O bandă de curgere laterală pe bază de nanoparticule de aur pentru detectarea 6-monoacetilmorfinei în fluidul oral

Introducere

Abusul de opioide a crescut dramatic în ultimii ani și este o cauză majoră de morbiditate și mortalitate. Potrivit Raportului mondial privind drogurile 2017 publicat de Oficiul Națiunilor Unite pentru Droguri și Criminalitate, consumul de opiacee și opiacee eliberate pe bază de prescripție medicală poate că nu este la fel de răspândit ca și canabisul, dar opiaceele rămân droguri importante cu potențiale efecte nocive și consecințe asupra sănătății . Prin urmare, detectarea facilă și rapidă a opioidelor este o necesitate urgentă.

Abuzul ilicit de heroină este una dintre cele mai frecvente forme de dependență de opioide. Heroina (diacetilmorfină, diamorfină sau Diagesil®) este un derivat semisintetic al morfinei și un analgezic opioid puternic . Metabolismul heroinei este vizualizat în figura 1 . Heroina se hidrolizează rapid în 6-monoacetilmorfină (6-MAM) și, în final, în morfină. Deoarece heroina se hidrolizează rapid după administrare, metaboliții săi sunt de obicei utilizați pentru a confirma consumul. Mai mult decât atât, 6-MAM este singurul indicator specific al abuzului recent de heroină față de morfină și a stârnit un mare interes din partea comunității de cercetare.

Au fost descrise mai multe metode de detectare a 6-MAM, iar acestea pot fi împărțite în următoarele categorii: (1) analiza cromatografică, inclusiv cromatografia în fază gazoasă și cromatografia lichidă de înaltă performanță ; (2) analiza spectroscopică, cum ar fi spectroscopia Ramen, spectroscopia în infraroșu, chemiluminescența , etc.; (3) electroforeza capilară ; și (4) metodele de imunodozare (antigen-anticorp) . Tehnicile complexe de instrumentație pun o presiune enormă asupra screeningului de bază al medicamentelor, din cauza necesității de a avea echipamente sofisticate și operatori profesioniști. Laboratorul este uneori închis sau îndepărtat. Nici măcar secțiile de poliție nu pot găzdui acest echipament complex și costisitor. Cu toate acestea, un ofițer de poliție trebuie să judece imediat dacă un material suspectat conține sau nu heroină și trebuie să reacționeze rapid. Astfel, este nevoie urgentă de dezvoltarea unor metode specifice, fiabile și simple de detectare a drogurilor ilicite în probele biologice .

Dintre metodele de detectare rapidă, benzile de curgere laterală (LFS) bazate pe nanoparticule coloidale de aur (AuNP) au fost adoptate pe scară largă pentru depistarea rapidă datorită proprietății optice a AuNP-urilor care depind de dimensiune și de distanță, primul raport fiind realizat de Mirkin și colaboratorii . Principiul testelor semicantitative în flux lateral constă în faptul că culoarea roșie a AuNPs poate fi observată cu ochiul liber din combinația antigen-anticorp în câteva minute . Sunt disponibile în comerț diverse truse de testare pentru detectarea abuzului de heroină, inclusiv cele ale companiilor NovaBios și Wondfo. Cu toate acestea, majoritatea truselor de depistare a heroinei măsoară doar morfina, dar nu și 6-MAM, deoarece este dificil să se facă discriminarea între 6-MAM și morfină. Morfina ar putea fi metabolizată din alte droguri sau ar fi putut fi prescrisă. 6-MAM este trasabil în mod unic la heroină.

Eșantioanele includ sânge, plasmă, urină, păr, fluide orale, precum și în respirație, transpirație, lapte matern, dinți, etc. . Cele mai frecvente probe utilizate pentru testarea heroinei ilicite sunt sângele, urina și fluidele orale. Dintre acestea, testul de sânge este cel mai precis și mai fiabil, dar este și invaziv. Testul de urină este cel mai convenabil și cel mai utilizat pe scară largă în depistarea drogurilor de abuz. Fluidele orale sunt din ce în ce mai mult utilizate pentru testarea la punctul de îngrijire – acestea sunt ușor de colectat în public. Cu toate acestea, fluidele orale sunt foarte vâscoase și au concentrații scăzute de țintă; prin urmare, majoritatea testelor folosesc urina pentru testarea 6-MAM. Toate testele de testare a fluidelor orale se vor confrunta cu aceeași problemă de colectare a probelor și de îmbunătățire a sensibilității. Un studiu anterior a arătat că 6-MAM este frecvent detectat în fluidul oral. Standardul de detectare a LFS în 6-MAM din fluidul oral este de 4 ng ml-1 . Aici, am dezvoltat un test de flux lateral pentru heroină în probele de fluid oral.

