Efectele citotoxice și genotoxice ale acefatului asupra spermei umane

Abstract

Utilizarea extensivă a pesticidelor organofosforice (OP) ar putea altera calitatea materialului seminal și ADN-ul spermei în diferite stadii ale spermatogenezei. Acefatul este un OP extrem de toxic utilizat pe scară largă și, prin urmare, ne-am propus să evaluăm efectele acefatului asupra calității spermei umane și a integrității ADN-ului spermatic. Spermatozoizii recoltați de la bărbați sănătoși au fost expuși la 0, 50, 100 și 200 μg/mL de acefat și au fost incubați timp de 1 h, 2 h și 3 h. Ulterior, au fost examinate motilitatea spermatozoizilor, vitalitatea, integritatea funcțională a membranei plasmatice, capacitarea spermatozoizilor și deteriorarea ADN-ului. Rezultatul a arătat o scădere semnificativă a motilității la 100 μg/mL după 3 h și cu 200 μg/mL după 1 h, 2 h și 3 h. Viabilitatea a fost semnificativ redusă la 200 μg/mL după 2 h și 3 h. Integritatea funcțională a fost semnificativ afectată la 100 μg/mL după 3 h și în doza de 200 μg/mL după 2 h și 3 h. În mod similar, capacitarea spermatozoizilor a fost semnificativ afectată la 200 μg/mL după 1 h, 2 h și 3 h și la 100 μg/mL după 3 h. Deteriorarea ADN-ului a fost semnificativ crescută doar la doza de 200 μg/mL după 3 h. Studiul sugerează că expunerea la acefat poate duce la alterarea structurii și funcției spermatozoizilor, contribuind astfel la deteriorarea calității spermei umane, declanșând infertilitatea.

1. Introducere

În ultimele câteva decenii, mai multe studii au arătat distrugerea funcției de reproducere la animale și la oameni din cauza substanțelor chimice de origine umană și a altor substanțe toxice . Din păcate, relativ puține studii au abordat în mod sistematic impactul expunerii la mediul înconjurător asupra sănătății reproductive umane. Conform unor studii recente, în fiecare an, la nivel mondial, cuplurile care suferă de infertilitate (care nu reușesc să conceapă după 12 luni de relații sexuale neprotejate regulate) reprezintă aproximativ 60-80 de milioane . Nouăzeci și opt la sută din cazurile de subfertilitate masculină pot fi atribuite în principal calității deficitare a spermatozoizilor . Cu toate acestea, subfertilitatea poate fi considerată idiopatică și ar putea fi rezultatul unor factori de risc, cum ar fi perturbatorii endocrini din mediu, inclusiv pesticidele.

Pesticidele organofosforice sunt esteri ai acizilor fosforici și tiofosforici, iar toxicitatea lor a fost legată de capacitatea lor de a inhiba acțiunea acetilcolinesterazei, ceea ce duce la acumularea de acetilcolină la nivelul joncțiunilor nervoase . Numeroase studii epidemiologice au recunoscut asocierea dintre expunerea la pesticide organofosforice (OP) și tulburările de reproducere, cum ar fi infertilitatea, malformațiile congenitale, rezultatele adverse ale sarcinii și decesele perinatale . Se suspectează că pesticidele organofosforice modifică funcția de reproducere prin reducerea activității acetilcolinesterazei cerebrale, afectând gonadotropina hipofizară care provoacă infertilitate . Efectele asupra calității materialului seminal ar putea fi evaluate prin parametri precum concentrația de spermatozoizi, procentul de spermatozoizi motili și procentul de spermatozoizi cu morfologie normală, împreună cu parametrii de mișcare a spermatozoizilor. Mai multe studii au arătat că bărbații expuși la OP au prezentat un risc ridicat de a dezvolta parametri anormali ai spermei, inclusiv scăderea concentrației de spermatozoizi, scăderea motilității spermatozoizilor, scăderea numărului de spermatozoizi și o aneuploidie mai mare a cromozomilor sexuali în spermă . Un studiu efectuat în China cu diferite OP a arătat o relație clară între prezența metaboliților insecticidelor urinare și concentrația și motilitatea spermatozoizilor la bărbații proaspăt căsătoriți . Studiile in vitro efectuate cu OP au furnizat dovezi că aceste pesticide ar putea deteriora ADN-ul din sperma umană, provocând astfel efecte genotoxice .

