarecii de control normali (). Ca medicament pozitiv, Dex a scăzut semnificativ nivelurile serice totale de anticorpi IgE la șoarecii astmatici induși de OVA (). Nivelurile serice totale de anticorpi IgE la șoarecii astmatici au fost diminuate semnificativ în funcție de doză de către SLPCD în comparație cu grupul de control model ().

Figura 5

Efectele SLPCD asupra nivelurilor de IgE totale în serul șoarecilor cu astm indus de OVA. Serul a fost colectat la 24 h după ultima administrare și nivelurile de IgE totală au fost măsurate cu ajutorul kiturilor ELISA descrise în text. Valorile sunt prezentate ca medii ± SD (). Diferențele semnificative în comparație cu grupul de control al modelului astmatic (MC) sunt desemnate ca fiind . Dex: dexametazonă (control pozitiv) și NC: grup de control normal.

3.5. SLPCD a modulat nivelurile de citokine în BALF-ul șoarecilor astmatici

Nivelurile de citokine Th2 (IL-4, IL-5, IL-10 și IL-13) și Th1 (IFN-γ și IL-2) în BALF au fost măsurate prin ELISA. După cum se arată în figura 6, provocarea cu OVA a dus la creșterea semnificativă a nivelului de IL-10 și IL-13 și la scăderea nivelului de IFN-γ în BALF-ul șoarecilor astmatici în comparație cu grupul de control normal ( sau ). Cu toate acestea, conținutul de IL-4, IL-5 și IL-2 în BALF al șoarecilor model de control s-a dovedit a fi foarte scăzut și aproape de limita de detecție. Administrarea de SLPCD în trei doze și de Dex a redus semnificativ nivelurile de IL-13 și IL-10, precum și a ridicat în mod remarcabil nivelul de IFN-γ în BALF-ul șoarecilor astmatici induse de OVA în comparație cu șoarecii model de control ( sau ) (Figura 6).

Figura 6

Efectele SLPCD asupra nivelurilor de citokine în BALF la șoarecii cu astm indus de OVA. BALF a fost colectat la 24 h după ultima administrare. Nivelurile de citokine Th1 (IL-10 și IL-13) și Th1 (IFN-γ) în BALF au fost măsurate cu ajutorul kiturilor ELISA descrise în text. Valorile sunt prezentate ca medii ± SD (). Diferențele semnificative în comparație cu grupul de control al modelului astmatic (MC) sunt desemnate ca și . Dex: dexametazonă (control pozitiv) și NC: grup de control normal.

3.6. SLPCD a reglat nivelurile de expresie a ARNm a citokinelor în țesuturile pulmonare ale șoarecilor astmatici

Efectele SLPCD asupra expresiei ARNm a citokinelor de tip Th1 și Th2 în țesuturile pulmonare ale șoarecilor astmatici induse de OVA au fost detectate cu ajutorul qRT-PCR, iar rezultatele au fost prezentate în tabelul 3. În comparație cu șoarecii de control normali, nivelurile de expresie ale ARNm ale citokinelor Th2 (IL-4, IL-5, IL-10 și IL-13) au fost semnificativ crescute, iar cele ale ARNm ale citokinelor Th1 (IL-2 și IFN-γ) au fost semnificativ reduse în țesuturile pulmonare ale șoarecilor astmatici (P < 0,001). Administrarea de SLPCD în trei doze și Dex a dus la reducerea semnificativă a nivelurilor de expresie ARNm ale citokinelor Th2 IL-4, IL-5, IL-10 și IL-13 și la creșterea celor ale citokinelor Th1 IL-2 și IFN-γ în țesuturile pulmonare de la șoarecii astmatici, comparativ cu grupurile de modele astmatice (P < 0,05, P < 0,01 sau P < 0,001).

4. Discuție

Astmul a devenit o problemă de sănătate publică la nivel mondial, în special în țările dezvoltate . Glucocorticoizii reprezintă terapia de primă linie pentru tratamentul și controlul astmului. Deși aceste medicamente ar putea îmbunătăți simptomele astmului, acestea au fost strict controlate pentru utilizarea persistentă din cauza efectelor secundare grave ale acestora . Astfel, sunt necesare noi abordări terapeutice pentru astmatici. Multe medicamente tradiționale chinezești prezintă diverse activități biologice, inclusiv efecte antibacteriene, antifungice, antiinflamatorii, antianafilaxice și imunomodulatoare, care au potențial pentru tratamentul astmului. Au fost descrise diverse modele de inflamație bronhopulmonară alergică la șoarecii experimentali. Modelul de șoarece cu astm alergic indus de OVA reproduce multe caracteristici ale astmului uman, care a câștigat o largă acceptare . Prin urmare, am investigat efectele antiastmatice ale SLPCD și am explorat mecanismele sale moleculare folosind acest model.

