O structură complexă a arrestinei-2 legată de un receptor cuplat cu proteina G

Caracterizarea funcțională și determinarea structurii complexului Arr2-NTSR1

Interacțiunile arrestinelor cu GPCR nevăzute sunt relativ slabe și foarte dinamice, dar obținerea unui complex stabil este un pas esențial pentru studiile structurale. Prin urmare, înainte de studiile noastre structurale, am caracterizat interacțiunea NTSR1 cu arrestinele utilizând sistemul comercial NanoBiT, care este o metodă eficientă de detectare a interacțiunilor proteină-proteină.17 S-a constatat că NTSR1 interacționează atât cu Arr2, cât și cu Arr3, interacțiune care este potențată de concentrațiile crescute de agonist peptidic, neurotensină (NTS). Mutanții Arrestin cu trei reziduuri hidrofobe C-terminale mutate în alanină (mutanți 3 A; I386A, V387A și F388A în Arr2 și I387A, V388A și F389A în Arr3),18,19 care sunt cunoscuți ca formă preactivată a arrestinelor, au prezentat o activitate de legare crescută la NTSR1 (Fig. 1b).

Am testat în continuare interacțiunea arrestină-NTSR1 prin testul Tango, un test celular care determină activitățile de legare a proteinelor membranare la partenerii de legare solubili.7,20 Testele noastre Tango au arătat că activitatea de legare a NTSR1 la Arr2 a fost crescută de aproximativ două până la trei ori, respectiv, atunci când a fost adăugat agonistul peptidic NTS sau agonistul cu moleculă mică ML314, un cunoscut modulator pozitiv-alosteric (PAM),21,22 . Activitatea de legare a Arr2 la NTSR1 a fost crescută de aproximativ patru ori atunci când au fost utilizate atât NTS, cât și ML314. Legătura dintre NTSR1 și Arr2 a fost îmbunătățită și mai mult prin introducerea mutațiilor 3A (Fig. 1c).

Pe baza rezultatelor de mai sus, am efectuat studii structurale utilizând mutantul 3A al lui Arr2 în complex cu NTSR1 în prezența NTS și ML314, dar complexul s-a disociat în grilele crio-EM din cauza efectelor adverse asociate cu vitrificarea probelor. Pentru a depăși această problemă de disociere, am fuzionat NTSR1 uman de tip sălbatic cu mutantul uman 3A Arr2 la extremitatea sa C-terminală cu un liant de trei aminoacizi (GSA). Domeniul RIL al citocromului b562 (BRIL) a fost, de asemenea, fuzionat la extremitatea N-terminală a receptorului pentru a crește expresia complexului. Arr2 a fost stabilizat în continuare prin fuzionarea lanțului ușor Fab30, un fragment de anticorp utilizat pentru a stabiliza forma activă a Arr2,23 la extremitatea sa C-terminală cu un liant de 12 aminoacizi (GSAGSAGSAGSA). Construcția complexului de fuziune a fost co-exprimată cu lanțul greu Fab30 marcat His8 și cu o kinază GPCR, GRK5, care a fosforilat receptorul pentru o mai bună legare a arrestinei. Proteina complexă a fost purificată folosind o coloană de afinitate cu nichel în prezența a 2 µM NTS și 10 µM ML314, apoi concentrată și purificată în continuare prin cromatografie de filtrare pe gel pentru studii structurale (Fig. 1d, e, a se vedea secțiunea „Materiale și metode” pentru detalii).

Proteina complexă BRIL-NTSR1-Arr2-Fab30 purificată a prezentat o temperatură de topire (Tm) relativ ridicată la 58 °C determinată prin testul de deplasare a termostabilității24 (Fig. 1f). Aceasta a prezentat o distribuție uniformă atunci când a fost inspectată prin colorație negativă EM (Fig. 1g). Datele crio-EM ale particulelor unice au fost colectate cu un microscop FEI Titan Krios. A fost înregistrat un număr total de 17 206 micrografii, iar peste 5 milioane de particule complexe au fost selectate și sortate pentru prelucrarea ulterioară a datelor. Clasificarea 2D a identificat multiple conformații ale particulelor complexe. După o clasificare 3D intensivă, 220.464 de particule (~4,5% din totalul particulelor inițiale) au fost selectate pentru reconstrucția structurii (Informații suplimentare, Fig. S1). Harta de densitate a arătat o rezoluție medie de 4,8 Å determinată de criteriul de corelație a cochiliei Fourier shell (FSC) de 0,143, structura centrală compusă din Arr2 și regiunea variabilă Fab (Fv) prezentând un interval de rezoluție de până la 4,5 Å (Fig. 2a și Informații suplimentare, Fig. S1, S2). Cu toate acestea, eterogenitatea conformațională dintre NTSR1 și Arr2 este încă prezentă, așa cum este ilustrat în analiza multicorp (Informații suplimentare, Fig. S3), chiar dacă în reconstrucția finală a fost utilizată o fracțiune foarte mică din întregul set de date.

