Efectele statinelor asupra angiogenezei și vasculogenezei | Revista Española de Cardiología

INTRODUCERE

Statinele inhibă activitatea 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A (HMG-CoA) reductazei, o enzimă care catalizează sinteza mevalonatului, pasul limitativ în biosinteza colesterolului.1 Reducerea rezultată a colesterolului intracelular duce la o creștere compensatorie a absorbției colesterolului de către receptorii de lipoproteine cu densitate scăzută (LDL) și la o scădere a colesterolului din plasmă. Descoperirea statinelor și aplicarea lor la subiecții cu concentrații ridicate de colesterol a făcut posibilă îmbunătățirea considerabilă a prevenției primare și secundare a bolii coronariene.2,3 Recent, eficacitatea statinelor în prevenirea primară și secundară a bolii coronariene a fost observată și la subiecții cu niveluri mai scăzute de colesterol.4-6 În afară de reducerea colesterolului LDL (C-LDL), statinele au o serie de efecte pleiotropice asupra mai multor componente ale aterosclerozei, inclusiv asupra funcției endoteliale, migrației celulare, inflamației și tendinței trombotice a plăcii.7-12 La animalele normoholesterolemice s-a demonstrat că statinele au un efect protector împotriva leziunilor de ischemie-reperfuzie a mușchiului cardiac, probabil prin mecanisme legate de producția de oxid nitric (NO) de către endoteliu.13

Proteina kinaza serină/treonină Akt sau proteina kinaza B (PKB) este un regulator intracelular multifuncțional al supraviețuirii celulare, creșterii și metabolismului 14 (figura 1). În legătură cu funcțiile sale cardiovasculare, Akt/PKB acționează pe calea intracelulară stimulată de factorul de creștere endotelială vasculară (VEGF)14,15 și de angiopoietină,16-18 promovând supraviețuirea celulară și asigurând o dezvoltare vasculară adecvată.19 Activarea constitutivă a semnalizării Akt protejează cardiomiocitele împotriva apoptozei în leziunile de ischemie-reperfuzie.20 Pe lângă efectul său citoprotector, Akt acționează ca un activator al producției de NO de către endoteliu ca răspuns la VEGF și la stresul de forfecare prin capacitatea sa de a fosforila oxidul nitric sintetaza endotelială (eNOS) în serinele 1179 sau 1177,21,22 controlând astfel tonusul vasomotor.23 Pe de altă parte, Akt este esențială în migrarea celulelor endoteliale către focarul producător de VEGF.24 Prin urmare, capacitatea Akt de a media supraviețuirea celulară, producția de NO și migrația indusă de VEGF sugerează că proteina kinaza Akt poate media răspunsul endotelial la stimulii angiogenici.

Fig. 1. Statinele, semnalizarea Akt și angiogeneza/vasculogeneza. Angiopoietina 1 (Ang-1), VEGF și factorul de creștere a fibroblastelor (FGF), atunci când sunt legați de receptorii lor membranari, induc conversia fosfatidilinositolului 4,5-bifosfat (PIP2) în fosfatidilinositol 3,4,5-trifosfat (PIP3) de către fosfatidilinositol 3-kinaza (PI3K). Formarea PIP3 este necesară pentru fosforilarea proteinkinazei Akt de către kinaza PDK-1. Tratamentul cu statine crește fosforilarea Akt, în timp ce wortmanina (un inhibitor al PI3K) o previne. Mevalonatul, produs al HMG-CoA reductazei, inhibă, de asemenea, PI3K și fosforilarea ulterioară a Akt. Prin urmare, statinele, prin inhibarea HMG-CoA reductazei și a producției de mevalonat, cresc fosforilarea Akt și, în același timp, fosforilarea și activarea oxidului nitric sintetazei endoteliale (eNOS), sinteza oxidului nitric (NO) și o varietate de efecte fiziologice induse în angiogeneză și vasculogeneză. Akt previne, de asemenea, apoptoza celulelor endoteliale.