Printre OP-urile utilizate pe scară largă și toxice în Sri Lanka, acefatul (O,S-dimetil acetilfosforamidotioat) este un insecticid, utilizat în agricultură și în scopuri domestice datorită proprietății sale de insecticid cu spectru larg. Acefatul este un insecticid sistemic cu acțiune de contact și gastrică. Mecanismul toxic al acefatului este atribuit nu numai inhibării acetilcolinesterazei (AchE), ci și acționării ca agent neurotoxic întârziat . Sing și Jiang au raportat că acefatul este un compus puternic neurotoxic, mutagen, carcinogen și citotoxic. În mod similar, Farag și colab. au arătat că dozele de 14 și 28 mg/kg/zi de acefat au scăzut motilitatea spermei și numărul de spermatozoizi la șoarecii masculi adulți. Alte două studii au confirmat că acefatul scade semnificativ fertilitatea, dinamica spermatozoizilor, greutatea organelor sexuale și hormonii sexuali la șobolanii albino masculi . Prin urmare, la fel ca și în cazul altor OP, există un risc potențial al acestui compus asupra sănătății reproductive a oamenilor.

Acefatul este utilizat pe scară largă de către agricultorii din Sri Lanka, care se află în prima lor vârstă reproductivă. În ultimele două-trei decenii, a devenit clar că expunerea profesională la pesticide ar putea afecta fertilitatea bărbaților , indicând astfel riscuri ridicate de expunere a acestor tineri agricultori. Reglementarea pesticidelor se bazează în principal pe modele animale, iar datele privind expunerea umană și calitatea materialului seminal continuă să fie puține și limitate. Prin urmare, studiul de față a fost realizat pentru a investiga efectele acefatului asupra fertilității masculine umane și a integrității ADN-ului spermatozoizilor in vitro.

2. Materiale și metode

2.1. Material de testare

Acefat neformulat (denumire comercială: Surrender; formulă moleculară: C4H10NO3PS; greutate moleculară: 183,16 g/mol; puritate: 99,0%; doza de câmp recomandată de producător: 1 g de acefat în 1 L de apă) a fost obținută de la Hayleys Agriculture Ltd., Colombo, Sri Lanka. Deoarece acefatul este ușor solubil în Biggers Whitten Whittingham (BWW), acesta a fost utilizat ca martor.

2.2. Colectarea și prepararea materialului seminal

Eșantioanele de material seminal au fost colectate de la donatori sănătoși de sex masculin (vârsta 20-30 de ani) de la Universitatea din Sri Jayewardenepura, Sri Lanka, într-o fiolă de probă sterilă. Înainte de recoltarea materialului seminal, donatorii au primit o foaie de informații și un formular de consimțământ prin care se solicita dorința lor de a participa la studiu. Toți subiecții participanți au fost rugați să se abțină de la orice activitate sexuală timp de 3 până la 5 zile înainte de colectarea materialului seminal. Bărbații (vârsta medie de ) cu o concentrație normală de spermatozoizi, motilitate, morfologie, vâscozitate, timp de lichefiere și pH și absența formelor imature și a leucocitelor au fost selectați pentru studiu. Parametrii spermei (motilitatea, vitalitatea, testul de umflare hipoosmotică și morfologia) au fost evaluați în conformitate cu orientările Organizației Mondiale a Sănătății . Deoarece efectele acefatului s-ar putea amplifica în cazul spermatozoizilor anormali, este important să se selecteze donatori cu o calitate acceptabilă a spermei pentru studiu.

