Noi perspective asupra structurii și funcției apoptosomei

Informațiile structurale timpurii au fost critice în dezvăluirea organizării domeniului apoptosomei. Apoptosomul uman conține șapte molecule Apaf-1 dispuse simetric într-o structură în formă de roată pentru a forma un butuc central alcătuit din NOD cu șapte brațe HD2 extinse, fiecare terminându-se într-o regiune în formă de V care este formată de cele două β-propulsoare . Pliurile α/β ale NBD și HD1 leagă ADP/dATP între ele, în timp ce repetițiile WD40 formează elicele β cu 7 și 8 palete . Contrar sugestiilor anterioare, s-a constatat că interacțiunile laterale dintre pliurile α/β ale moleculelor Apaf-1 adiacente sunt utilizate pentru a organiza butucul central, în timp ce CARD-urile N-terminale se află deasupra acestui inel și sunt dezordonate în absența pc-9 (PDB 3J2T) . Cu toate acestea, structurile aproape atomice recente au demonstrat că CARD-urile Apaf-1 formează o caracteristică asemănătoare unui disc pe suprafața apoptosomei active în prezența CARD-urilor pc-9, iar această dispunere diferă de cea găsită în CED-4 și Dark (figurile 1 și 2) . Stabilitatea butucului central este menținută de o rețea complexă de interacțiuni α-helicoidale, legături de hidrogen și punți de sare între modulele NBD și HD1 adiacente din moleculele Apaf-1 vecine . Contactele WHD/HD1 de pe protomerii adiacenți par să susțină asamblarea apoptosomului cu domeniile WHD care fac punte între domeniile NBD și HD1 adiacente . Așa cum se întâmplă în Dark, helixul ISM din Apaf-1 (α12) este împerecheat cu helixul α13 prin interacțiuni hidrofobe extinse pentru a forma un motiv helix-loop-helix în fiecare subunitate, care, la rândul său, interacționează lateral cu subunitățile adiacente pentru a forma un gard elicoidal care căptușește porul central din inel .

În celulele sănătoase, monomerii Apaf-1 există într-o conformație închisă, inactivă, cu ADP încorporat într-o crăpătură în interfața NBD-HD1 (PDB 1Z6T, 3SFZ) . Această conformație închisă prevestește cerința unor modificări conformaționale extinse ale monomerului pentru a facilita asamblarea apoptosomului. Spre deosebire de formarea apoptosomului la C. elegans și Drosophila, citocromul c eliberat din mitocondrii în timpul semnalizării apoptozei se leagă de Apaf-1 monomer, ceea ce declanșează modificări conformaționale care conduc la schimbul de nucleotide (ATP sau dATP poate înlocui ADP) și oligomerizarea ulterioară a unui Apaf-1 extins pentru a forma apoptosomul (Fig. 3) . Pentru a înțelege modificările conformaționale care au loc, sunt necesare modele precise ale stărilor inactive și extinse ale Apaf-1. Au fost determinate două structuri cristaline ale monomerilor inactivi ai Apaf-1 cu ADP legat, una lipsită de propulsoare β, iar cea de-a doua lipsită de domeniile CARD N-terminale pentru a facilita cristalizarea. Cu toate acestea, NOD în aceste două forme cristaline este practic identic și acest lucru a permis construirea unui model consensual pentru întregul monomer Apaf-1 cu ADP legat. Structuri aproape atomice ale apoptosomei umane au fost realizate acum de mai multe grupuri folosind crio-EM cu o singură particulă, pentru a oferi informații despre conformația extinsă a Apaf-1 în absența și în prezența pc-9 (PDB 3JBT, 5JUY, 5WVE; Fig. 3) . După cum s-a prezis , conformația Apaf-1 în hub-ul central, brațele HD2 și regiunea de reglare este în esență identică atât în apoptosomii inactivi, cât și în cei activi . Aceste studii au furnizat detalii importante despre reziduurile specifice implicate în contactele van der Waals interdomeniu în cadrul moleculelor unice de Apaf-1, au dezvăluit reziduuri critice pentru interacțiunile de domeniu care stabilizează apoptosomul activ și au arătat interacțiuni în cadrul domeniului senzorial în formă de V al elicei β în tandem cu 7 și 8 palete, care formează suprafața de legare a citocromului c