S-a demonstrat recent că statinele stimulează, de asemenea, calea de semnalizare intracelulară a protein-kinazei Akt/PKB25-27 în celulele endoteliale25 și în celulele progenitoare endoteliale (EPC) din măduva osoasă26,27, inducând astfel atât angiogeneza25, cât și vasculogeneza.26 Efectele statinelor asupra cineticii EPC au fost, de asemenea, demonstrate la om de către Vasa și colab.28 Acest articol trece în revistă efectul statinelor asupra inducerii angiogenezei25 și vasculogenezei26 prin mecanisme legate de activarea Akt.25-27

ANGIOGENESIS ȘI VASCULOGENESIS

Angiogeneza și vasculogeneza sunt responsabile de dezvoltarea sistemului vascular la nivelul embrionului.29-32 Vasculogeneza este procesul de formare a vaselor de sânge din celule progenitoare endoteliale (angioblaste) care migrează și fuzionează cu alte celule progenitoare endoteliale și se diferențiază în celule endoteliale, formând în același timp noi vase de sânge. În schimb, angiogeneza este procesul de extindere a vaselor de sânge care s-au format prin înmugurirea de noi capilare prin migrarea și proliferarea celulelor endoteliale diferențiate anterior (figura 2).

Fig. 2. Reprezentarea schematică a angiogenezei și vasculogenezei. (A) Vasculogeneza este agregarea angioblastelor sau a celulelor progenitoare endoteliale pentru a forma vase de sânge. Angioblastele se unesc in situ sau migrează pentru a forma vase de sânge în locuri îndepărtate. (B) Angiogeneza este formarea de noi vase de sânge din vase preexistente prin proliferarea și migrarea celulelor endoteliale diferențiate. (C) Angiogeneza și vasculogeneza pot, de asemenea, să apară simultan. (Preluat din Cleaver et al.29)

Inițial s-a crezut că procesul vasculogenic se limitează la dezvoltarea embrionară, în timp ce angiogeneza (care are loc, de asemenea, în embrion) era singurul proces implicat în neovascularizare la adulți. Cu toate acestea, paradigma neovascularizației postnatale a fost revizuită recent și s-a descoperit că celulele progenitoare endoteliale care circulă în sângele periferic33, sunt încorporate de focarele de neovascularizație la animalele adulte34, cresc în număr ca răspuns la ischemia tisulară35 și promovează dezvoltarea de vase sanguine colaterale după expansiunea lor in vitro și transplantul ulterior36. Aceste studii au stabilit că atât angiogeneza, cât și vasculogeneza sunt responsabile de neovascularizare la adulți.

Un al treilea mecanism care contribuie probabil la dezvoltarea vaselor colaterale este creșterea dimensiunii și a calibrului conexiunilor colaterale arteriolare preexistente, un proces numit arteriogeneză.37 Prezența și numărul acestor vase colaterale native variază foarte mult între indivizi și specii. Atunci când un vas devine ocluziv, are loc o creștere a vitezei fluxului sanguin prin vasele colaterale preexistente și o creștere a stresului de forfecare luminală, factori care contribuie la maturizarea vaselor colaterale, în special a celor de dimensiuni intermediare.

Metode de studiu in vitro

Dezvoltarea tehnicilor de cultivare a celulelor endoteliale a făcut posibilă înțelegerea proceselor implicate în angiogeneză.38 Celulele endoteliale în cultură își păstrează capacitatea de a răspunde la factorii care stimulează sau inhibă angiogeneza, precum și capacitatea de a forma tuburi endoteliale in vitro. Testele de proliferare celulară permit să se analizeze efectul unei anumite substanțe asupra proliferării celulelor endoteliale. Migrarea celulelor endoteliale spre o soluție care conține o anumită substanță, separate de o membrană permeabilă, poate fi examinată într-o cameră Boyden. Mecanismele de formare a endoteliilor tubulari și efectul unei anumite substanțe asupra tubulilor pot fi studiate cu ajutorul unor teste bidimensionale sau tridimensionale. Cu ajutorul acestor tehnici se analizează procesele de formare a lumenului endotelial și influența matricei extracelulare asupra dezvoltării capilarelor.38 În sfârșit, culturile de celule endoteliale permit studiul căilor moleculare implicate în procesele de angiogeneză.