În ciuda rezoluției moderate, harta EM a permis determinarea clară a poziției și orientării NTSR1, Arr2 și Fab30 în ansamblul complexului (Fig. 2). Modelul complexului a fost construit prin andocarea structurii cristaline a complexului NTSR1-NTS (PDB: 4GRV),14 și a structurii lui Arr2 legat cu peptida C-terminală fosforilată a vasopresinei (V2Rpp) și Fab30 (PDB: 4JQI)23 în harta de densitate, urmată de ajustarea manuală a modelului, de rafinarea în spațiu real și de cicluri iterative de rafinare Rosetta și de reconstrucție a modelului față de harta EM.25 Modelul final al complexului conține reziduurile NTSR1 de la R49 la T416, din care lipsesc ICL3 (de la A270 la P292) și regiunea de legătură dintre helixul 8 și coada C-terminală (de la P384 la S404). Modelul lui Arr2 include reziduurile T6 până la M352, iar modelul lui Fab30 conține un total de 409 reziduuri care cuprind atât lanțul ușor, cât și lanțul greu al Fab. BRIL fuzionat N-terminal și molecula mică ML314 nu sunt vizibile pe harta de densitate și, prin urmare, nu sunt incluse în modelul complexului. Statisticile și geometria modelului structural sunt rezumate în informațiile suplimentare, tabelul S1.

Structura generală a complexului Arr2-NTSR1

Complexul Arr2-NTSR1 este format prin asamblarea asimetrică a celor două componente, cu axa orizontală a lui Arr2 care intersectează suprafața interioară a membranei celulare la aproximativ 20°, rezultând interacțiunea buclelor hidrofobe de margine C (L191 și M192, și L334 până la L338) ale arestinei cu membrana celulară (Fig. 2a, b). Acest lucru este în concordanță cu structura cristalină a complexului vizual arrestin-rhodopsină, care a prezentat pentru prima dată ansamblul asimetric arrestin-GPCR și a confirmat funcția buclelor hidrofobe de margine C ale arrestinei ca ancoră de membrană care stabilizează legarea arrestinei la receptorul încorporat în membrană, care a fost confirmată ulterior pe cale experimentală.7,26,27 Interacțiunea buclelor hidrofobe de margine C ale Arr2 cu stratul de membrană celulară sugerează că capacitatea de legare a lipidelor este o proprietate generală a membrilor familiei de arrestine.

În ciuda similitudinii în asamblarea asimetrică a complexului Arr2-NTSR1 cu cea a complexului Arr1-rhodopsină, orientarea relativă a arrestinei față de receptor este dramatic diferită între acești doi complecși arrestină-receptor. Suprapunerea TMD-urilor receptorilor acestor două complexe arată că orientarea Arr2 este rotită cu 90° în jurul axei transmembranare față de cea a arrestinei vizuale (Fig. 2c). În această nouă orientare, pozițiile lui ICL3 și atât TM5 cât și TM6 ale receptorului sunt îndreptate spre domeniul N-terminal al lui Arr2, ceea ce face posibil ca ICL3 să semene cu coada C-terminală pentru a interacționa cu domeniul N al lui Arr2 (Fig. 2b).

Pentru a evalua stabilitatea conformațională a ansamblului complexului, am efectuat șase simulări dinamice moleculare independente, cu o durată de două microsecunde, cu toți atomii, ale complexului Arr2-NTSR1 fără stabilizatorul Fab30. Pe tot parcursul simulării, bucla C-edge L334 până la L338 a rămas în asociere cu lipidele membranare, iar coada C-terminală a NTSR1 a rămas în interacțiune cu domeniul N-terminal al Arr2 (informații suplimentare, figurile S4 și S5). Cu toate acestea, structura nucleului arrestinei se poate roti în jurul structurii crio-EM într-o măsură limitată, iar bucla extinsă a degetului se poate desprinde de nucleul TMD al NTSR1 (informații suplimentare, Fig. S5). Aceste date de simulare sugerează că bucla degetului, precum și interfața nucleului dintre Arr2 și receptor este foarte dinamică, iar ansamblul complexului Arr2-NTSR1 capturat de structura crio-EM reprezintă probabil una dintre numeroasele stări conformaționale, ceea ce este în concordanță cu faptul că eterogenitatea conformațională a ansamblului complexului Arr2-NTSR1 încă există în particulele din clasa 3D utilizate în reconstrucția crio-EM finală (Informații suplimentare, Fig. S3).