În apoptosomul Apaf-1, situsul de legare a dATP este situat la interfața NBD-HD1 și este format parțial de bucla Walker A și de bucla dintre HD1 și WHD. În timp ce Apaf-1 poate lega ADP în stare inactivă, există o mică preferință de a utiliza dATP pentru asamblarea apoptosomului in vitro (revizuit în ref. ), în timp ce ATP este mult mai abundent in vivo (~ 2 mM pentru ATP vs. 10 μM pentru dATP). . O anumită stabilizare are loc prin interacțiuni între un reziduu de arginină (Arg265) din NBD, împreună cu Ser325 și Tyr359 din HD1 și molecula ATP/dATP legată. O rotație a perechii NBD-HD1 în jurul α-helixului 20 din WHD poziționează bucla HD1-WHD în partea de jos a buzunarului pentru nucleotide, ceea ce permite perechii NBD-HD1 să formeze interacțiuni circumferențiale în cadrul butucului central în timpul asamblării. Acest lucru întrerupe, de asemenea, interacțiunile cu WHD care, în mod normal, stabilizează o configurație închisă .

Propulsoarele β-senzor și legarea citocromului c

„Spițele” roții apoptosomei ies în afară din butuc prin domeniile HD2 și fiecare braț formează baza regiunii în formă de V care conține cele două domenii senzor β-propulsor. În cea mai lungă izoformă Apaf-1 (Apaf-1XL), care este exprimată în majoritatea țesuturilor, cele cincisprezece repetări WD40 formează propulsoare β cu 7 și 8 palete în tandem, iar un studiu recent de crio-EM a indicat că aceasta are un mecanism de închidere nou. Această topologie a elicei β este similară cu cea întâlnită la proteina care interacționează cu actina (Aip1p), în care linkerul de la HD2 formează șirul d al ultimei palete din elicea β cu 8 palete (indicată de mica regiune albastră prezentă la începutul elicei cu 7 palete din Fig. 1a), înainte de a se intersecta pentru a forma elicea β cu 7 palete . Această topologie a fost verificată de o structură cristalină a Apaf-1 murin la o rezoluție de 3,0 Å și pare a fi conservată în elicele β întunecate .

În apoptosomul Apaf-1, elicele β în formă de V formează buzunarul de legare a citocromului c, iar interacțiunea cu citocromul c pare a fi stabilizată prin legături de hidrogen și punți de sare . Atât formele reduse cât și cele oxidate ale citocromului c pot interacționa cu apoptosomul pentru a media activarea acestuia . Este interesant faptul că citocromul c pare să interacționeze în mod preferențial cu elicea β cu 8 palete, în timp ce cu elicea β cu 7 palete se formează o suprafață de contact mai limitată . Citocromul c este rezolvat la o rezoluție de ~ 6 Å în noile hărți, din cauza mișcării locale, iar molecula este rotită cu ~ 90°, în raport cu un model anterior bazat pe andocarea moleculară într-o hartă în care elicele nu au fost rezolvate . Mutageneza dirijată a scos la iveală reziduuri critice în citocromul c necesare pentru asocierea stabilă cu propulsoarele β ale Apaf-1, iar unele dintre aceste reziduuri (G56, P76, I81) sunt importante pentru formarea apoptosomului și activarea ulterioară a caspazei .

Moleculele Apaf-1 trunchiate lipsite de regiunile de repetiție WD-40 se pot, de asemenea, asambla pentru a forma apoptosomi care sunt constitutiv activi, dar se dezasamblează în timp . Acest lucru a sugerat că propulsoarele β pot fi oarecum inhibitoare pentru asamblare, stabilizând în același timp apoptosomul Apaf-1 . Cu toate acestea, propulsoarele β din apoptosomul Apaf-1 sunt situate la o rază mare și nu interacționează cu subunitățile adiacente și nici cu alte domenii din monomer, cu excepția HD2. Prin urmare, mecanismul de destabilizare rămâne misterios. Deși speculativ, lipsa propulsoarelor β în apoptosomele trunchiate ar putea slăbi interacțiunile HD2 cu hub-ul central, ceea ce ar duce la o dezasamblare dependentă de timp.

