Isolarea, caracterizarea și potențialul toxicologic al micotoxinelor Alternaria (TeA, AOH și AME) în diferite specii de Alternaria din diferite regiuni din India

Colectarea și izolarea speciilor de Alternaria

Părțile infectate, cum ar fi frunzele, fructele și tulpinile plantelor bolnave din diferite regiuni din India, au fost colectate și aduse în laborator. Eșantioanele de frunze au fost sterilizate la suprafață cu o soluție de hipoclorit de sodiu de 0,5 %, au fost spălate temeinic cu apă distilată sterilă (SDW) de mai multe ori și au fost plasate pe mediu de cultură de agar dextroză de cartof (PDA) în plăci Petri timp de 3-4 zile. Plăcile PDA care conțineau bucățile de frunze infectate au fost incubate la 28 °C, cu o fotoperioadă lumină/întuneric de 12 ore, timp de 6-10 zile57. Pentru a evita contaminarea bacteriană, mediul a fost suplimentat cu streptomicină. Conidiile au fost produse monosporulate pentru a obține colonii pure, care au fost plasate pe hârtie de filtru sterilizată.

Test de patogenitate

Pentru a determina formele speciale, analiza virulenței izolatelor a fost efectuată pe cultivare de tomate sensibile la Alternaria. Un total de 60 de izolate de Alternaria au fost testate pentru patogenitate. Semințele de tomate au fost scarificate în hipoclorit de sodiu, clătite în apă de la robinet și apoi uscate la aer. Plantele au fost cultivate separat în ghivece. Condițiile fiziologice, cum ar fi temperatura și umiditatea pentru creșterea plantelor, au fost menținute la o temperatură cuprinsă între 28 °C și 32 °C și, respectiv, la o umiditate relativă cuprinsă între 40 și 60%. S-a menținut concentrația optimă de inoculum (2 × 106 spori/ml) și s-a pulverizat pe suprafața frunzelor. Plantele supuse experimentului au fost menținute în camere de rouă timp de 8 ore la 25 °C. Aceste plante au fost monitorizate în mod regulat timp de 2-3 zile pentru a se verifica severitatea infecției și dezvoltarea bolii în raport cu frunza martor care nu a fost inoculată. Simptomele au început să fie vizibile la o zi după inocularea sporilor. Severitatea bolii a fost evaluată de la 1 zi de la inoculare până la 6 zile. Datele au fost analizate statistic prin utilizarea analizei varianței (ANOVA) și a testului lui Duncan (P ≤ 0,05).

Extragerea ADN-ului și identificarea agentului patogen

Patogenul a fost inițial identificat pe baza caracteristicilor morfologice, inclusiv mărimea și forma, și structura conidiei, iar ulterior a fost confirmat prin amplificarea ITS folosind primerii universali ITS1 (5′-TCCGTAGGTGAGAACCTGCGCGG-3′) și ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′) care amplifică regiunile ITS și 5.8S care codifică pentru speciile fungice. Extracția ADN a fost efectuată conform metodei sugerate de Doyle și Doyle58. Covorul miocelar liofilizat de 0,5 g a fost măcinat într-un mortar și un pisălog cu 10 ml de tampon de extracție CTAB și apoi incubat la 65 °C în baie de apă timp de 30 de minute. Proba a fost apoi amestecată cu un volum egal de cloroform/alcool izoamilic răcit și amestecată ușor, urmată de o centrifugare la 10 000 rpm timp de 10 minute la 4 °C. Supernatantul astfel obținut a fost amestecat cu un volum egal de izopropanol și lăsat timp de 2 ore la 4 °C. Proba a fost din nou centrifugată la 10 000 rpm timp de 10 minute la temperatura de 4 °C. Se clătește apoi peletul cu etanol 70% și se usucă la aer timp de 4 ore pentru a se elimina urmele de alcool. Reacția de amplificare ITS rDNA a fost realizată într-un amestec de reacție de 25 μl care conținea 2,5 μl de tampon de reacție 10X, 5 μl de fiecare dezoxiribonucleotid trifosfat (dNTP) și câte 1,0 μl de fiecare amorsă de inițiere directă (ITS1) și inversă (ITS4) pentru ITS și regiunea 5,8 S universală, 0,3 μl de ADN-polimerază Taq, 10-100 ng de ADN și 2,5 μl de MgCl2. Profilul termic optimizat al PCR a fost denaturarea inițială la 95 °C timp de 3 minute, denaturarea la 95 °C timp de 30 de secunde, recoacerea la 70 °C timp de 30 de secunde și extensia finală la 72 °C timp de 1 minut cu 40 de cicluri suplimentare. Amplificarea a fost confirmată pe geluri de agaroză 1% în tampon TBE 0,5X, rulate în paralel cu markerul standard de greutate moleculară a ADN-ului și vizualizate sub transiluminator UV.

