Frontiere în bioinginerie și biotehnologie

Introducere

Albinele serice sunt proteine utilizate în mod obișnuit în biodiagnostic și ca model în cercetarea biointerfețelor (Rosi și Mirkin, 2005; Singh et al, 2005; Arcot et al., 2015). Dintre acestea, albumina serică bovină (BSA) este cea mai ieftină și o proteină utilizată pe scară largă ca agent de blocare în testele ELISA (Maingonnat et al., 1999). În diagnosticele pe hârtie, BSA (Huang et al., 2018) crește selectiv hidrofobicitatea hârtiei pentru a îmbunătăți fluxul de biofluide și de eluție prin diminuarea absorbției de lichid. BSA protejează și crește durata de viață a biomoleculelor funcționale uscate pe hârtie. Funcționalitatea și longevitatea imunoglobinei G și a imunoglobinei M uscate pe suprafețe tratate cu BSA pot crește cu un ordin de mărime (van Remoortere et al., 2001). BSA previne, de asemenea, adsorbția nespecifică a proteinelor analitice pentru analiza cantitativă.

Multe articole au raportat pe larg fenomenul de sorbție a moleculelor BSA la diferite interfețe, cum ar fi aurul (Dennison et al., 2017), mica (Fitzpatrick et al., 1992), siliciul (Jachimska et al., 2016; Givens et al., 2017) și celuloza (Mohan et al., 2014; Lombardo et al., 2017). Conformația moleculei BSA adsorbite și topologia stratului format sunt puternic afectate de pH, puterea ionică și temperatură. Moleculele de BSA își păstrează structura nativă între pH 4,0 și 8,0. Sub pH 4,0 și peste 8,0, moleculele de BSA își schimbă conformația de pliere care diferă de structura lor nativă (Su et al., 1998a; Barbosa et al., 2010; Phan et al., 2015). Punctul izoelectric al BSA este la pH 4,5. La acest pH, sarcina netă de suprafață devine zero și moleculele de BSA se agregă. Creșterea pH-ului crește sarcina BSA, iar repulsia electrostatică dominantă stabilizează moleculele BSA și previne agregarea (Li et al., 2008).

În ciuda faptului că se numără printre cele mai studiate proteine, rămân multiple întrebări cu privire la efectul pe care pH-ul și puterea ionică îl au asupra conformației BSA la adsorbție. În acest context, conceptul de acoperire a suprafeței, definit exclusiv prin fracția de suprafață sau densitatea ponderală, este lipsit de claritate. Este necesar să se înțeleagă mai bine variabilele care definesc interfața solid-lichid BSA pentru a proiecta dispozitive robuste de biodiagnostic.

Molculele de albumină serică bovină se adsorb la o interfață formând un strat cu o grosime la scară nanometrică. Câteva metode de caracterizare, cum ar fi reflectivitatea (Su et al., 1998b, 2016; Raghuwanshi et al., 2017a, b), elipsometrul, microscopul de forță atomică (AFM), rezonanța plasmonului de suprafață (SPR) și microbalanța cu cristal de cuarț cu disipare (QCM-D) pot măsura grosimea stratului de proteină adsorbită la scara nanometrică necesară. În special, QCM-D poate monitoriza cinetic procesul de sorbție a biomoleculelor prin măsurarea masei de proteine adsorbite la o interfață în nanograme (Kristensen et al., 2013; Luan et al., 2017). QCM-D permite controlul temperaturii, al puterii ionice și al pH-ului mediului. Modul de disipare al QCM dezvăluie rigiditatea straturilor de proteine adsorbite.

În acest studiu, este descris un comportament reversibil, sensibil la pH, al moleculelor de BSA adsorbite la interfața aur-salină. Stratul de BSA adsorbit se comportă ca un burete sensibil la pH în care moleculele de apă se adsorb și se desorb în funcție de pH-ul înconjurător între 4 și 8. Această lucrare monitorizează și cuantifică fenomenul de sorbție a apei în stratul de BSA asemănător unui burete și elucidează mecanismele implicate la diferite pH-uri și forțe ionice. Obiectivul nostru este de a descrie acoperirea cu BSA la interfața solid-lichid în termeni de număr de molecule și de greutate/ grosime a stratului. Acest lucru are ca scop clarificarea conceptului de acoperire a suprafeței biomoleculelor și elucidarea comportamentului dinamic al moleculelor de BSA adsorbite în contextul biodiagnosticului.