Este acum clar că legarea citocromului c determină o rotație în sus a regiunii β-propulsoare, care întrerupe conexiunea dintre β-propulsoarele cu 7 lamele și perechea NBD-HD1 în monomerul Apaf-1 inactiv , în timp ce β-propulsoarele cu 7 lamele se rotesc spre β-propulsoarele cu 8 lamele într-o mișcare de strângere . Aceste evenimente destabilizează conformația autoinhibată a Apaf-1 și facilitează schimbul de nucleotide prin promovarea unor modificări conformaționale care expun buzunarul de legare a ADP pentru a permite legarea ATP/dATP . Acest lucru stabilizează monomerul Apaf-1 într-o conformație extinsă, astfel încât acesta poate interacționa cu protomerii vecini. Experimentele de deplasare a benzii sugerează că schimbul de nucleotide și modificările conformaționale asociate în Apaf-1 pot avea loc ca răspuns la legarea citocromului c, deoarece nu au fost detectate modificări semnificative în conformația Apaf-1 cu adăugarea de dATP în absența citocromului c . Luate împreună, aceste date susțin un model secvențial în care legarea citocromului c are loc înainte de schimbul de nucleotide, pentru a facilita tranziția de la o conformație închisă la o conformație extinsă a Apaf-1. În plus, aceste constatări indică faptul că repetițiile WD40 acționează ca senzori care declanșează asamblarea inițială a apoptosomului prin legarea citocromului c.

Mecanisme posibile de activare a procaspazei-9

Procaspaza-9 este recrutată de apoptosom pentru a forma o holoenzimă care îi crește activitatea catalitică . În soluție, pc-9 este un monomer constitutiv atunci când nu este legat de Apaf-1, în timp ce caspazele active în general sunt dimeri . În mod remarcabil, o interacțiune dimerică între doi monomeri pc-9 într-o rețea cristalină promovează formarea unui situs activ pe una dintre subunitățile catalitice, în timp ce a doua subunitate rămâne într-o configurație inactivă (PDB 1JXQ), iar un fenomen similar are loc în cazul dimerilor CED-3 la concentrații ridicate . CARD-ul N-terminal din pc-9 interacționează cu CARD-ul (CARD-urile) Apaf-1 pentru a recruta procaspaza apicală în apoptosom și acest lucru promovează activarea domeniului catalitic, care este separat de CARD printr-un liant lung (Fig. 2a) . În plus, subunitățile p20 și p10 ale domeniului catalitic sunt, de asemenea, conectate printr-un liant care este supus autoclavării . Astfel, pentru a înțelege modul în care pc-9 este activată, trebuie să înțelegem rolul CARD-urilor și al linkerilor pc-9 în holo-apoptosom.

Au fost propuse diferite modele care explică mecanismele de activare a pc-9 de către apoptosom . „Modelul dimerizării induse de proximitate” prezice că recrutarea moleculelor pc-9 la apoptosomul Apaf-1 poate facilita homodimerizarea, care se crede că duce la autoactivarea pc-9 . Cu toate acestea, până de curând, nicio dovadă structurală sau biochimică nu a demonstrat că pc-9 este homodimerică atunci când este legată de apoptosom (a se vedea mai jos ). „Modelul conformației induse” a propus că apoptosomul Apaf-1 este o platformă care se leagă pc-9 pentru a facilita conformația sa activă . Modelarea recentă a sugerat că activarea pc-9 este mediată în primul rând prin intermediul reglării alosterice de către platforma apoptosomului . În toate aceste modele, o funcție primară a apoptosomei este aceea de a asambla un complex multimeric între Apaf-1 și pc-9 CARD pentru a facilita activarea pc-9 prin creșterea concentrației locale a zimogenului . În plus, datele referitoare la un pc-9 modificat, care este un dimer constitutiv în soluție, sugerează că CARD-ul și linkerul său pot inhiba domeniile catalitice . Prin urmare, formarea unui heterodimer CARD pe apoptosom poate elibera această inhibiție, însă această idee rămâne de testat.