Am explorat AuNPs ca etichete de anticorpi într-un test de flux lateral pentru detectarea rapidă și sensibilă a 6-MAM prin intermediul unui semnal colorimetric. În primul rând, am sintetizat 6-MAM și apoi l-am conjugat cu albumina serică bovină (BSA) pentru a-i permite să fie acoperit pe o linie T. Mai mult decât atât, pentru a depăși dificultățile de tratare a probelor de fluide orale, au fost alese tipurile de membrane de nitroceluloză (NC), formula de soluție a plăcuței de probă și a plăcuței de burete adsorbant pentru a căuta cele mai bune condiții pentru LFS pentru fluide orale. În cele din urmă, LFS 6-MAM a fost validat și s-a demonstrat că are o sensibilitate și o specificitate remarcabile.

Experimental

2.1. Materiale

Anticorpii împotriva 6-MAM au fost furnizați de Bioventure (Shanghai). BSA și polivinil pirrolidona (PVP) au fost achiziționate de la Sigma (Barcelona, Spania). Triton X-100, Tetronic 1307 (S9), Ohodasurf On-870 (S17) și STANDAPOL ES-1 (S7) au fost achiziționate de la BASF (Germania). Apa distilată (rezistivitate 18,2 MΩ cm-1) a fost preparată cu un sistem de apă ultrapură RephiLe PURIST UV (China). Sistemul de dispersie Reel a fost de la Doyesgo (China). Spectrometrul de masă Vion IMS Q-Tof a fost de la Waters (SUA). Toate materialele standard, cum ar fi 6-MAM și morfina, au fost obținute de la National Institutes for Food and Drug Control (China). Microscopul a fost de la Motic AE2000 (Xiamen, China). Toți ceilalți reactivi chimici și imunologici nespecificați aici au fost produse comerciale standard de grad analitic/reactiv.

2.2. Componentele benzii de curgere laterală

Benzile LFS sunt alcătuite dintr-un suport de plastic, o bandă de burete adsorbant (tampon de burete), un tampon de probă, un tampon conjugat, membrane NC și un tampon absorbant. Banda de burete adsorbant este special concepută pentru colectarea lichidului oral și transportă rapid lichidul oral în tamponul de probă. Tamponul pentru probe conține un sistem tampon și unii agenți tensioactivi. Conjugatele anticorp-AuNP au fost pulverizate pe tamponul de conjugare pentru a reacționa cu proba și pentru a fi eliberate de pe tampon și a intra în membrana NC acoperită cu 6-MAM-BSA pe linia T și cu anticorpi de capră anti-rabbit pe linia C. Tamponul absorbant este o hârtie de filtru situată la capătul benzii; acesta menține fluxul capilar. LFS trebuie doar să fie plasată în gură sau introdusă într-o cupă de prelevare a probelor de lichid oral. O vedere schematică a LFS este prezentată în figura 2. O diagramă schematică a LFS pentru detectarea 6-MAM este prezentată în figura 3.

2.3. Sinteza conjugatului 6-monoacetilmorfină-albumină serică bovină

6-MAM a fost preparat așa cum a fost descris anterior în lucrările de cercetare . Pe scurt, morfina a fost mai întâi produsă prin hidroliza alcalină a heroinei. O grupare ester de N-hidroxizuccinimidă (NHS) a fost apoi adăugată la molecula de 6-MAM pentru a o conjuga cu proteinele purtătoare (figura 4). 6-MAM activată a fost asigurată de un spectrometru de masă Waters® Vion IMS Q-Tof. În continuare, sinteza a fost realizată așa cum a fost descrisă (figura 5), cu unele modificări. În primul rând, 80 mg de BSA în 6 ml de tampon fosfat de potasiu 50 mM (pH = 7,5) au fost lăsați să se răcească la 0°C. Apoi, 20 mg de 6-MAM activat în 1 ml de dimetilformamidă (DMF) anhidră au fost adăugați picătură cu picătură la 0°C. Amestecul a fost încălzit la temperatura camerei și agitat peste noapte. Conjugatul 6-MAM-BSA rezultat a fost dializat cu un tampon de fosfat de potasiu 50 mM (pH = 7,5) cu șase schimbări de tampon (cel puțin 6 h fiecare la 4°C).