Analiză a secvenței ITS

Regiunile ITS rDNA obținute de la izolatele selectate au fost tăiate și purificate ulterior cu ajutorul kitului de purificare QIAquick PCR (QIAGEN, Germania), în conformitate cu instrucțiunile producătorului. Produsele purificate au fost trimise în final la SciGenome Cochin, Kerala, India, pentru secvențiere. Secvențele au fost comparate cu cele din GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) utilizând NCBI BLAST. Analiza BLAST a fost efectuată cu secvențe ITS de lungime completă ca interogări pentru a evidenția relațiile cu secvențele publicate. Cea mai mare omologie și scorul total au fost notate pentru analize ulterioare. Secvențele obținute în cadrul prezentului studiu au fost trimise la GenBank. Secvențele ITS ale tulpinilor de Alternaria din alte formae speciale au fost descărcate din baza de date GenBank a NCBI și au fost utilizate în analizele filogenetice ca secvențe de referință. Toate secvențele ADN au fost aliniate cu ajutorul programului Clustal W inclus în editorul de aliniere a secvențelor BioEdit59, 60. Fișierul de aliniere multiplă rezultat a fost utilizat pentru analizele filogenetice care au fost efectuate cu ajutorul MEGA 5.0 cu metoda Neighbor-Joining, permițând 500 de replici bootstrap61.

Extracția toxinelor din speciile de Alternaria

Extracțiile metaboliților toxici au fost efectuate în conformitate cu metoda lui Andersen et al.62 cu unele modificări. Extracțiile acestor fitotoxine au fost efectuate pe mediu Potato Dextrose Broth (PDB) folosind culturi de 20 de zile. Trei dopuri de agar (3 mm) au fost tăiate din centrul fiecărei colonii de Alternaria și inoculate în 200 ml de mediu PDB. Coloniile agentului patogen au fost tăiate cu ajutorul unui burghiu de plută (5 mm) și apoi coloniile au fost inoculate în mediul PDB. Culturile vechi de 20 de zile au fost filtrate prin hârtie de filtru cu ajutorul unui filtru cu vid. S-a adăugat un volum egal de metanol în filtratele de cultură, s-a amestecat corespunzător și s-a păstrat la 4 °C timp de 24 de ore. Ulterior, filtratul a fost precipitat și s-a evaporat metanolul până la uscare într-un concentrator rotativ cu vid (IKA® RV 10) la 43 °C. La filtratul extras s-a adăugat un volum egal de acetat de etil și s-a amestecat corespunzător în pâlnia de separare. S-au obținut două faze, o fază organică și o fază apoasă. Stratul apos a fost separat și extras cu acetat de etil. Extractul de acetat de etil a fost concentrat la 44 °C în evaporator în vid și dizolvat în metanol.

Purificarea și separarea fitotoxinei Alternaria prin cromatografie pe coloană

Purificarea și separarea compușilor au fost realizate folosind metodologia lui Devi et al.63 cu mici modificări. Cromatografia pe coloană (CC) a fost realizată într-o coloană de sticlă (700 mm × 30 mm), iar ca fază staționară a fost ales gel de silice (Merk cu dimensiunea de 100-120 mesh). Faza mobilă a fost compusă din solvent pur sau din solvenți diferiți în funcție de cerințele condițiilor. Coloana a fost încărcată cu complexe brute extrase din izolate de specii de Alternaria. Pentru separarea metaboliților toxici, faza mobilă a fost compusă din cloroform: metanol (80:20 și 95:05), benzen: acetonă: acid acetic (60:35:05), iar pentru separarea compușilor s-a folosit un raport de eluție în gradient. Diferitele fracții eluate din CC au fost separate prin cromatografie în strat subțire (TLC) și confirmate prin analiza HPLC.