SLPCD este format din 13 medicamente tradiționale chinezești. Cortex Mori, Pheretima Aspergillum și Herba Ephedrae sunt componenta primară care dispersează plămânul și ameliorează astmul. Semen Armeniacae Amarum, Fructus Perillae amestecat, Semen Descurainiae și Flos Farfarae prăjit în miere sunt componente auxiliare care reduc flegma, ameliorează tusea și astmul. Componentele adjuvante includ Rhizoma Belamcandae, Herba Houttyniae și Rhizoma Fagopyri Dibotrydis care îndepărtează răul căldurii și expulzează relele superficiale, precum și Scorpionul și Radix Angelicae Sinensis care dispersează staza sanguină, draghează colateralele, spasmolează și stopează astmul. Radix et Rhizoma Glycyrrhizae armonizează toate medicamentele. Luate împreună, toate componentele se completează reciproc pentru a obține rezultatele de dispersare a plămânilor, de coborâre a Qi și de ameliorare a tusei și a astmului. Controlul calității SLPCD utilizat în acest studiu a fost realizat cu ajutorul HPLC, iar două substanțe chimice de referință (acidul clorogenic și rutina) au fost identificate ca fiind componente majore ale indicelui (figura 2).

Astmul alergic este definit ca o boală inflamatorie acută-cronică a căilor respiratorii cu recrutare eozinofilă caracteristică, hiperplazie a celulelor caliciforme, hipersecreție de mucus, depunere de colagen, hipertrofie a celulelor musculare netede și fibroză subepitelială . În acest studiu, efectele tratamentului cu SLPCD asupra inflamației pulmonare la șoarecii astmatici provocați cu OVA au fost evaluate prin colorația H&E. Acumularea alergică tipică și infiltrarea de celule inflamatorii au fost observate în țesuturile pulmonare ale șoarecilor model astmatic. Tratamentul cu SLPCD a redus infiltratele inflamatorii în țesuturile pulmonare ale șoarecilor astmatici (Figura 3), sugerând că SLPCD a atenuat în mod semnificativ inflamația căilor respiratorii.

Celele imune inflamatorii joacă un rol cheie în patogeneza și severitatea astmului . Celulele inflamatorii recrutate din ganglionii limfatici regionali către căile respiratorii ar putea secreta citokine și chemokine, ducând la hiperreactivitatea căilor respiratorii . Reducerea celulelor inflamatorii din căile respiratorii este o modalitate eficientă de tratare a astmului . Pentru a confirma că SLPCD poate inhiba infiltrarea celulelor inflamatorii, am numărat în continuare eozinofilele, macrofagele, neutrofilele, bazofilele, monocitele și mastocitele din BALF. Inhalarea de OVA a dus la creșteri semnificative ale numărului acestor șase tipuri de celule inflamatorii în BALF (Figura 4). Gradele de creștere au fost de 1756, 114, 110, 91,7, 45,8 și 6,9 ori pentru eozinofile, macrofage, neutrofile, bazofile, monocite și, respectiv, mastocite, ceea ce indică o stabilire satisfăcătoare a unui model de astm exacerbat în acest studiu. Tratamentul cu SLPCD a diminuat în mod semnificativ și dependent de doză numărul acestor celule inflamatorii, în special al eozinofilelor, în BALF în comparație cu șoarecii astmatici (figura 4). Aceste rezultate au sugerat că SLPCD a redus infiltrarea celulei inflamatorii în plămân la șoarecii astmatici induși de OVA, fiind în concordanță cu rezultatele observației histopatologice.

Este bine cunoscut faptul că ridicarea nivelului de anticorpi IgE a fost corelată cu inflamația alergică a căilor respiratorii și hiperreactivitatea bronșică la șoarecii model de astm . Coyle și colab. au raportat că anticorpii anti-IgE au atenuat inflamația eozinofilică a căilor respiratorii și hiperreactivitatea bronșică la șoarecii astmatici. IgE induse de alergeni au declanșat eozinofilele, bazofilele și mastocitele pentru a secreta citokinele IL-4, IL-5, IL-10 și IL-13 . Prin urmare, am evaluat nivelurile serice totale de IgE și am constatat că SLPCD ar putea reduce semnificativ nivelurile serice totale de IgE la șoarecii astmatici provocați cu OVA (Figura 5).