2.4. Prepararea conjugatelor nanoparticule de aur-anticorpi

Nanoparticulele de aur de 20 nm au fost preparate printr-o metodă de reducere cu citrat . Aici, în 100 ml de apă clocotită s-au adăugat 2 ml de soluție de 1% HAuCl4 în 100 ml de apă clocotită cu agitare viguroasă, iar apoi s-au adăugat imediat 2 ml de soluție de citrat de sodiu 1%. Când soluția a căpătat culoarea roșie, s-a fiert timp de încă 15 min. Soluția a fost răcită la temperatura camerei și depozitată la 4°C pentru utilizare ulterioară.

După ajustarea valorii pH-ului soluției de AuNPs la 9,0 cu 0,1 M K2CO3, 30 µg de anticorpi 6-MAM au fost adăugați în 10 ml de soluție de AuNPs și incubați timp de 30 min. Aceasta a fost urmată de 20 µl de 100,0 g l-1 BSA timp de 15 min pentru a bloca situsurile reactive. Soluția a fost centrifugată la 3740 g timp de 15 minute, iar supernatantul a fost centrifugat din nou la 12 100 g timp de încă 30 de minute. Toate precipitatele de aur au fost amestecate și măsurate pentru a identifica absorbția maximă prin spectroscopie UV-visible. A fost apoi depozitat la 4°C pentru utilizare ulterioară.

Aceeași metodă a fost folosită pentru a conjuga AuNPs cu anticorpi IgG de iepure. La realizarea tamponului conjugat, anticorpii conjugați au fost diluați până la absorbția cinci cu tampon (0,05 M Tris-HCl conținând 10,0 g l-1 BSA, 0,4% Triton X-100, 5% trehaloză, 10% zaharoză, pH 8,2). În cele din urmă, 500 µl de conjugate AuNPs-anticorp amestecate au fost pulverizate pe o fibră de sticlă de 20 mm2 și apoi uscate la 37°C peste noapte.

2.5. Pregătirea membranelor de nitroceluloză acoperite

Pentru a realiza banda de testare în flux lateral, antigenele 6-MAM-BSA (0,6 mg ml-1) au fost distribuite pe membranele NC ca linii de testare (linia T). Liniile de control (linia C) au fost acoperite cu anticorpi policlonali de capră anti-rabie de iepure (0,15 mg ml-1). Membranele NC acoperite au fost uscate la 37°C peste noapte. Au fost evaluate nouă membrane NC comerciale de la patru companii: Millipore (HF90, HF135 și HF180), GE-Whatman (FF120HP și AE100), Sartorius (CN95 și CN150) și Pall (Vivid90 și Vivid170).

2.6. Sensibilitate și specificitate

Banda este un test competitiv, iar ambele poziții au avut benzi de 6-MAM. Atunci când proba conține 6-MAM, aceasta se leagă de anticorpul marcat cu nanogold de pe tamponul conjugat. Excesul de anticorpi continuă să avanseze de-a lungul direcției cromatografice datorită acțiunii capilare și apoi se leagă de antigenul 6-MAM de pe linia T. Intensitatea semnalului de pe linia T este direct legată de concentrația de 6-MAM din probă. O culoare mai închisă indică o concentrație mai mică de 6-MAM.

Lividul oral negativ a fost colectat de la șase persoane și îmbogățit cu 6-MAM (400, 100, 40, 10, 4, 1, 0,4, 0,1 ng ml-1) pentru detectarea sensibilității. Zece medicamente de care se abuzează în mod obișnuit au fost utilizate pentru a verifica specificitatea LFS-urilor. Aceste medicamente au fost morfină (MOP, 100 µg ml-1), codeină (COD, 100 µg ml-1), tetrahidrocanabinol (THC, 10 µg ml-1), metilen dioximetilmetamfetamină (MDMA, 100 µg ml-1), ketamină (KET, 100 µg ml-1), metilamfetamină (MET, 100 µg ml-1), cocaină (COC, 100 µg ml-1), metadonă (MTD, 100 µg ml-1), efedrină (EPH, 100 µg ml-1) și pseudoefedrină (PEPH, 100 µg ml-1).