Analiza prin cromatografie în strat subțire (TLC) a fitotoxinelor

Cromatografia în strat subțire (TLC) a fost utilizată pentru a identifica diferitele fitotoxine produse de sporii mari și mici ai speciilor de Alternaria identificate. TLC a fost realizată prin utilizarea metodei lui Andersen et al.64. În această metodă, 4,5 g de silicagel G254 (13% CaSO4 ½ H2O ca liant) au fost adăugate cu 25 ml de apă bidistilată și agitate cu ajutorul unei tije de sticlă până când s-a format o suspensie de silicagel. După care suspensia a fost aplicată ușor pe o placă de sticlă și plasată într-un loc sigur pentru uscare la aer. Pentru separarea diferitelor fitotoxine s-au utilizat diferite faze mobile în proporție de cloroform: metanol (80:20; v/v), benzen: acetonă: acid acetic (60:35:5; v/v), cloroform: metanol (95:5; v/v), acetat de etil: benzen (95:5; v/v). Aceste amestecuri de solvenți au fost apoi plasate în desicatoare și au fost lăsate timp de 30 de minute pentru a satura mediul din interiorul acestora. Înainte de efectuarea TLC, plăcile de sticlă acoperite cu silicagel au fost încărcate prin introducerea lor în cuptor la 60 °C timp de 10 min. După încărcare, probe de 5 µl au fost punctate în puncte diferite la 2 cm distanță de bază. După ce au fost aplicate probele, plăcile TLC au fost uscate într-un desicator timp de câteva minute. Petele rezultate au fost dezvoltate prin expunerea plăcilor TLC la clorură ferică etanolică de 0,2% și/sau vizualizate sub lumină UV la 365 nm. Plăcile TLC au fost apoi uscate la aer peste noapte, după care s-au calculat valorile Rf. Petele de diferiți metaboliți ale căror valori Rf au fost găsite similare cu valorile Rf ale standardelor au fost răzuite, dizolvate în metanol de calitate HPLC și utilizate pentru analiza HPLC.

Analiză HPLC-UV

Prepararea standardului

TeA (nr. cat.: T1952), AOH (nr. cat.: A4675) și AME (nr. cat.: A4678) au fost achiziționate de la Biogenuix (LKT laboratories, Inc., New Delhi, India) și au fost utilizate sub formă cristalizată pentru a pregăti standardul. Soluția stoc (1000 µg ml-1) și o soluție de lucru separată de (10 µg ml-1) de toxine au fost preparate în metanol de calitate HPLC și păstrate la -20 °C pentru utilizare ulterioară. Aceste toxine au fost utilizate ca etaloane pentru calibrarea HPLC și pentru alte experimente suplimentare prin diluarea soluțiilor de lucru pregătite.

Condiții de analiză HPLC-UV

Pentru analiza HPLC, probele au fost separate cromatografic folosind o bază dezactivată (250 mm lungime × 4.6 mm, dimensiunea particulelor 5,0 µm) C18 Waters Spherisorb, coloana ODS2 (produs nr.: PSS831915, SUA) care a fost conectată la coloana de gardă, la sistemul de serie Waters (Waters, Waters Corporation, Milford, SUA) având detector UV-VIS (2998 PDA) și controler de sistem Waters 600E. Detectorul 2998 PDA a fost setat la 254 nm ca lungime de undă de integrare. Probele au fost injectate cu ajutorul unei bucle de 10 μl a autosamplerului Waters 717plus (Waters Corporation, Milford, SUA). Coloana și coloana de gardă au fost controlate termostatic la 28 °C. Debitul a fost de 0,70 ml/min, iar faza mobilă a fost compusă din 75 % metanol de calitate HPLC (solvent A), 25 % dintr-o soluție apoasă (solvent B) de tampon fosfat 0,1 M adăugat 900 ml DW pentru 1 litru și pH 5,8 menținut cu acid fosforic. Instrumentul a funcționat într-un mod izocratic liniar, iar detecția a fost monitorizată în intervalul 200-400 nm. Fiabilitatea metodei HPLC pentru analiza AME, TeA și AOH a fost validată prin intermediul limitei de detecție (LOD) și a limitei de cuantificare (LOQ).