Dezechilibrul celulelor Th1/Th2 este considerat a fi cauza imunologică a astmului . În astm, activitatea celulelor Th1 este redusă, în timp ce activitatea celulelor Th2 este activată, ceea ce duce la o creștere a citokinelor de tip Th2 și o scădere a citokinelor Th1 . Celulele Th2 migrate în plămâni secretă citokinele prototipice de tip Th2 IL-4, IL-5 și IL-13, ceea ce duce la hiperplazia celulelor caliciforme, bronhoconstricție și eozinofilie în căile respiratorii . In vitro, IL-13 poate media producția de IgE și poate juca un rol-cheie în patogeneza bolilor alergice mediate de IgE . IL-13 poate, de asemenea, spori supraviețuirea eozinofilelor și poate contribui la activitățile patologice ale acestor celule în astm . Șoarecii care supraexprimă IL-13 reproduc mai multe caracteristici ale astmului, inclusiv eozinofilia pulmonară, hiperplazia epitelială, obstrucția căilor respiratorii și hiperrăspunsul la colinergici.

Supresia producției de citokine Th2 s-ar dovedi utilă pentru imunoterapia cu alergeni . Pe de altă parte, celulele activate de Th1 pot inhiba inflamația căilor respiratorii astmatice . Citokinele Th1, cum ar fi IFN-γ, inhibă recrutarea de eozinofile indusă de alergeni și eliberarea de IgE prin intermediul downregulării expresiei GATA-3, IL-4 și IL-5 în țesuturile pulmonare ale modelului de astm . În acest studiu, am estimat efectul SLPCD asupra nivelurilor de citokine în BALF de la șoarecii astmatici. Rezultatele au arătat că SLPCD nu numai că a redus în mod dependent de doză nivelurile de IL-13 și IL-10, dar a crescut și nivelul de IFN-γ în BALF-ul șoarecilor astmatici (Figura 6). Acțiunea inhibitorie a tratamentului cu SLPCD asupra producției de citokine Th2 a fost în concordanță cu efectul său asupra nivelurilor de IgE totală în ser.

A fost raportat că IL-5 joacă un rol important în proliferarea, diferențierea, maturizarea și migrarea la locurile de țesut a eozinofilelor . Nivelurile de expresie ale ARNm al IL-5 în biopsiile bronșice de la astmatici au fost suprareglate în comparație cu controalele neastmatice . Nivelurile de expresie ARNm ale IL-5 au fost corelate cu severitatea clinică a astmului. Provocarea alergenică cumulativă a crescut expresia ARNm a IL-4 în celulele BALF și în celulele T CD4+ și CD8+ periferice. IL-10 au fost, de asemenea, indicate ca fiind implicate în astm. Creșterea transcrierilor IL-13 în celulele BAL ale pacienților cu astm ușor după provocarea cu doze mici de alergen este în concordanță cu nivelul mai ridicat de expresie a ARNm IL-13 în mucoasa bronșică . Efectele tratamentului cu SLPCD asupra nivelului de expresie a ARNm al citokinelor în țesuturile pulmonare de la șoarecii astmatici au fost determinate în continuare prin qRT-PCR. Tratamentul cu SLPCD a redus semnificativ nivelul de expresie a ARNm al citokinelor Th2 (IL-4, IL-5, IL-10 și IL-13) și l-a crescut pe cel al citokinelor Th1 (IL-2 și IFN-γ) în plămânii șoarecilor astmatici. Aceste rezultate au confirmat în continuare efectele de reglementare ale tratamentului cu SLPCD asupra răspunsurilor citokinelor Th1 și Th2 în țesuturile pulmonare ale șoarecilor astmatici.

În concluzie, SLPCD ar putea inhiba în mod semnificativ inflamația căilor respiratorii, ar putea reduce celulele inflamatorii din BALF, ar putea scădea nivelurile serice totale de IgE și ar putea modula conținutul de citokine din BALF și expresia ARNm a citokinelor în plămânii șoarecilor astmatici. Aceste rezultate au sugerat că SLPCD ar putea să atenueze inflamația căilor respiratorii și să atenueze patogeneza într-un model de astm la șoareci prin inducerea unui răspuns echilibrat Th1/Th2 și să valideze utilizarea sa clinică ca medicament eficient în tratamentul astmului.

Dezvăluiri

Adresa actuală a lui Binnian Zhu este ACON Biotech (Hangzhou) Co., Ltd.., Hangzhou 310030, China.

Conflicte de interese

Autorii declară că nu există conflicte de interese.

Contribuții ale autorilor

Binnian Zhu și Jun Dong au contribuit în mod egal la această lucrare de cercetare.

Recunoștințe

Această lucrare a fost susținută de Grant-in-Aid din partea Proiectului de Știință și Tehnologie Shaoxing (nr. 2014B700722).

.