Materiale și experimente

Materiale

Pudra liofilizată de albumină serică bovină (97%) și sarea de clorură de sodiu (NaCl) (99,5%) au fost achiziționate de la Sigma Aldrich (Castle Hill, NSW, Australia). Acidul clorhidric (HCl) și hidroxidul de sodiu (NaOH) au fost achiziționate de la Merck Ltd. (Merck Ltd.). Toate substanțele chimice sunt de calitate analitică și au fost utilizate fără nicio purificare.

Măsurători QCM-D

Măsurătorile cu microbalanța cu cristal de cuarț cu disipare au fost efectuate pe un instrument E4-QCM-D de la Biolin Scientific Ltd. Senzorii cu cristale de cuarț acoperite cu aur au fost utilizați după curățarea într-o soluție H2O2:NH3:H2O (1:5:5) timp de 15 min și urmată de curățarea cu UV-Ozone timp de 10 min.

Senzorii de aur au fost plasați în module de celule lichide. 1 mg/mL BSA a fost dizolvat în soluția salină (0,9% NaCl) și pH-ul soluției a fost setat la pH 7,0 și 4,5. Separat, pH-ul soluției saline a fost ajustat la 7,0 și 4,5. Soluțiile preparate au fost trecute prin modulele de celule lichide cu ajutorul unei pompe peristaltice. Modificările frecvenței de rezonanță (F) și ale disipării (D) senzorului de cuarț în raport cu frecvența fundamentală de 5 MHz și cu șase supratonuri impare diferite (1, 3, 5, 7, 9 și 13) au fost monitorizate simultan.

În primul rând, o soluție salină a fost pompată în celula lichidă și s-a lăsat să se echilibreze pentru a genera o linie de bază stabilă. După aceea, BSA în soluție salină a fost trecut prin celulă și a permis moleculelor de BSA să se adsorbe la interfața de aur. Soluția salină a fost apoi pompată pentru a elimina orice molecule de BSA neatașate. Ciclurile de clătire a soluțiilor saline cu pH diferit și a apei au fost apoi după cum urmează:

Variațiile obținute în frecvența de rezonanță ΔF și disiparea ΔD au fost ajustate cu modelul Sauerbrey cu ajutorul software-ului Dfind.

Măsurătorile DLS

Dispersia dinamică a luminii (DLS) pe BSA dispersată în soluția salină la diferite pH-uri (4,5 și 7,0) au fost măsurate pe analizorul DLS de dimensiune a particulelor (Brookhaven Nanobrook Omni). S-a utilizat o sursă de laser roșu semiconductor de 40 mW (640 nm) cu temperatură controlată. Măsurătorile au fost efectuate de trei ori și mediate. Toate măsurătorile au fost efectuate la temperatura camerei (22°C).

Măsurători ale unghiului de contact

Unghiul de contact pe aur și BSA adsorbit la pH diferit pe o interfață de aur au fost măsurate folosind un setup OCA 35 DataPhysics Instruments GmbH, Germania. Măsurătorile au fost efectuate direct pe suprafața senzorului scoasă din configurația QCM după măsurare. Toate măsurătorile au fost efectuate la temperatura camerei (22°C). Au fost efectuate cel puțin cinci măsurători ale unghiului de contact pe suprafața senzorului și s-a calculat media acestora.

Microscop de forță atomică (AFM)

Măsurătorile de microscopie de forță atomică au fost efectuate în modul de atingere cu un AFM JPK Nanowizard III. Cantilerele (AC160TS-R3) selectate pentru imagistică au avut o frecvență nominală de 300 kHz și o constantă elastică de 26 N/m. Imagistica a fost realizată pe interfața de aur goală și pe stratul de BSA adsorbit la pH 4,5 la interfața cu aurul. Imaginile au fost realizate direct pe suprafața senzorului scos din configurația QCM după măsurare. Toate măsurătorile au fost efectuate la temperatura camerei (22°C).