Analiză LC-MS/MS

Pentru confirmarea suplimentară a toxinelor Alternaria (AME, AOH și TeA), a fost realizată o metodă cromatografică – spectrometrică de masă în tandem (LC-MS/MS) cu ușoare modificări ale lui Tölgyesi et al.65 . Metoda implică o extracție solid-lichidă cu metanol și o derivatizare ulterioară pentru TeA, AOH și AME. Apoi, probele au fost purificate cu extracție în fază solidă pe cartușe pe bază de polimeri și, în final, toxinele au fost separate prin LC-MS/MS. Pentru analiza LC-MS/MS, probele au fost pregătite în etape.

Reactanți, solvenți și prepararea standardului

Calibranții analitici uscați de AME, AOH și TeA au fost achiziționați de la Biogenuix (LKT laboratories, Inc., New Delhi, India). Standardele au fost reconstituite cu 1,0 ml de metanol pentru a obține soluții stoc de 0,1 mg ml-1 . Toate soluțiile stoc au fost păstrate la 4 °C. 2,4-dinitrofenilhidrazina (DNPH) și undecanal au fost achiziționate de la Sigma-Aldrich. Reactivul de derivare (0,58% DNPH în soluție de HCl) a fost preparat așa cum a fost descris de Siegel et al.7. Reactivul de oprire a fost 5% (v/v) undecanal în metanol. Soluțiile standard de TeA, AOH și AME derivatizate (1,91 μg/ml, 2,54 μg/ml și, respectiv, 2,71 μg/ml de metanol) au fost preparate prin amestecarea a 1 ml din soluțiile metanolice de TeA, AOH și AME de 10 μg/ml cu 1 ml de soluție de DNPH. Amestecul a fost lăsat peste noapte și a fost prelucrat așa cum este scris în secțiunile de extracție a probei și de curățare SPE. Volumul final a fost ajustat la 10 ml cu metanol. Aceste soluții au fost utilizate pentru a optimiza condițiile LC-MS/MS pentru analiză. S-a preparat un tampon total de 50 mM de formiat de amoniu în apă și s-a ajustat pH-ul acestuia la 3,0 cu acid formic. Metanolul și acetonitrilul au fost de calitate LC-MS obținute de la Sigma-Aldrich. Acetatul de etil, n-hexanul, diclorometanul, acidul formic și formatul de amoniu au fost de calitate HPLC și au fost achiziționate de la Merck (Darmstadt, Germania). Coloana Kinetex C-18 UPLC LG 500 (3 × 100 mm, 2,6 μm), cartușele Strata SPE (6 ml, 200 mg) și filtrele cu seringă din celuloză regenerată (RC) (15 mm, 0,45 μm) au fost obținute de la Phenomenex (Utrecht, Țările de Jos). Coloanele Supelco Ascentis Express C-18, ciano (ES-CN) și fenil-hexil HPLC (2,1 × 100 mm, 2,7 μm) au fost achiziționate de la Sigma- Aldrich. Probele de toxine standard, utilizate pentru dezvoltarea metodei, au fost achiziționate de la Biogenuix (LKT laboratories, Inc., New Delhi, India). Probele au fost depozitate la -20 °C până când au fost supuse analizei.

Extragerea probelor

Probele de extracție a metaboliților brute au fost purificate prin metoda cromatografiei pe coloană, iar fracțiunea a fost eluată și dizolvată în metanol. 50 ml de probă din fiecare fracție au fost amestecate în tuburi de centrifugă din polipropilenă (PP) de 50 ml, care au fost apoi sigilate. Probele au fost amestecate în vortex timp de 5 secunde și au fost agitate orizontal pe un agitator CAT S50 la o viteză de 600 min-1 timp de 45 de minute la temperatura ambiantă. Apoi, tuburile au fost centrifugate la 5.000 rpm timp de 10 min la 20 °C, iar stratul superior a fost colectat într-un nou tub de centrifugă PP de 50 ml. La probă s-au adăugat 100 μl de reactiv de derivatizare (0,596% DNPH în 2 mol/lit HCl) și s-a amestecat în vortex timp de 5 sec. Proba a fost lăsată să fie derivatizată timp de 1 oră la temperatura ambiantă. După aceea, s-au adăugat 500 μl de reactiv de oprire 5% (v/v) undecanal în metanol și s-a amestecat în vortex timp de 5 secunde. Proba a fost lăsată să stea în repaus timp de 30 de minute și apoi a fost diluată în tubul PP până la 35 ml cu un tampon de formiat de amoniu 50 mM (pH 4, ajustat cu acid formic). Proba se centrifughează la 5 000 rpm timp de 10 min la 20 °C și se supune curățării prin extracție în fază solidă.