Recent, prin utilizarea tehnicilor de selecție celulară și a mediilor de cultură speciale, tehnicile dezvoltate pentru studiul celulelor endoteliale diferențiate au fost utilizate pentru studiul celulelor progenitoare endoteliale.33-36

Metode de studiu in vivo

Deși tehnicile in vitro permit o analiză preliminară a angiogenezei și vasculogenezei, există mulți factori care pot influența sau modula aceste procese in vivo.38 Pentru a studia mecanismele de formare a vaselor de sânge in vivo, au fost dezvoltate diferite sisteme biologice pentru a cuantifica sau demonstra efectul unei anumite substanțe: modele de cornee de șoarece, membrană corioalantoidă de embrion de pui sau implanturi spongioase.38 Aceste sisteme necesită sacrificarea animalului, astfel încât acestea captează efectul doar într-un anumit moment. Pentru a studia evoluția temporală a evenimentelor într-un singur țesut, au fost dezvoltate tehnici de microscopie intravitală pentru pielea de pe spatele sau craniul șoricelului.39 În cele din urmă, dezvoltarea tehnicilor de inginerie genetică a făcut posibilă studierea efectului suprimării (knock-out) sau al adăugării (knock-in) unei gene asupra proceselor de vasculogeneză și angiogeneză.

Studiul vasculogenezei postnatale și al efectului anumitor substanțe asupra proceselor de vasculogeneză a fost posibil datorită utilizării unor tehnici de citometrie în flux, sortare celulară activată prin fluorescență (FACS), a unor tehnici speciale de cultivare a celulelor progenitoare endoteliale (EPC) din sângele periferic și a modelelor de transplant de măduvă osoasă murină.33-36 FACS se utilizează pentru a detecta și cuantifica EPC din sângele periferic folosind anticorpi împotriva antigenelor de suprafață ale acestor celule. Influența medicamentelor sau a factorilor de creștere asupra numărului acestor celule din sângele periferic poate fi analizată în acest mod. Tehnicile speciale de selecție și cultivare a celulelor dezvoltate de grupul nostru au făcut posibilă, de asemenea, detectarea și cuantificarea EPC. În modelul murin de transplant de măduvă osoasă, celulele de măduvă osoasă de la un donator de șoarece sunt transplantate la un receptor de șoarece cu o genă care codifică elaborarea unei substanțe care permite detectarea ulterioară a acesteia (figura 3). În cazul nostru, gena a codificat elaborarea de beta-galactosidază de către celulele endoteliale. Exprimarea selectivă se realizează deoarece această genă este reglată de un promotor specific al celulelor endoteliale, Tie-2, la donatorul de șoarece. Prin urmare, numai celulele endoteliale din măduva osoasă a animalului donator vor exprima beta-galactosidază care poate fi detectată în receptorul animal. Dacă experimentele biologice descrise mai sus sunt efectuate după transplantul de măduvă osoasă în receptorul animal, putem analiza influența unei anumite substanțe asupra vasculogenezei prin cuantificarea numărului de celule progenitoare endoteliale provenite din măduva osoasă.

Fig. 3. Model murin de transplant de măduvă osoasă pentru studiul vasculogenezei. Donatorii de măduvă osoasă utilizați sunt șoareci transgenici care exprimă constitutiv gena LacZ (care codifică beta-galactosidază) reglată de un promotor endotelial specific, Tie-2. Măduva osoasă este extrasă și transplantată la un receptor de șoarece a cărui măduvă osoasă a fost iradiată subbletal. După o perioadă de 4 săptămâni pentru a realiza reconstituirea măduvei osoase transplantate, se fac una sau mai multe intervenții în receptorul de șoarece (cazul prezentat este un model cornean) pentru a stimula neovascularizarea. După aceste intervenții, animalele sunt sacrificate și se face un studiu histologic pentru a detecta expresia beta-galactosidazei. Cu ajutorul colorației X-GAL, celulele care exprimă beta-galactosidază capătă o culoare albăstruie. Utilizarea unui promotor specific pentru celulele endoteliale permite ca celulele albastre care au fost încorporate în focarele de neovascularizare să fie identificate ca celule de linie endotelială.