Rezultate

Un fenomen reversibil de sorbție a apei, sensibil la pH, al moleculelor de BSA adsorbite la interfața solid-lichid este studiat prin QCM-D cu cicluri de clătire cu soluție salină la pH 7,0 și 4,5. Aurul a fost selectat ca interfață solidă, deoarece hidrofobicitatea sa direcționează adsorbția BSA (Lori și Hanawa, 2004; Phan și colab., 2015; Ozboyaci și colab., 2016). Straturile de BSA adsorbite la diferite valori de pH sunt clătite cu cicluri alternative de soluții saline la pH 4,5 și 7,0. În plus, s-a efectuat clătirea cu apă Milli-Q pură pentru a evalua efectul pe care puterea ionică îl are asupra stratului de BSA adsorbit.

Figura 1 (Sus) prezintă modificarea frecvenței (F5 și F7) pentru moleculele de BSA adsorbite la pH 7,0 din soluția BSA/salină urmată de clătirea cu soluția salină originală (pH 7). Următorul ciclu de clătire a fost efectuat cu soluția salină la pH 4,5. Urmează apoi cicluri alternante de soluții saline la pH 4,5 și 7.

În figura 1, după o linie de bază inițială stabilă, s-a observat o scădere bruscă a F care indică adsorbția moleculelor de BSA la interfața aur-lichid. F a scăzut până la ΔF = -35,5 și s-a stabilizat. La clătirea cu soluție salină (pH 7), F a crescut de la ΔF = -35,5 la ΔF = -34,0, ceea ce arată eliminarea moleculelor BSA neadsorbite de pe suprafață. În urma clătirii cu soluție salină (pH 4,5), F a crescut în continuare până la ΔF = -30,0, ceea ce relevă o scădere suplimentară a masei de pe suprafața senzorului. În mod surprinzător, ciclurile ulterioare de clătire cu soluție salină (pH 7,0) scad F la ΔF = -34,0, ceea ce înseamnă o creștere a masei la suprafața senzorului datorită absorbției moleculelor de apă în stratul de BSA. Ciclurile ulterioare de clătire cu soluție salină urmează aceeași modificare ciclică a masei la interfața cu aur.

În cel de-al doilea experiment, similar primului experiment, adsorbția moleculelor de BSA la pH 4,5 a fost urmată de cicluri de clătire cu soluție salină la diferite pH-uri (Figura 1: Jos). Moleculele de BSA adsorbite corespund scăderii F până la ΔF = -38,5. Clătirea cu soluție salină (pH 4,5) îndepărtează BSA neadsorbită (ΔF = -38,0).

În urma clătirii cu soluție salină (pH 7,0) crește și mai mult masa stratului de la suprafața de aur, ceea ce corespunde scăderii F la ΔF = -43. Creșterea masei se datorează absorbției de molecule de apă în stratul de BSA. Ulterior, clătirea cu soluție salină (pH 4,5) desorbește moleculele de apă și readuce valoarea F la ΔF = -37. Fiecare ciclu de clătire adsorbe și desorbește aceeași cantitate de molecule de apă.

În același experiment, efectul puterii ionice asupra stratului de BSA adsorbit a fost studiat prin clătirea stratului cu apă pură. Figura 1 prezintă adsorbția BSA la pH 7,0 și 4,5 urmată de cicluri de clătire cu soluție salină la diferite pH-uri și cu apă Milli-Q pură.

În ambele cazuri, clătirea cu apă crește valoarea în ΔF = -29,2 (BSA adsorbită la pH 4,5) și -26,5 (BSA adsorbită la pH 7,0). Acest lucru indică faptul că clătirea cu apă scade și mai mult masa, ceea ce corespunde unei desorbții suplimentare a moleculelor de apă de la interfață. Fiecare ciclu de clătire susține același comportament în ceea ce privește modificarea masei care se datorează sorbției apei în stratul de BSA.