Curățarea prin extracție în fază solidă (SPE)

Cartușele Strata-XL (200 mg, 6 ml, 100 μm) au fost condiționate cu 6 ml de metanol, urmat de 6 ml de apă și 6 ml de tampon formiat 50 mM. Rezervoare de 75 ml au fost conectate la cartușe și probele au fost încărcate în rezervoare. Apoi, probele au fost trecute în picături. Ulterior, coloanele SPE se spală cu 6 ml de metanol-apă (15/85, v/v) și apoi cu 6 ml de n-hexan. Cartușele au fost uscate în vid timp de 5 minute înainte de eluarea probelor în tuburi de sticlă cu 5 ml de metanol. Probele au fost evaporate până la uscare la 45 °C sub un curent ușor de azot și au fost dizolvate din nou în 250 μl de metanol prin amestecare în vortex timp de 20 de secunde. Ca o etapă finală, probele au fost filtrate prin filtre de celuloză regenerată în flacoane HPLC.

Instrumentație și echipamente

Dezvoltarea metodei a fost efectuată utilizând un Ascentis Express C-18 (2,1 × 100 mm, 2.7 μm) UPLC LG 500 nm (Accucore RP-MS 100 × 3,0 MM, 2,6UM, ACQ-TQD-QBB1152, detector Waters acuity PDA, Waters Corporation, Milford, MA, SUA) cuplat la un detector MS triplu cuadripolar MassLynx (Waters, Milford, MA, SUA). Achiziția și evaluarea datelor au fost efectuate cu MassLynx versiunea 4.0. Metoda finală a fost, de asemenea, transferată pe un sistem LC-MS/MS Thermo ACQ-TQD Quantum Ultra LC-MS/MS (Thermo Finnigan, San Jose, CA, SUA) care a implicat o pompă binară Waters acquity QSM (SN- L10QSM943A), un autosampler Waters acquity fin (SN-M10SDI443M), un termostat de coloană și un detector MS triplu cuadripolar TQD Quantum Ultra. Temperatura țintă a coloanei și temperatura țintă a probei au fost de 30 °C și, respectiv, 10 °C. Achiziția și evaluarea datelor au fost efectuate cu ajutorul software-ului Xcalibur 2.0.7. SP1. Ambele sisteme au fost echipate cu o interfață de electrospray (ESI) în care s-a utilizat doar ionizarea negativă în timpul achiziției. Azotul a fost utilizat ca gaz de uscare și de coliziune. Parametrii sursei de ioni sunt rezumați în tabelul suplimentar S2. Mai mult, transferabilitatea metodei a fost investigată cu un sistem LC-MS/MS care a constat dintr-un HPLC Agilent 1100 cuplat la un MS triplu cuadripolar AB Sciex 4000 (Framingham, MA, SUA).

Condiții de instrumentare

Toxinele de Alternaria sunt separate pe o coloană UPLC Ascentis Express C-18 (2,1 × 100 mm, 2,7 μm) echipată cu o precolumnă C-18 de 2,1 mm, utilizând eluție cu gradient liniar. Patru solvenți (solvenți A, B, C și D) au fost amestecați cu ajutorul pompei binare. Solventul A conținea; acetonitril (ACN) + apă (5:95), solventul B conținea; ACN: 5% alcool izopropilic (IPA), solventul C conținea; 100% metanol și solventul D conținea; acetat de amoniu pur. Debitul a fost de 0,5 ml/min. Faza mobilă a solvenților în timpul inițial a fost 0,0 % A, 30 % B, 30 % C și 40 % D. La timpul final (5 min), solvenții au fost 0,0 % A, 30 % B, 30 % C și 40 % D. A fost necesară o etapă de spălare suficientă în programul de gradient pentru a elimina soluanții lipofili acumulați din matrice. Timpul total de analiză a fost de 5 minute. Termostatul coloanei a menținut temperatura la 30 °C, iar volumul de injecție a fost de 1,0 μl. Autosamplerul a funcționat la 20 °C.