Aprobarea etică (numărul de referință al autorizației etice: 712/13) a fost obținută de Comitetul de evaluare etică, Facultatea de Științe Medicale, Universitatea din Sri Jayewardenepura, Nugegoda, Sri Lanka.

2.3. Determinarea nivelurilor de doză

Pentru a determina nivelurile de doză, s-a efectuat valoarea LD50 a acefatului pentru motilitatea spermatozoizilor. Prin urmare, s-a preparat un eșantion cu 1 mg de acefat în 1 ml de BWW, care este echivalent cu doza de acefat recomandată pe teren (1 g de acefat în 1 L de apă) de acefat. Probele preparate au fost ulterior diluate cu BWW pentru a obține diferite concentrații de acefat. Suspensiile de spermatozoizi (fixate la 50 × 106 spermatozoizi/mL) au fost plasate în tuburi Eppendorf și s-a adăugat volumul dorit fie de BWW, fie de soluție de testare (volumul final al tubului este egal cu 1 ml). Probele au fost bine amestecate, iar apoi au fost incubate timp de 1 h într-un incubator umidificat (Sanyo Electric Co. Ltd., Tokyo, Japonia) la 37°C cu 5% CO2. După incubare, motilitatea procentuală a spermatozoizilor a fost determinată la fiecare concentrație de către doi observatori independenți la microscopul Olympus cu optică cu contrast de fază (X 400; Olympus Corporation, Japonia). Pe baza acestui studiu pilot pentru a determina indicațiile privind dozele toxice pentru probele de material seminal, s-a constatat că valoarea LD50 pentru acefat este de 200 μg/mL. Prin urmare, în studiul de față au fost utilizate concentrații subletale sub LD50, inclusiv valoarea LD50.

Date mai jos sunt nivelurile de doză selectate pentru studiul de față: Doza mare: 200 μg/mL (echivalentă cu valoarea LD50). Doza medie: 100 μg/mL. Doza mică: 50 μg/mL.Mai mult, am decis să extindem punctele de timp de la 1 h la 2 h și 3 h pentru a determina efectele prelungite ale expunerii la acefat.

2.4. Incubarea cu pesticide

Eșantioanele de material seminal proaspăt () au fost diluate cu BWW pentru a obține o concentrație finală de spermatozoizi de 40 × 106 spermatozoizi/mL. Ulterior, probele au fost incubate fie cu pesticide la concentrații de 50, 100 și 200 μg/mL, fie cu BWW. Incubațiile au fost efectuate în 1 ml de volum final timp de 1, 2 și 3 h la 37°C într-un incubator (Sanyo Electric Co. Ltd., Tokyo, Japonia) în atmosferă de 5% CO2 și 95% O2.

2.5. Determinarea motilității spermatozoizilor

Spermatozoizii mobili totali au fost estimați (aproximativ 100 de celule) de către doi observatori independenți sub optică cu contrast de fază (X 400; Olympus Corporation, Japonia). S-a calculat procentul de motilitate înainte.

2.6. Testul de citotoxicitate

Viabilitatea spermatozoizilor a fost evaluată prin tehnica de colorare cu Eozină Y și s-au calculat spermatozoizii morți și vii. Procentul de viabilitate = (numărul total de celule – numărul de celule colorate/numărul total de celule) × 100. Numărul total de celule = 100.

2.7. Determinarea integrității funcționale a membranei plasmatice a spermatozoizilor

Integritatea funcțională a membranei plasmatice a spermatozoizilor a fost evaluată cu ajutorul testului Hypoosmotic Swelling (HOS) descris de Jeyendran și colab. . S-au numărat cel puțin 100 de spermatozoizi per preparat.