În mod interesant, în toate experimentele, ciclurile alternative de clătire cu soluție salină la pH 4,5 și 7,0 arată sorbția reversibilă a moleculelor de apă în stratul de BSA adsorbit. Clătirea stratului de BSA cu soluție salină la pH 7,0 adsorbează moleculele de apă în structura stratului de BSA, ceea ce crește masa interfeței solid-lichid. În schimb, clătirea stratului de BSA cu soluție salină la pH 4,5 elimină moleculele de apă din stratul de BSA, ceea ce reduce masa interfeței. Sorbția de apă complet reversibilă măsurată indică faptul că moleculele de BSA nu se desorb în timpul clătirii, iar acoperirea suprafeței lor rămâne identică; doar numărul de molecule de apă din interfază variază.

Fenomenul de sorbție a apei la clătirea cu soluție salină (la pH diferit) se produce doar datorită stratului de BSA adsorbit și este confirmat de un experiment separat de clătire cu soluție salină pe senzorul de aur gol (Material suplimentar S1). O linie de bază stabilă pe frecvența senzorului de aur gol este menținută de soluția salină (la pH 4,5). Ulterior, interfața de aur a fost clătită cu un ciclu alternativ de clătire cu soluție salină cu pH 7,0 și 4,5 (Material suplimentar S1). Rezultatele arată în mod clar că clătirea alternativă cu soluție salină la pH diferit nu are niciun efect asupra frecvenței senzorului de aur. Prin urmare, numai stratul de BSA adsorbit pe aur prezintă modificarea frecvenței la ciclurile de clătire cu soluție salină la diferite valori de pH.

Masa adsorbită, acoperirea suprafeței și grosimea stratului de BSA adsorbit sunt extrase prin adaptarea modelului Sauerbrey la datele QCM. Modelul este utilizat pentru a se potrivi unui strat rigid în care valoarea disipării este mai mică de 2, așa cum s-a observat în toate experimentele noastre (Material suplimentar S2). Ecuația Sauerbrey este dată de Δm=-CΔfn, unde, C = 17,7 ng/Hz.cm2 este constantă pentru cristalul de cuarț acoperit cu aur de 5 MHz, n este supratonul, Δm este masa adsorbită și Δf este modificarea frecvenței.

Molculele de BSA s-au adsorbit până la o acoperire masică de 6,3 mg/m2 (grosime de 5,6 nm) la pH 7,0 (Figura 2A). Clătirea stratului de BSA preadsorbit cu soluție salină (pH 4,5) a scăzut acoperirea masică la 5,6 mg/m2 și grosimea acestuia la 4,9 nm (tabelul 1), ceea ce se datorează eliberării moleculelor de apă din structura stratului de BSA adsorbit. Clătirea ulterioară cu soluție salină (la pH 7,0) readsorb moleculele de apă în aceeași cantitate. Diferența de schimbare de masă este Δm = 0,7 mg/m2.

În mod similar în figura 2B, clătirea stratului de BSA preadsorbit la pH 4,5 cu soluție salină (la pH 7,0) crește masa adsorbită de la 6,4 mg/m2 la 7,4 mg/m2 și grosimea de la 6,2 la 6,9 nm; acest lucru se datorează absorbției moleculelor de apă în stratul de BSA. Ciclul de clătire a soluției saline la diferite valori ale pH-ului a păstrat diferența de variație a masei de Δm = 1,0 mg/m2, care este de 1,4 ori mai mare decât variația masei la pH 7,0 (0,7 mg/m2).

Numărul mediu de molecule de apă adsorbite/desorbite în stratul BSA în timpul ciclului de clătire a soluției saline este calculat din diferența de masă adsorbită la diferite pH-uri (Material suplimentar S3). Stratul de BSA adsorbit la pH 4,5 adsorbe/desorbește 3,3 × 1019 molecule de apă în timpul ciclurilor de clătire, ceea ce reprezintă 570 de molecule de apă/molecule de BSA (tabelul 1). Cu toate acestea, stratul de BSA adsorbit la pH 7,0 absoarbe/desorbește 2,3 × 1019 molecule de apă, adică 450 de molecule de apă/molécule de BSA, în timpul ciclului reversibil de clătire cu soluție salină.