Rezultate și discuții

3.1. Sinteza conjugatului 6-monoacetilmorfină-albumină serică bovină

Membranele NC sunt de obicei acoperite mai întâi cu o proteină purtătoare înainte de conjugarea anticorpului. Linkerii sunt utilizați pentru a menține specificitatea structurală. Aici, o grupare ester NHS a fost adăugată mai întâi la molecula de 6-MAM ca liant pentru proteina purtătoare. Acest lucru a fost validat cu un spectrometru de masă Waters® Vion IMS Q-Tof. Am descoperit un vârf larg în cromatografia lichidă ultraperformantă (UPLC) în cromatogramele de 6-MAM activat la 8,8 min cu un m/z de 706,27645 (figura 6) față de un m/z prezis de 706,2758. Acest lucru indică faptul că liantul a fost atașat cu succes la 6-MAM. Semnificația sintezei precise este evidentă, deoarece numai structura este stabilită corect, iar acest lucru ar putea duce la împerecherea cu anticorpi 6-MAM.

Nu am folosit dializa cu gradient de dimetilsulfoxid pentru că produsul este solubil și protocolul de conjugare anterior este prea complex. BSA a avut mai multe vârfuri în cromatograma UPLC (datele nu sunt prezentate) din cauza diferiților analogi. Acest lucru a dus la o gamă de rapoarte de conjugare. Prin urmare, au existat diverse vârfuri în cromatograma UPLC care corespundeau diferitelor rapoarte de conjugare. Rezultatele conjugării au putut fi confirmate mai eficient prin împerecherea antigen-anticorp decât prin raportul de conjugare.

3.2. Tipuri de selecție a membranelor de nitroceluloză

Membranele de nitroceluloză se leagă electrostatic de proteine prin interacțiuni ale dipolului puternic al esterului nitrat cu dipolul puternic al legăturilor peptidice ale proteinei. Au fost evaluate proprietățile, inclusiv debitul capilar, intensitatea semnalului și fondul, deoarece acestea ar putea influența performanța finală a LFS. În plus, se acordă mai multă atenție debitului, deoarece acesta ar putea afecta capacitatea de adsorbție a proteinei și chiar sensibilitatea. Viteza de curgere a unei membrane depinde de proprietățile agregate ale structurilor poroase, cum ar fi dimensiunea porilor, distribuția dimensiunilor porilor și porozitatea. O dimensiune mai mare a porilor duce la o adsorbție mai slabă a proteinelor.

Am comparat nouă membrane NC (tabelul 1). Fiecare test a fost repetat de trei ori, iar rezultatul mediu a fost înregistrat. Rezultatele LFS au fost măsurate în 3 min, iar cel mai bun debit de probă a fost sub 20 s cm-1. Intensitatea semnalului la linia T a fost, de asemenea, necesară la nivel normal. O culoare de fond mai intensă a împiedicat precizia. Membrana Millipore HF135 a fost cea mai bună alegere pentru 6-MAM după o analiză cuprinzătoare a debitului probei, a intensității semnalului la linia T și a culorii de fond.

3.3. Tamponul de probă

Soluția pentru tratarea tamponului de probă este foarte importantă pentru test, deoarece a servit ca sistem tampon de reacție atunci când probele de lichid oral rehidratează tamponul. Soluția include, de obicei, un sistem tampon cu o forță ionică și o valoare a pH-ului adecvate; unele materiale de blocare și agenți tensioactivi pot accelera viteza de curgere a fluidului oral pe membrană. Tamponul pentru probe se ocupă de complexitatea efectelor matricei fluidului oral și îl face compatibil cu membrana NC. Mai mult, sistemul tampon asigură eliberarea analiților și stabilizează viteza de curgere, deoarece fluidul oral este prea vâscos.

Au fost luate în considerare patru formule diferite. Formulele soluțiilor sunt prezentate în tabelul 2. Rezultatele au indicat că sistemul tampon 4 cu tensioactivul STANDAPOL ES-1 (S7) a oferit cea mai bună performanță la un debit al probei de 17 s cm-1, cu o intensitate normală a semnalului și un fond alb. Surfactantul S7 este un surfactant anionic puternic care oferă o capacitate de spălare mai puternică decât S17 și S9.

3.4. Colectarea lichidelor orale

Lichidele orale sunt mai dificil de colectat decât urina din cauza vâscozității lor ridicate. Există mai multe tipuri de dispozitive de colectare a fluidelor orale: tampoane de bumbac, bureți, tuburi de plastic și cupe. Unele metode stimulează fluidele orale prin intermediul oțetului, al apelor de gură, al pastiluțelor etc. Cu toate acestea, o astfel de stimulare poate modifica concentrația analiților din fluidul bucal și este mai complicată și mai consumatoare de timp. În cele din urmă, am colectat fluidul oral direct din gură cu ajutorul unui burete adsorbant (ESSENTRA, Regatul Unit), care este un amestec de fibre polimerice cu o dimensiune adecvată a porilor.