2.8. Determinarea capacității

O alicotă de 150 μL de mediu BWW a fost plasată într-o farfurie de cultură preîncălzită (35 × 10 mm, Corning, New York, SUA) și acoperită cu un capac preîncălzit de 22 × 22 mm. Pe un colț al dischetei s-a adăugat o alocație de 20 μL de probă de spermă. Vasul de cultură a fost plasat într-un microscop inversat (Diaphot, Nikon, Londra, Regatul Unit) echipat cu o cabină încălzită cu aer controlat termostatic (Nikon, Londra, Regatul Unit) echilibrată la 37 °C. Starea de capacitare a spermatozoizilor a fost evaluată pe baza hiperactivării prin metoda fotografică obiectivă cu ajutorul unui microscop cu contrast de fază Olympus IX71. Deoarece hiperactivarea este un fenomen de flagelare, este posibilă evaluarea vizuală a hiperactivării pe baza motilității spermatozoizilor; modelele de mișcare a flagelului au fost evaluate pentru enumerarea spermatozoizilor nehiperactivați și hiperactivați . Experimentele au fost efectuate în dublu exemplar și repetate independent de patru ori.

2.9. Determinarea deteriorării ADN-ului în spermatozoizi

Spermatozoizii au fost pregătiți pe lame microscopice curățate și procentul de spermatozoizi cu ADN normal a fost determinat prin numărarea a 500 de spermatozoizi sub microscopie cu fluorescență (BH-2, Olympus Ltd., Japonia) cu excitație de 490 nm. Perioada de timp de observare pentru un singur câmp a durat mai puțin de 40-50 de secunde. Spermatozoizii care prezintă o culoare galbenă spre roșu au fost considerați ADN denaturat, iar spermatozoizii care prezintă o culoare verde au fost considerați ADN normal .

2.10. Analiză statistică

Conturile de spermatozoizi ai masculilor adulți au fost distribuite în mod normal și au fost comparate între grupuri cu o analiză de varianță (ANOVA) în două direcții, utilizând pachetul software Minitab (Minitab Co., SUA) pentru efectul principal al pesticidelor. În cazul în care s-a constatat un efect semnificativ al tratamentului, diferențele dintre mediile grupurilor individuale au fost testate prin „Tukey 95%”. Datele sunt exprimate ca medie ± Eroare standard medie (SEM). valoarea a fost stabilită la .

3. Rezultate

3.1. Motilitatea spermatozoizilor

În comparație cu martorul, motilitatea procentuală a fost semnificativ () scăzută (Tabelul 1) la doza medie (100 μg/mL) cu 16% după 3 h de incubare. În schimb, o reducere foarte semnificativă () a fost înregistrată la 200 μg/mL după 1 h, 2 h și 3 h de incubație, comparativ cu martorii. Mai mult, reducerea motilității este clară în fiecare doză odată cu creșterea timpului de incubare.

3.2. Citotoxicitate

Procentul de viabilitate a scăzut (tabelul 1) în toate grupele de tratament odată cu trecerea timpului, dar o reducere semnificativă (cu 20%; ) a fost înregistrată la 200 μg/mL (doza mare) după 2 h de la incubare, în comparație cu martorii. O reducere extrem de semnificativă () a fost înregistrată în doza mare după 3 h de incubare și a scăzut cu 31% în comparație cu martorul.

3.3. Integritatea funcțională a membranei plasmatice a spermatozoizilor

Tabelul 1 prezintă rezultatele privind integritatea funcțională a spermatozoizilor după 1 h, 2 h și 3 h de incubație. Reduceri semnificative () ale integrității funcționale au fost înregistrate în doza medie cu 13.5% după 3 ore și, de asemenea, în doze mari, cu 26% după 2 ore de incubare, în comparație cu martorii lor. O reducere extrem de semnificativă () a fost înregistrată la doza mare (cu 35%) după 3 h de incubare.

3.4. Capacitarea spermatozoizilor

Reducerea numărului de spermatozoizi capacitați a fost observată în toate grupurile de tratament (tabelul 1). Procentul de spermatozoizi capacitați a fost redus semnificativ () în doza de 100 μg/mL cu 18% după 3 h de incubație și la doza mare cu 32%, 36% și, respectiv, 38%, după 1 h, 2 h și 3 h de incubație.