Măsurătorile de împrăștiere dinamică a luminii (DLS) clarifică starea agregată și neagregată a BSA în soluție salină la pH 4,5 și pH 7,0 (figura 3). La pH 4,5, DLS relevă că moleculele de BSA se agregă și prezintă distribuții de dimensiuni multiple: 5 nm, 10 nm, 20 nm și 50 nm. Cu toate acestea, la pH 7,0, moleculele de BSA nu se agregă, din cauza repulsiilor electrostatice, și au o distribuție de dimensiuni de 5 și 10 nm. Dimensiunea de 5 și 10 nm a BSA hidratat este comparabilă cu dimensiunea și forma moleculelor individuale de BSA (14 nm × 4 nm × 4 nm) (Anderegg et al., 1955; Wright și Thompson, 1975).

Imaginile la microscopul de forță atomică confirmă adsorbția moleculei BSA la interfața cu aurul (figura 4). Aceste imagini demonstrează diferențe în morfologia de suprafață a aurului gol (figurile 4a,b) și a BSA adsorbită la interfața aurului la pH 4,5 (figurile 4c,d). La compararea imaginilor mărite ale aurului gol (figura 4b) și ale suprafeței absorbite de BSA (figura 4d), diferențele dintre suprafețe sunt vizibile. Chiar dacă ambele suprafețe au particule care le formează, definiția și, prin urmare, materialul imaginat este diferit. Particulele de pe suprafața de aur goală sunt mai definite (de exemplu, limite mai clare între forme), ceea ce indică un material mai dur în comparație cu suprafața acoperită cu BSA. Aurul acoperit cu BSA arată prezența unor agregate suplimentare de molecule de BSA. Imaginea AFM mărită a aurului acoperit cu BSA (figura 4d) arată că dimensiunea laterală a moleculelor de BSA agregate variază între 30 și 100 nm, cu o înălțime cuprinsă între 5-15 nm.

Aghiul de contact format de picăturile de apă pe două suprafețe: aur și BSA adsorbit pe aur a fost măsurat pentru a clarifica umectabilitatea (Figura 5). Senzorul din aur este hidrofil cu un unghi de contact de 66°. Cu toate acestea, stratul de BSA adsorbit la pH 4,5 devine mai hidrofil pe măsură ce unghiul de contact cu apa a scăzut la 60°, care a scăzut în continuare la 55° pentru stratul de BSA adsorbit la pH 7,0. O observație similară a fost raportată pentru straturile de BSA adsorbite pe o suprafață de siliciu, deoarece unghiul de contact cu apa a scăzut de la 57° (la pH 4,5) la 54° (la pH 7,0) (Jachimska et al., 2016). Modificarea unghiului de contact și a grosimii stratului pentru BSA adsorbită la pH-uri diferite indică diferențe structurale și topografice în timpul procesului de adsorbție la interfața cu aurul.

Discuție

Punctul izoelectric al BSA se situează între pH 4,5-4,8; este pH-ul la care sarcina netă a moleculei devine zero. În apropierea punctului izoelectric, moleculele de BSA au mai puțină repulsie electrostatică intermoleculară. Forța ionică ridicată a soluției saline (0,15 M) joacă, de asemenea, un rol în ecranarea sarcinilor și în împiedicarea interacțiunilor electrostatice. Prin urmare, moleculele de BSA se agregă în suspensia BSA/salină. Măsurătorile DLS (figura 3A) confirmă prezența agregatelor de BSA cu dimensiuni de până la 60 nm în suspensia BSA/salină la pH 4,5.

În timpul adsorbției BSA (la pH 4,5) la interfața cu aur, nu se așteaptă nicio atracție electrostatică a BSA către interfața cu aur. Cu toate acestea, o sarcină pozitivă slabă de la proteina globulară BSA poate oferi o derivă suficientă pentru adsorbția la o interfață (Su et al., 1998a; Jachimska et al., 2016). Mai multe articole au raportat anterior că adsorbția BSA și a unor proteine similare în apropierea punctului izoelectric este determinată de interacțiuni hidrofobe care depășesc interacțiunile electrostatice (Uyen et al., 1990; Tilton et al., 1991; Figueira și Jones, 2008; Norde, 2008; Jeyachandran et al., 2009; Rabe et al., 2011; Huang et al., 2017; Xu et al., 2018; Attwood et al., 2019). Măsurătorile unghiului de contact (figura 5) arată că interfața aurului gol este mai puțin hidrofobă, iar albumina se leagă de aur prin interacțiuni hidrofobe (Norde și Giacomelli, 2000; Figueira și Jones, 2008). Deoarece repulsiile dintre moleculele BSA sunt ecranate, moleculele BSA hidratate se adsorb în cantități mari (6,4 mg/m2) sub formă de agregate și cu multiple puncte de contact pe interfața de aur (figura 6A). Imaginea AFM (figurile 4c,d) confirmă adsorbția și agregarea moleculelor BSA la interfața cu aur. Imaginile AFM arată că dimensiunea laterală a agregatelor variază între 30 și 100 nm, cu înălțimea distribuită între 5 și 15 nm. Acest lucru confirmă faptul că moleculele de BSA adsorbite sunt o combinație de conformații atât în picioare cât și plate.