Două tipuri de burete adsorbant (K1 și K2) au fost proiectate la comandă, iar structurile ambelor tampoane de burete sunt prezentate în figura 7. K2 a fost mult mai lejer și mai regulat în raport cu K1. Ambele au fost evaluate prin testarea performanțelor de manipulare a fluidelor, inclusiv prin picurarea apei pe tamponul de burete, introducerea LFS final în tamponul negativ de fosfat de potasiu (pH = 7,0) și introducerea LFS final în gură. Buretele K2 a avut o rată de curgere a probelor de două ori mai rapidă (în medie 20 s cm-1) decât buretele K1 pentru apă, tamponul PBS sau fluidele orale reale. Acesta este un aspect foarte important pentru testarea fluidelor orale. În concluzie, K2 a fost ales pentru performanțele sale deosebite în tratarea probelor de fluide orale.

3.5. Sensibilitate și specificitate

Moleculele mici sunt de obicei detectate prin intermediul unui test competitiv în LFS. Aici, nu există niciun semnal (linia roșie) în linia T. Acest lucru a reprezentat o concentrație de 6-MAM în eșantion care se află peste valoarea limită. Sensibilitatea pentru testarea lichidului oral ar trebui să fie mult mai mare decât cea a testului de urină, din cauza concentrației scăzute de metaboliți ai drogurilor în lichidul oral. Aici, am realizat cu succes un LFS calitativ pentru 6-MAM cu o sensibilitate de 4 ng ml-1, care îndeplinește cerințele pentru limitele generale de detecție a fluidelor orale . Rezultatele sunt prezentate în figura 8. În plus, figura 9 arată specificitatea față de medicamentele de care se abuzează în mod obișnuit. LFS pentru 6-MAM a fost specific pentru 6-MAM, fără reacții încrucișate în special cu morfină sau codeină.

Concluzie

6-MAM este metabolitul specific al heroinei. Raportăm aici un LFA pentru 6-MAM prin intermediul unui conjugat special asociat cu un anticorp specific. Am realizat un conjugat care a legat 6-MAM de proteina purtătoare prin intermediul unei grupări ester NHS în poziția C3 (figura 10). Aici, anticorpul a identificat grupul acetil al 6-MAM. Aceasta este o condiție prealabilă pentru specificitatea pentru 6-MAM. În cele din urmă, am realizat un test LFS foarte sensibil, fără reacții încrucișate cu 10 medicamente de care se abuzează frecvent, inclusiv morfină și codeină. Am identificat membranele NC adecvate, tamponul de probă, dimensiunea porilor și buretele adsorbant pentru a realiza un test care utilizează fluidele orale la punctul de îngrijire.

Cu avantajele de mai sus, LFS 6-MAM pentru proba de fluid oral ar putea fi aplicat atât pentru cercetare, cât și pentru utilizări în industrie. Acesta ar putea ajuta poliția să economisească forță de muncă și timp/costuri în depistarea preliminară. Fluidele orale sunt convenabile și mai puțin invazive și sunt potrivite pentru depistarea în trafic. În concluzie, un LFS de fluid oral pentru abuzul de heroină care vizează 6-MAM este un produs promițător pentru combaterea conducerii sub influența drogurilor.

Etică

Utilizarea probelor de heroină pentru cercetare a fost supravegheată de cel de-al treilea Institut de Cercetare al Ministerului chinez al Securității Publice. Toți autorii declară că sunt în conformitate cu standardele etice.

Accesibilitatea datelor

Datele sunt depuse în Dryad Digital Repository: https://doi.org/10.5061/dryad.8r36rp3 .

Contribuțiile autorilor

L.Z. a conceput acest studiu, iar X.H și J.Z. au ajutat la realizarea experimentelor din figurile 4 și 5. F.C. și Y.Z. au efectuat studiile din figura 6. J.L. a analizat datele și a redactat lucrarea. Toți autorii și-au dat aprobarea finală pentru publicare.

Interesele concurente

Declarăm că nu avem interese concurente.

Finanțare

Nici o finanțare nu a fost primită pentru acest articol.

Disclaimer

Toate opiniile, constatările și concluziile sau recomandările exprimate aici sunt ale autorilor.

Notele de subsol

Acest articol a fost editat de Royal Society of Chemistry, inclusiv comandarea, procesul de evaluare inter pares și aspectele editoriale până la punctul de acceptare.

.