În timp ce dimerizarea poate juca un rol cheie în activare, modul în care aceasta are loc pe apoptosom a rămas neexplicat și, de fapt, date recente au sugerat posibilitatea unui mecanism de activare mai complicat care implică atât homodimerizarea moleculelor pc-9, cât și formarea unui heterodimer al unui singur domeniu catalitic pc-9 cu NBD al Apaf-1 . În mod curios, o conformație inactivă a monomerului Apaf-1 nu împiedică legarea pc-9 prin intermediul interacțiunilor CARD-CARD, așa cum s-a demonstrat prin experimente de deplasare a benzii . Astfel, heterodimerii pc-9/Apaf-1 pot fi recrutați la apoptosomul în curs de asamblare ca parte a activării acestuia (Fig. 3). Rămâne o întrebare deschisă dacă asamblarea Apaf-1 în prezența pc-9 este ghidată de interacțiuni suplimentare între CARD-uri în discul nazal.

O structură cristalină inițială a dezvăluit un complex stabil 1:1 între domeniile CARD ale Apaf-1 și pc-9 cu o interfață complementară (cunoscută sub numele de tip I), care este indispensabilă pentru activarea pc-9 . Cu toate acestea, acest complex stabil 1:1 s-a dovedit ulterior a fi insuficient pentru a activa pc-9 . În schimb, CARD-urile Apaf-1 și pc-9 formează complexe oligomerice de ordin superior, stabilizate în primul rând de două dintre cele trei interfețe posibile (cunoscute sub numele de TipI, II și III), care se regăsesc și în alți complecși ai domeniului morții . Compararea interacțiunilor implicate în discul CARD-CARD în apoptosomele CED-4, Dark și Apaf-1, evidențiază o anumită conservare a interfețelor de tip II și III, interacțiunile CARD de tip I regăsindu-se doar în apoptosomul uman . O structură cristalină recentă la o rezoluție de 2,1 Å a dezvăluit un complex heterotrimeric format din două CARD-uri Apaf-1 cu un CARD pc-9 intercalat între ele . S-a demonstrat că interacțiunile de tip II care implică reziduuri din CARD-urile pc-9 (Arg36/ Arg65) și Apaf-1 (Glu78) sunt esențiale pentru activarea pc-9, împreună cu interacțiunile de tip I descrise anterior. Mai mult, un singur reziduu (Glu41 în CARD Apaf-1) poate forma o interacțiune bifurcată cu un CARD pc-9 într-o interfață minimă de tip III . Interacțiunile suplimentare cu Lys58 și Lys62 de pe CARD-ul Apaf-1 s-au dovedit a fi, de asemenea, necesare pentru activarea pc-9 și pot contribui la poziționarea CARD-urilor Apaf-1 pe platformă . Astfel, formarea unui complex CARD heterotrimeric oferă un mijloc de a lega mai multe domenii catalitice pc-9 de platforma apoptosomului .

Două structuri cu rezoluție aproape atomică ale apoptosomului Apaf-1 activ au dezvăluit că arhitectura generală a aranjamentului de discuri al CARD-urilor Apaf-1 și pc-9 creează un disc înclinat care se află deasupra butucului central (Figurile 2 și 3) . Nepotrivirea de simetrie dintre disc și platformă are ca rezultat o poziționare acentrică a discului CARD atunci când este privit de sus (Fig. 3) . Discul poate fi descris ca o spirală de perechi de CARD-uri Apaf-1 și pc-9, cu patru CARD-uri Apaf-1 formând un „strat” inferior, în timp ce trei sau patru CARD-uri pc-9 sunt prezente pe suprafața superioară (Fig. 2b-d). În plus, CARD-urile Apaf-1 se deplasează mai departe de suprafața butucului central, pe măsură ce se deplasează în spirală în sus, într-o manieră stângace și, prin urmare, au conformații diferite ale legăturii și interacțiuni diferite cu NBD-urile lor cognate din butucul central. Perechile CARD Apaf-1 și pc-9 interacționează prin interfețe de tip II și se unesc lateral în jurul spiralei în principal prin interacțiuni de tip I. În mod remarcabil, doar patru din cele șapte CARD-uri Apaf-1 interacționează cu CARD-urile pc-9 din disc . Acest lucru se datorează faptului că cele trei molecule CARD Apaf-1 rămase nu se potrivesc cu ușurință în modelul de legătură între subunități al spiralei și nu pot continua spirala deoarece legăturile lor CARD-NBD sunt prea scurte . CARD-urile Apaf-1 de la subunitățile adiacente din apoptosom sunt localizate la o cusătură (între pozițiile 1a și 7a), unde spirala se oprește din alungirea verticală (Fig. 2c, d) . Formarea discului CARD Apaf-1/pc-9 este necesară pentru activarea apoptosomei, iar domeniile catalitice pc-9 sunt legate în mod flexibil de CARD-uri prin intermediul unui liant (Fig. 2a) . Într-o structură, a fost vizualizat un disc cu patru CARD-uri Apaf-1 și trei CARD-uri pc-9, cu o densitate slabă care indică faptul că un al patrulea CARD pc-9 ar putea să se lege de vârful spiralei elicoidale la o ocupare mai mică . Într-o a doua structură, configurația predominantă a discului conținea 8 CARD-uri, conformația CARD-urilor în spirală fiind foarte asemănătoare între cele două structuri rezolvate independent (a se vedea suprapunerea, Fig. 2d). Variațiile pH-ului și ale concentrației de sare pot explica ocuparea diferită în cea de-a opta poziție. Astfel, asamblarea apoptosomului favorizează recrutarea și concentrarea locală a CARD-urilor pc-9, ceea ce permite formarea unui nou oligomer elicoidal cu 7 sau 8 CARD-uri.