La pH 7,0, moleculele de BSA sunt încărcate negativ. Acest lucru creează o repulsie electrostatică între moleculele de BSA care împiedică aglomerarea BSA în soluție. Măsurătorile DLS arată distribuția moleculelor de BSA neagregate de dimensiuni de 5 și 10 nm (figura 3B). Aceste dimensiuni sunt comparabile cu dimensiunile moleculelor individuale de BSA (14 nm × 4 nm × 4 nm) (Anderegg et al., 1955; Wright și Thompson, 1975). În timpul adsorbției BSA pe aur, o combinație de repulsie electrostatică și interacțiuni hidrofobe formează un strat de BSA la interfață. Puternica repulsie laterală intermoleculară între moleculele de BSA adsorbite reduce capacitatea de adsorbție a BSA (5,6 mg/m2) la interfață. Prin urmare, moleculele de BSA se adsorb ca molecule individuale (nu agregate) și formează un monostrat la interfața de aur (figura 6A).

În experimentele QCM-D (figura 1), moleculele de BSA prehidratate sunt adsorbite la interfață. La clătirea alternativă cu soluție salină la diferite pH-uri, stratul de BSA adsorbează/desorbește în continuare moleculele de apă. BSA adsorbită la pH 4,5 captează și eliberează mai multe molecule de apă (1,0 mg/m2) în comparație cu moleculele de BSA adsorbite la pH 7,0 (0,7 mg/m2). Motivul este cantitatea de BSA adsorbită la pH 4,5 (6,4 mg/m2) este mai mare decât cea de la pH 7,0 (5,6 mg/m2).

Masa uscată calculată (nehidratată) a moleculelor de BSA adsorbite pentru acoperirea completă a suprafeței senzorului de aur este de aproximativ 2 mg/m2 (Material suplimentar S3). Masa uscată calculată este comparabilă cu cea raportată în literatura de specialitate (Jachimska et al., 2016). Atunci când o moleculă de BSA uscată este hidratată, grupările sale hidrofile se leagă rapid de apă. Legătura se datorează structurii dipolare a apei care interacționează cu grupurile polare din BSA. În BSA hidratată, unele molecule de apă sunt legate ferm, în timp ce alte molecule de apă sunt legate slab sau sunt pur și simplu prinse între structura în buclă a BSA. Cantitatea de apă care hidratează stratul de BSA crește fracția de masă adsorbită la interfață. În ciclul de clătire cu soluție salină, la diferite valori ale pH-ului, conduce la o redistribuire a sarcinilor pe stratul de BSA adsorbit. Această redistribuire a sarcinilor creează un gradient între stratul de BSA adsorbit și soluția de bază. Gradientul acționează ca o forță motrice pentru a capta și elibera moleculele de apă slab legate din stratul de BSA.

Grosimea stratului de BSA este evaluată prin adaptarea modelului Sauerbrey la datele QCM-D (figura 2). Stratul de BSA hidratat adsorbit la pH 4,5 și clătit cu soluție salină (pH 7,0) oferă cea mai mare grosime de 6,9 nm (figura 6B). Cantitatea mare de molecule de BSA adsorbite (6,4 mg/m2) captează multe molecule de apă care umflă stratul de BSA. Clătirea aceluiași strat cu soluție salină (pH 4,5) reduce grosimea stratului la 6,4 nm, ceea ce se datorează eliberării moleculelor de apă din strat. Un fenomen similar se observă pentru moleculele de BSA adsorbite la pH 7,0. Cu toate acestea, grosimea stratului de BSA este mai subțire decât în cazul stratului de BSA adsorbit la pH 4,5 (figura 6B).