3.5. Deteriorarea ADN în spermatozoizi

Procentul de spermatozoizi cu ADN deteriorat a crescut odată cu creșterea dozei și a timpului de incubare. Dar o creștere semnificativă () a deteriorării ADN a fost înregistrată numai la doza mare (cu 33%) după 3 h de incubare. Rezultatele sunt rezumate în tabelul 1.

4. Discuție

Insecticidele OP sunt utilizate pe scară largă în Sri Lanka cu o protecție redusă sau inexistentă din partea utilizatorilor și, prin urmare, indivizii sunt expuși unui risc ridicat de expunere. Mai mult decât atât, acești agricultori aflați la vârste reproductive sunt inevitabil expuși pe o perioadă lungă de timp. Studiul de față a fost conceput pentru a demonstra asocierea dintre acefat, un OP cu calitatea materialului seminal, și deteriorarea ADN-ului în spermatozoizi pe diferite perioade de timp de incubare. Rezultatele obținute în cadrul prezentului studiu au indicat faptul că acefatul afectează motilitatea spermatozoizilor, viabilitatea spermatozoizilor, integritatea membranei și capacitarea spermatozoizilor și a indus leziuni ale ADN-ului in vitro. Rezultate similare au fost obținute cu hidrocarburi clorurate , organofosfați și metaboliți ai benzenului .

Reducerea semnificativă a motilității spermatozoizilor observată atât la doze medii (100 μg/mL), cât și la doze mari (200 μg/mL) de acefat ar putea duce la afectarea capacității de fertilizare a spermatozoizilor . După 3 h de expunere la cea mai mare doză, motilitatea procentuală a spermatozoizilor a fost redusă sub valorile recomandate de OMS. Motilitatea spermatozoizilor este considerată a fi unul dintre cei mai sensibili detectori ai efectelor citotoxice asupra spermatozoizilor și ai reducerii capacității de fertilizare a spermatozoizilor. Modificările potențialului membranei mitocondriale de către diferite pesticide ar putea duce la reducerea motilității spermatozoizilor . Motilitatea spermatozoizilor depinde, de asemenea, de transformarea intensă și de cheltuiala de energie produsă prin intermediul căilor oxidative ale mitocondriilor, iar pesticidele ar putea interfera cu căile oxidative, producând o motilitate întârziată a spermatozoizilor, ducând în cele din urmă la moartea celulelor . Mai mult, metaboliții pesticidelor ar putea interfera cu reacțiile oxidative mitocondriale, ceea ce ar duce la producerea unui exces de specii reactive de oxigen (ROS), reducând producția de ATP, ceea ce duce la afectarea motilității . S-a raportat că stresul oxidativ este mecanismul principal al toxicității organofosfaților, inclusiv a acefatului. Pierderea integrității poate duce la o creștere a permeabilității membranei și la pierderea capacității de a regla concentrațiile intracelulare de ioni implicați în controlul mișcării spermatozoizilor . Efectul global al deteriorării membranei ar putea fi responsabil pentru scăderea continuă a motilității și viabilității spermatozoizilor după ejaculare .

Viabilitatea este proporția de spermatozoizi vii determinată prin evaluarea integrității celulare și/sau a membranei . Testul de colorare cu eozină a furnizat informații privind integritatea structurală a membranei spermatozoizilor, în timp ce testul HOS a furnizat informații privind integritatea funcțională a membranei spermatozoizilor . Viabilitatea spermatozoizilor este asociată cu membrane plasmatice intacte, funcționale și semipermeabile . Pesticidele ar putea induce o creștere a ionilor de calciu, provocând deteriorarea membranelor spermatozoizilor, afectând astfel viabilitatea spermatozoizilor cu mult înainte ca aceștia să ajungă la ovocite . Modificările membranei plasmatice observate în studiul de față ar putea duce la reducerea motilității spermatozoizilor, a viabilității și a integrității membranei .