Sistemul UPLC LG 500 nm a fost cuplat la un detector MS/MS (Micromass Quattro Ultima PT) prin intermediul unei interfețe de electrospray (ESI) care funcționează în mod negativ. Setările ESI optimizate au fost următoarele: temperatura sursei 120 °C, temperatura de desolvare 350 °C, debit de gaz de uscare 650 L/Hr, debit de gaz de con 30 L/Hr și tensiune capilară 3,50 kV. Azotul este utilizat ca gaz de uscare și de coliziune (2,67 × 10-6 bar). Modul de reacție de monitorizare multiplă (MRM) a fost aplicat în MS în timpul detecției și au fost scanate două tranziții ionice pentru fiecare toxină țintă. Modul MRM a fost aplicat în detectorul MS/MS și au fost înregistrate două tranziții ionice (cuantificator și calificativ) pentru fiecare compus țintă. Tranzițiile ionice selectate cu tensiuni optimizate (con sau lentilă tubulară), energii de coliziune (CE) și timpi de așteptare sunt rezumate în tabel (tabelul suplimentar S2).

Evaluarea potențialului toxicologic al diferitelor micotoxine de Alternaria (TeA, AOH și AME)

Măsurarea gradului de moarte celulară indusă de diferite micotoxine a fost determinată prin metoda de inoculare cu frunze detașate. Pentru aceasta, eșantioane de frunze proaspete au fost detașate de pe plantele cultivate în seră și spălate corespunzător timp de 3-4 minute în apă curentă de la robinet, sterilizate în hipoclorit de sodiu 1,0% (0,01 g/ml) timp de aproximativ 1 minut, apoi șterse la suprafață cu etanol 70% și, în final, clătite aseptic și complet cu apă distilată sterilă. În cele din urmă, frunzele au fost așezate pe hârtie de filtru umezită și înțepate cu un ac steril pe suprafața inferioară. Toxinele au fost dizolvate în apă deionizată sterilă la o concentrație de 100 μg/ml. Picături (100 μl) din fiecare dintre cele trei toxine au fost injectate în frunzele rănite cu un ac fin (Dispovan, 1 ml). O probă de control a fost ajustată prin injectarea de apă distilată sterilă. Mostrele de frunze tratate au fost menținute în interiorul unei camere umede (temperatura de 27 ± 0,5 °C și umiditate relativă de 60 %) în condiții de seră (ciclu de 14 ore de lumină și 10 ore de întuneric la 27 °C). S-a efectuat o observație regulată (la fiecare 24 de ore, timp de 6 zile) pentru a descoperi orice modificări relevante pentru efectele toxicologice dezvoltate în probele injectate în raport cu probele de control. Setul experimental a fost realizat în trei repetiții, iar procentul de suprafață foliară afectată din cauza morții celulare induse de toxicitate a fost măsurat cu (Systronic leaf area meter 211) și calculat prin formula de mai jos.

Determinarea morții celulare prin testul de absorbție a albastru Evans

Pierderea viabilității celulare (moarte celulară) a fost evaluată prin metoda de colorare cu albastru Evans (Baker și Mock, 1994). Frunzele de tomate au fost tratate cu aceeași concentrație (250 μg/ml) a tuturor celor trei toxine. Frunzele tratate au fost colorate cu 0,25% (v/v) soluție apoasă de albastru Evans timp de 15 minute. După ce au fost spălate cu apă distilată timp de 30 de minute, frunzele au fost excizate și îmbibate cu 500 µl de N, N-dimetilformamidă timp de 1 oră la temperatura camerei. Densitatea optică a albastru Evans eliberat a fost măsurată spectrofotometric la 600 nm.

Analiză statistică

Analiza statistică a fost efectuată cu ajutorul IBM SPSS Statistics ver. 20 software prin intermediul analizei varianței (one-way ANOVA) urmată de testul Duncan’s multiple range la un nivel de semnificație P ≤ 0,05. Datele au fost exprimate ca medie ± deviația standard (SD) a cel puțin trei replici ale fiecărui metabolit. Analizele statistice ale datelor au fost analizate în cazul a 48 de izolate selectate de specii de Alternaria care au fost de natură patogenă.