O analiză recentă (prin MALS și SAXS) a arătat că formarea complexului CARD este dependentă de concentrație și cantități egale de CARD-uri Apaf-1 și pc-9 se asociază ca perechi prin interfața de tip I mai puternică, cu un complex predominant 3:3 format la concentrații ridicate în soluție . Acest complex CARD a fost cristalizat și structura a fost determinată la o rezoluție de 3,0 Å pentru a dezvălui o spirală stângace de trei perechi CARD Apaf-1/pc-9 cu o conformație similară cu cea observată în apoptosom, dar cu unele diferențe (PDB 5WVC; Fig. 2e) . Cu toate acestea, mediul din cristal este destul de diferit de cel întâlnit pe apoptosomul în asamblare, datorită, în parte, contactelor de rețea și lipsei unei suprafețe de nucleare cu restricții impuse de legăturile CARD-NBD. Acest lucru poate explica diferențele observate între structurile CARD elicoidale. Aceasta include adăugarea a una sau două CARD suplimentare la spirala în formă de disc din holo-apoptosom și existența a patru CARD Apaf-1 care formează baza discului, în loc de trei, așa cum se găsește în soluție și în cristal. După alinierea optimă a discului de 8 CARD cu spirala de 6 CARD din structura cristalină, există o bună congruență între CARD-urile din pozițiile 2p, 3a și 4p, cu o oarecare divergență în ultima jumătate a spiralei de 6 CARD (Fig. 2f, g). În special, CARD-ul Apaf-1 din poziția 7a este deplasat pe verticală într-o poziție intermediară, în absența CARD-ului Apaf-1 din poziția 1a (Fig. 2g). Astfel, interacțiunile dintre platformă și discul CARD sunt esențiale pentru a nuclea spiralele mai mari de 7 și 8 CARD care se găsesc pe apoptosom.

În timpul asamblării discului, nuclearea spiralei poate avea loc în diferite moduri, inclusiv formarea unui heterotrimer CARD alcătuit din două CARD Apaf-1 și un CARD pc-9, cu un CARD Apaf-1 situat la baza spiralei (în poziția 1a). Adăugarea ulterioară a două perechi de CARD Apaf-1/pc-9, care interacționează prin interfețele lor de tip I, poate avea loc apoi, în unele cazuri, cu o închidere finală a spiralei cu un CARD pc-9 în poziția 8p. Cu toate acestea, sunt posibile și alte permutări, având în vedere natura flexibilă a legăturii Apaf-1 CARD-NBD, astfel încât trei perechi Apaf-1/pc-9 CARD de „tip I” pot fi nucleate secvențial de la nucleul central, cu adăugarea unui CARD Apaf-1 la baza spiralei (în poziția 1a), în timpul etapelor timpurii de asamblare. Este important faptul că asamblarea discului poate fi cooperantă pentru a menține spațierea adecvată a celor patru CARD-uri Apaf-1 de pe apoptosom, care formează baza spiralei .