EFLECTUL STATINELOR ASUPRA INDUCERII ANGIOGENESISMULUI ȘI VASCULOGENESISMULUI

Investigațiile efectuate în laboratorul nostru și în alte părți au demonstrat că statinele stimulează calea de semnalizare intracelulară a proteinkinazei Akt/PKB,25-27 care promovează atât angiogeneza25 cât și vasculogeneza26. În plus, Vasa et al au reușit, de asemenea, să demonstreze la om efectele statinelor asupra cineticii EPC.28

Efectele in vitro ale statinelor

Statinele activează rapid proteina kinaza Akt/PKB în celulele endoteliale25 și EPC,26,27 crescând astfel fosforilarea eNOS și producția ulterioară de NO. Activarea Akt de către statine promovează proliferarea, migrarea și supraviețuirea celulară a celulelor endoteliale și a EPC, precum și formarea structurii vasculare. În plus, inhibarea Akt prin utilizarea de adenovirusuri care codifică forme dominante negative de Akt determină inhibarea efectelor induse de statine. Potențialul statinelor în procesele de regenerare tisulară a fost demonstrat anterior în osteoblaste. La aceste celule, statinele au crescut proliferarea și nivelul de activitate, crescând, în consecință, formarea osoasă.40

Deși mecanismele de activare a Akt de către statine nu sunt cunoscute cu exactitate, este probabil că este implicată semnalizarea fosfatidilinositol-3-kinazei (PI3K), deoarece acest proces este blocat de wortmanin și LY294002, doi inhibitori ai enzimei (figura 1). În plus, este necesară inhibarea HMG-CoA reductazei, deoarece activarea Akt de către simvastatină a fost inhibată prin adăugarea de mevalonat la incubare (figura 1). Mevalonatul este necesar, nu numai pentru biosinteza colesterolului, ci și în producția de ubichinonă, dolicoli și izoprenoide, care sunt esențiale în mai multe procese celulare. Deși statinele stabilizează ARN mesager (ARNm) al eNOS prin modificarea sintezei izoprenoidelor,41 nu am observat modificări ale valorilor proteinei-sintetază eNOS. În acest sens, este important de subliniat faptul că creșterea concentrației ARNm a fost mai târzie (24 h) decât activarea fosforilării eNOS de către Akt (15 min). Acest timp de activare mai scurt este în concordanță cu modificările induse de statine în producția de NO și în vasodilatația observată în analele aortice ex vivo.42

Efectele in vivo ale statinelor

Statinele și activarea semnalizării intracelulare Akt favorizează angiogeneza în modelele de ischemie periferică dezvoltate la iepuri normoholesterolemici.25 La animalele care au primit statine, s-au observat presiuni de perfuzie mai mari, un număr mai mare de vase colaterale și o densitate capilară mai mare (figura 4). Pe de altă parte, statinele cresc numărul de celule progenitoare endoteliale din sângele periferic atât la șoareci26,27 cât și la om.28 În plus, statinele cresc neovascularizarea corneei la șoarecii normoholesterolemici, în parte datorită vasculogenezei din EPC obținute din măduva osoasă (figurile 3 și 5).26 Utilizând modelul murin de transplant de măduvă osoasă, a fost posibil să se demonstreze un număr mai mare de EPC din măduva osoasă în corneea șoarecilor tratați cu statine. Prin urmare, statinele au un efect important asupra cineticii EPC, așa cum a fost demonstrat anterior cu VEGF sau cu factorul de stimulare a coloniilor de granulocite și monocite (GM-CSF),35 iar mobilizarea indusă de statine a acestor celule ar putea crește neovascularizarea postnatală.