În plus, stratul de BSA adsorbit la ambele valori ale pH-ului rămâne rigid și atașat ireversibil în timpul ciclurilor de clătire cu soluție salină. Doar sorbția moleculelor de apă are loc în timpul variației pH-ului. Rigiditatea și ireversibilitatea BSA adsorbită se datorează dimensiunii mari și greutății moleculare ridicate a BSA. Molecula de BSA formează o multitudine de puncte de contact la interfața aur-lichid prin interacțiuni electrostatice și hidrofobe care împiedică desorbția moleculelor de BSA de la interfață.

Capacul de BSA nu se desprinde de la interfața cu aur nici măcar în cazul modificării puterii ionice a soluției (clătire cu apă deionizată). Clătirea cu apă nu face decât să desorbeze mai multe molecule de apă din stratul de BSA și masa de pe suprafața senzorului scade în continuare (figura 2). Schimbarea puterii ionice a BSA hidratat cu apă pură eliberează mai multe molecule de apă din strat. Stratul de BSA se micșorează până la o grosime de 4,8 nm (atunci când este adsorbit la pH 4,5) și de 4,3 nm (atunci când este adsorbit la pH 7,0), așa cum se arată în figura 6B. Continuarea ciclurilor de clătire cu soluție salină produce același fenomen reversibil de sorbție a apei.

Concluzie

Albumina serică bovină în soluție salină (0,9% NaCl) a fost adsorbită la interfața aur-lichid la pH 7,0 și 4,5. Procesul dinamic a fost măsurat prin QCM-D și confirmat prin AFM, DLS și măsurători ale unghiului de contact. Un fenomen de sorbție a apei reversibil, rapid și dependent de pH este observat pentru stratul de BSA adsorbit prin efectuarea unor cicluri de clătire cu soluție salină la pH 4,5 și 7,0. Moleculele de apă hidratează stratul de BSA la pH 7,0 și îl deshidratează la pH 4,5. Stratul de BSA adsorbit la pH 4,5 este hidratat de 1,4 ori mai multe molecule de apă decât stratul de BSA adsorbit la pH 7,0. Acest fenomen se explică prin conformațiile diferite adoptate de moleculele de BSA adsorbite la pH-uri diferite. În apropierea punctului izoelectric la pH 4,5, moleculele de BSA se neutralizează și se adsorb sub formă de agregate în cantități mari: 6,4 mg/m2. La pH 7,0, moleculele de BSA devin încărcate (repulsie electrostatică) și se adsorb ca un strat de molecule individuale: 5,6 mg/m2. Stratul de molecule BSA agregate (la pH 4,5) adsorbite la interfața cu aurul reține mai multe molecule de apă (570 molecule de apă/BSA) decât stratul de molecule BSA individuale (la pH 7,0), care rețin 450 molecule de apă/BSA. Modificarea puterii ionice prin clătirea stratului de BSA cu apă pură nu face decât să desorbească mai multă apă din structura stratului adsorbit. În toate cazurile, stratul de BSA este rigid și ireversibil adsorbit pe interfața de aur și doar moleculele de apă se adsorb/desorb în timpul ciclului de clătire. Fenomenul observat este important pentru înțelegerea fundamentală și pentru a proiecta noi dispozitive de biodiagnostic și senzori rezistenți.

Declarație privind disponibilitatea datelor

Datele brute care susțin concluziile acestui articol vor fi puse la dispoziția oricărui cercetător calificat de către autori, fără rezerve nejustificate.

Contribuții ale autorilor

VR, CB și BY au efectuat experimentele. VR și GG au efectuat analiza datelor și au redactat manuscrisul.

Finanțare

Această lucrare a fost susținută de Consiliul Australian de Cercetare (ARC), Australian paper, Norske Skog, Orora și Visy prin intermediul grantului Industry Transformation Research Hub IH170100020.

Conflict de interese

Autorii declară că cercetarea a fost efectuată în absența oricăror relații comerciale sau financiare care ar putea fi interpretate ca un potențial conflict de interese.

Material suplimentar

.