Pentru apoptosomul activ, o diferență majoră este evidentă pe butucul central, atunci când se compară structurile publicate (figurile 3 și 4) . Pe scurt, densitatea identificată ca fiind un domeniu catalitic al pc-9 (p20/p10) este localizată pe butucul central într-o hartă 3D recentă, iar această caracteristică s-a dovedit a fi prezentă în aproximativ 50% din complexe . În plus, o densitate similară a fost vizualizată într-o hartă anterioară de rezoluție mai mică a holo-apoptosomului, care a permis o andocare rezonabilă, deși preliminară, a subunităților p20/p10 ; prin urmare, caracteristica observată este reproductibilă. Cu toate acestea, această densitate nouă a fost vizualizată doar la rezoluție scăzută, ceea ce poate reflecta o anumită flexibilitate în atașarea subunităților p20/p10 la hub-ul central. Într-o hartă cu rezoluție aproape atomică determinată de grupul lui Yigong Shi , o densitate suplimentară în formă de seceră a fost rezolvată la o rezoluție de ~ 7 Å pe butucul central, adiacent la discul CARD. Această densitate conține în mod clar un CARD pc-9 suplimentar în centru, care interacționează cu două CARD Apaf-1 situate de o parte și de alta, într-un mod similar cu cel observat în două structuri cristaline . Cu toate acestea, această configurație heterotrimerică a putut fi rezolvată doar în ~ 10% din particule . Astfel, se pare că condițiile experimentale din timpul preparării probelor și al congelării grilei pot influența modul în care pc-9 interacționează cu potențialele situsuri de legare de pe butucul central, inclusiv formarea unei spirale în formă de disc cu un număr variabil de CARD-uri pc-9 și în utilizarea situsurilor de legare care sunt situate adiacent la discul acentric. Atunci când cele două structuri asimetrice recente ale holo-apoptosomei sunt aliniate pe baza discurilor lor CARD, vârfurile de densitate noi situate pe hub-ul central se află în locații destul de distincte (Fig. 4). În timp ce domeniul catalitic pc-9 (p20/p10) poate fi localizat în două poziții (cea mai probabilă fiind prezentată în Fig. 4c) , densitatea celor trei CARD este rotită și are un profil diferit atunci când este privit din lateral (nu este prezentat), în comparație cu cel al domeniului catalitic pc-9 (Fig. 4b, d). Modelul densității legăturilor de legare Apaf-1 CARD-NBD permite o cartografiere precisă a tuturor legăturilor relevante CARD-NBD în holo-apoptosomul cu trei CARD cu șase CARD-uri Apaf-1 ordonate (Fig. 4d) . În mod critic, lungimea linkerului (~ 25-30 Å) și pozițiile relative ale linkerului pot împiedica legarea unui modul cu trei CARD la poziția 1 sau 2 de pe hub-ul central. Astfel, se pare că există mai multe locuri pe butucul central care pot fi utilizate în moduri distincte pentru a lega un CARD pc-9 sau un domeniu catalitic.

S-a estimat că procaspaza-9 se leagă de apoptosom cu rapoarte între 2-5 zimogeni la 7 molecule Apaf-1 , astfel încât se pare că numărul exact de molecule pc-9 legate de apoptosom poate varia în funcție de condițiile din timpul asamblării, ceea ce poate reflecta natura dinamică a acestei mașini proteolitice. Prin extensie, pare clar că un al șaselea sau un al șaptelea CARD pc-9 nu este legat de omologii lor Apaf-1, în raport cu siturile deja documentate pe apoptosom, ceea ce poate reflecta fie o limitare sterică, fie necesitatea unui oligomer mai mare pentru a stabiliza CARD pc-9 legat. În mod important, unele domenii catalitice pc-9 nu sunt observate în hărțile actuale de densitate crio-EM, din cauza atașării lor flexibile prin intermediul legăturilor lungi CARD-p20, ceea ce face dificilă descifrarea și înțelegerea mecanismelor precise de activare, subliniind în același timp necesitatea unor studii suplimentare cu o singură moleculă.