Fig. 4. Creșterea indusă de statine a neovascularizației în piciorul unui iepure ca răspuns la rezecția unilaterală a arterei femurale. a) Artera femurală și ramurile sale sunt disecate. Transferul genetic către endoteliu se face prin infuzie de adenovirus care codifică beta-galactosidază (Ad-βgal) sau Akt (Ad-myrAkt) în artera femurală distală și incubare timp de 15 min în timp ce se clampează temporar vena femurală. b) În a treia zi, se extrage mușchiul gastrocnemius și se efectuează colorația X-GAL pentru a determina distribuția transgenică în preparatele histologice colorate cu hematoxilină-eozină. c) Se efectuează angiografia prin iliaca internă pentru a analiza formarea de vase colaterale în diferite grupuri de tratament. În angiografiile realizate la 40 de zile, este vizibilă o creștere a formării de vase colaterale la animalele care au primit 0,1 mg/kg de simvastatină prin injecție intraperitoneală, comparativ cu animalele care au fost intervenite, dar cărora li s-a injectat doar soluție salină. Analiza cantitativă a vaselor colaterale a fost efectuată în grupul de control, în grupul tratat cu simvastatină și în grupul de animale care au primit o injecție intramusculară de Ad-VEGF. Scorul angiografic a fost analizat în grupurile experimentale care au primit o perfuzie de soluție salină, Ad-βgal și Ad-myrAkt la 31 de zile după intervenția chirurgicală. d) Colorația pentru fosfatază alcalină în mușchiul adductor al piciorului ischemic a evidențiat o densitate capilară mai mare în grupul de animale tratate cu simvastatină în raport cu grupul de control la 40 de zile după intervenția chirurgicală. Datele din fiecare experiment sunt prezentate ca medie±SD (n=6 iepuri în fiecare dintre grupurile de tratament, *P25)

Fig. 5. Creșterea neovascularizației corneene prin vasculogeneza indusă de statine. a) Fotografii reprezentative care arată neovascularizația corneană (stânga, vehicul; dreapta, simvastatină). b) Colorația X-gal a corneei întregi. Punctele albăstrui sunt celule care exprimă beta-galactosidază (stânga, vehicul; dreapta, simvastatină). c) Microfotografii reprezentative ale studiului histochimic al fluorescenței în cornee incluse în parafină de la șoareci Tie2/LacZ/BMT (stânga, vehicul; dreapta, simvastatină). Prezența celulelor dublu pozitive este o dovadă că celulele progenitoare endoteliale (EPC) obținute din măduva osoasă au fost încorporate de focarele de neovascularizare (vasculogeneză). În acest caz, culoarea roșie indică beta-galactozidaza, iar culoarea verde indică markerul endotelial specific isolectina B4. Celulele dublu pozitive (culoare galbenă) sunt EPC obținute din măduva osoasă care au fost încorporate de noile vase. d) Microfotografii reprezentative ale studiului histochimic al fluorescenței în cornee întregi de la șoareci Tie2/LacZ/BMT (stânga, vehicul; dreapta, simvastatină). Culoarea roșie indică beta-galactosidază, iar culoarea verde indică markerul endotelial specific lectina BS-1. e) Cuantificarea EPC derivate din transplant încorporate în neovasculatură. Exprimat ca raport între numărul de EPC și numărul total de celule endoteliale care formează noile vase. *P26)

CONCLUZII

Statinele promovează proliferarea, migrarea și supraviețuirea celulară a celulelor endoteliale și a EPC obținute din măduva osoasă prin mecanisme legate de activarea protein-kinazei serină/treonină Akt sau PKB. Într-un mod similar cu VEGF, statinele promovează angiogeneza și vasculogeneza. Prin urmare, activarea Akt poate fi responsabilă pentru unele dintre efectele benefice ale statinelor, inclusiv pentru neovascularizarea postnatală.

.