Hiperactivarea este într-o indicație a finalizării capacitivării spermatozoizilor și este esențială pentru penetrarea prin masa cumulus și zona pellucida . În studiul de față s-a demonstrat că spermatozoizii hiperactivați au scăzut în concentrație mare și au scăzut odată cu creșterea timpului de incubare, indicând o capacitare deficitară a spermatozoizilor. Membrana spermatozoizilor și mitocondriile sunt esențiale în alimentarea hiperactivării și orice deteriorare a membranei spermatozoizilor și a mitocondriilor spermatozoizilor poate duce la reducerea numărului de spermatozoizi capacitați . Se știe că OP afectează capacitarea prin inhibarea AchE atunci când este incubat cu spermatozoizi in vitro . Cu toate acestea, la adăugarea în mediu a unor cantități suficiente de AchE sau de enzime mimice ale AchE, efectul a fost inversat , indicând astfel importanța activității AchE din membrana spermatozoizilor pentru a iniția capacitarea.

Studiul de față relevă o deteriorare semnificativă a ADN-ului bicatenar la cea mai mare doză (200 μg/mL) după 3 h de incubare. Integritatea ADN-ului spermatozoizilor este vitală pentru a transmite informația genetică în timpul reproducerii și orice deteriorare a ADN-ului ar putea duce la infertilitate . Bazele ADN-ului și bazele fosfodiesterice sunt deosebit de sensibile la deteriorarea indusă de stresul oxidativ, deoarece membranele plasmatice ale acestora conțin cantități mari de acizi grași polinesaturați, iar citoplasma conține concentrații scăzute de enzime de curățare . Prin urmare, nivelurile ridicate de ROS ar putea duce la rupturi de ADN dublu catenar observate în mod obișnuit în spermatozoizii bărbaților infertili . S-a înregistrat faptul că acefatul crește în mod semnificativ speciile reactive de oxigen (ROS) celulare, ceea ce duce la modificări ale ADN-ului prin formarea de erori de perechi de baze și rupturi de catenă . Spermatozoizii cu ADN fragmentat sunt mai puțin mobili și mai puțin susceptibili la umflarea hipoosmotică, ceea ce indică o integritate funcțională mai scăzută a membranei spermatozoizilor, conducând astfel la reducerea funcției spermatozoizilor odată cu creșterea leziunilor ADN . Pesticidele care induc leziuni ale ADN-ului în leucocite ar putea duce, de asemenea, la leziuni ale ADN-ului în spermatozoizi .

5. Concluzii

Studiul de față sugerează o posibilă afectare a funcției spermatozoizilor odată cu expunerea la acefat. Concentrația ridicată de acefat (200 μg/mL, care este echivalentă cu LD50) testată în acest studiu a alterat motilitatea spermatozoizilor umani, viabilitatea, integritatea funcțională a membranei plasmatice și capacitarea spermatozoizilor și a indus leziuni ale ADN-ului in vitro. După luarea în considerare a rezultatelor și a răspunsurilor biologice umane naturale, cum ar fi degradarea și eliminarea substanțelor chimice, s-ar putea recomanda că doza mai mare testată (200 μg/mL) și mai mult ar putea provoca un risc pentru sănătatea umană.

Abbreviații

BWW:	Biggers Whitten Whittingham
HOS:	Soluție hipoosmotică
NaCl:	Clorură de sodiu
OP:	Pesticid de organofosfat
ROS:	Specii reactive de oxigen.

Aprobare etică

Aprobarea etică a fost obținută de la comitetul de evaluare etică, Facultatea de Științe Medicale, Universitatea din Sri Jayewardenepura, Nugegoda, Sri Lanka. Numărul aprobării etice este 712/13.

Conflicte de interese

Autorii declară că nu există conflicte de interese în ceea ce privește publicarea acestei lucrări.

Recunoștințe

Se apreciază foarte mult asistența valoroasă oferită de profesorul Neelika Malavige, Departamentul de Microbiologie, Facultatea de Medicină, Universitatea din Sri Jayewardenepura, pentru punerea la dispoziție a incubatorului cu dioxid de carbon și Departamentul de Zoologie, Facultatea de Științe, Universitatea din Colombo, pentru furnizarea de substanțe chimice pentru proiect.

.