Funcția principală a apoptosomului este de a activa pc-9, astfel încât acesta să poată executa apoptoza. În timp ce studiile structurale au oferit informații despre recrutarea și cerințele pentru activarea pc-9, o serie de teste biochimice au demonstrat acum că atât dimerizarea indusă de proximitate, cât și reglarea alosterică a pc-9 monomerice sunt esențiale pentru a regla funcția apoptosomei și pot, de asemenea, să guverneze durata activității apoptosomei. În primul rând, recrutarea pc-9 de către apoptosom crește concentrația sa locală pentru a permite homodimerizarea, ceea ce îi crește afinitatea pentru complex. Interesant este faptul că o pc-9 care nu poate fi dezintegrată are o propensiune mai mare pentru homodimerizare și prezintă o activitate proteazică mai mare (scindarea caspazei-3) în cadrul apoptosomei, decât caspaza-9 dezintegrată . În consecință, scindarea legăturii dintre subunitățile p20/p10 ale domeniului catalitic reduce afinitatea pc-9 pentru apoptosom și, odată procesată, caspaza-9 este eliberată și nu se leagă din nou de apoptosom. Este important faptul că aceste studii au demonstrat că homodimerizarea pc-9 este evenimentul cheie necesar pentru activare și că apoptosomul acționează pentru a facilita acest eveniment. Acest lucru este în concordanță cu studiile biochimice ale altor caspaze CARD, cum ar fi caspaza-2 și Dronc, unde activarea inițială necesită dimerizare, mai degrabă decât scindarea zimogenului . Stabilizarea legăturii pc-9 la apoptosom nu necesită doar interacțiuni CARD-CARD, ci și interacțiuni ale subunității mici pc-9 (p10) prin intermediul motivului său GCFNF404 pentru a forma homo- și heterodimeri . Ceea ce nu este clar în acest moment, este modul în care formarea homodimerului pc-9 afectează stabilitatea discului CARD-CARD, deoarece dimerii domeniului catalitic par a fi destul de flexibili, deoarece pot fi eliberați din holo-apoptosom prin trombinoliză dirijată de site și nu sunt rezolvați în hărțile crio-EM rafinate fără simetrie . Motivul GCFNF din pc-9 interacționează, de asemenea, cu un NOD Apaf-1 pentru a forma heterodimeri pc-9/Apaf-1 care clivează eficient caspaza-3 . Aceste date sugerează că un domeniu catalitic pc-9, care interacționează direct cu apoptosomul, poate fi activ. Acest situs activ putativ pentru clivarea caspazei-3 poate corespunde densității noi observate pe butucul central care a fost interpretată ca o moleculă p20/p10 și sunt necesare studii suplimentare în acest sens. Luate împreună, aceste constatări indică faptul că pc-9 poate avea două conformații active diferite în cadrul apoptosomei, cu unul sau posibil doi homodimeri legați de discul CARD și un heterodimer pc-9/Apaf-1 legat de hub-ul central. În cazul în care se iau în considerare holo-apoptosomele cu un modul CARD cu trei module CARD legate de butucul central, atunci sunt posibile cel puțin șase permutări pentru dispunerea a trei până la cinci domenii catalitice pc-9 (Fig. 5). Astfel, numărul de domenii catalitice pc-9 active posibile (ca homodimeri și heterodimeri) va varia în funcție de numărul de molecule pc-9 recrutate în apoptosom, pe măsură ce acestea ocupă posibilele situsuri de legare mediate de CARD-urile Apaf-1.

În cele din urmă, scindarea completă a pc-9 de către caspaza-3 elimină liantul inter-subunități și restabilește activitatea completă a caspazei-9, ceea ce indică faptul că caspaza-3 are, de asemenea, un feedback proteolitic asupra pc-9 care poate amplifica semnalul apoptotic . Un mecanism similar a fost propus pentru caspaza-2 . Aceste studii biochimice au prezentat, de asemenea, un model de cronometru molecular în care rata de disociere a caspazei-9 din apoptosom este determinată de o scindare inițială a liantului p20-p10 care reduce afinitatea de legare la apoptosom . Cu toate acestea, disocierea completă a caspazei-9 scindate din holo-apoptosom ar necesita eliberarea CARD-ului său din discul sau din modulul cu trei CARD-uri. Astfel, este posibil să existe o ierarhie pentru eliberarea moleculelor caspazei-9 active care depinde de mediul local al CARD-urilor lor. Designul discului CARD, cu toate CARD-urile pc-9 situate pe suprafața superioară, poate facilita, de asemenea, eliberarea caspazei-9.

.