Interfața de bază Arr2-NTSR1

Complexul Arr2-NTSR1 este asamblat prin interacțiuni intermoleculare care constau în două interfețe majore separate: o interfață de bază formată din două patch-uri separate între buclele de creastă centrale ale arrestinei și partea intracelulară a TMD a receptorului și o interfață de coadă între domeniul N-terminal al lui Arr2 și coada C-terminală a receptorului (Fig. 2b). Un plasture al interfeței centrale dintre Arr2 și NTSR1 este reprezentat de bucla de deget (de la E66 până la L71) a arrestinei, care este inserată în cavitatea intracelulară a TMD a receptorului și înconjurată de ICL1, ICL2, TM5 și 6, ale receptorului (Fig. 3a). În această configurație, suprafața superioară a buclei degetului formează o interfață directă cu întoarcerea dintre TM7 și elicea 8 a receptorului (Fig. 3a).

Pentru a valida interfața structurii complexe, am efectuat experimente de reticulare a disulfurilor pe bază de celule. În acest set de experimente, au fost introduse reziduuri de cisteină specifice locului la interfața dintre Arr2 și NTSR1. Ambele proteine cu mutații de cisteină au fost co-exprimate în celule ca proteine separate. Produsele de reticulare s-au format prin tratarea celulelor cu un reactiv oxidant și au fost monitorizate prin SDS-PAGE urmat de Western blotting pentru a detecta marcajul Flag care a fost fuzionat la extremitatea C-terminală a Arr2. Aceeași metodă a fost utilizată pentru a valida interfața vizuală a complexului arrestin-rhodopsină.7,9 Au fost efectuate reacții de reticulare a unui total de 177 de perechi de reziduuri, printre care am observat semnale puternice de reticulare între reziduurile D67 și L68 din Arr2 în regiunea centrală a buclei degetului, cu reziduurile V367 până la N370 din NTSR1 situate la întoarcerea dintre TM7 și helixul 8 (Fig. 3b, iar pozițiile acestor reziduuri de interfață sunt prezentate ca sfere în Fig. 3a). Ca o comparație, reziduul L71 de la capătul C-terminal al buclei degetelor nu a prezentat niciun semnal de reticulare sau a prezentat un semnal foarte slab de reticulare cu aceste reziduuri NTSR1 (Fig. 3a, b). S-a constatat, de asemenea, că mai multe reziduuri din bucla degetului se încrucișează cu reziduuri de la ICL1 (Q98) și TM6 (R294 și A297), care sunt componente ale cavității intracelulare a TMD a receptorului (informații suplimentare, Fig. S6). Aceste date de reticulare au validat pata de interfață dintre bucla degetului Arr2 și receptor și au arătat că bucla degetului de arestină servește ca o componentă cheie a interfeței de bază a acestui complex Arr2-GPCR.

Secvențele de aminoacizi ale buclei degetului Arr2 sunt îmbogățite cu reziduuri acide, asemănătoare cu cea a arrestinei vizuale (Fig. 3c), despre care se știe că se leagă de cavitatea TMD încărcată pozitiv.7 Atunci când NTSR1 și rodopsina sunt suprapuse, bucla degetului din Arr2 ocupă același spațiu ca și regiunea corespunzătoare a arestinei vizuale, dar nu se inserează la fel de adânc în cavitatea TMD ca și arestina vizuală (Fig. 3d), ceea ce indică faptul că asocierea buclei degetului Arr2 cu cavitatea intracelulară a TMD a NTSR1 ar putea fi mai dinamică decât cea dintre arestina vizuală și rodopsină.

O altă parcelă a interfeței de bază dintre Arr2 și NTSR1 este interacțiunea regiunilor de creastă ale lui Arr2 cu ICL1 și ICL2 ale receptorului, care este diferită de cea din complexul arestină vizuală-rodopsină. Spre deosebire de orientările similare ale buclelor degetelor celor două arrestine, suprapunerea celor doi receptori a lăsat structurile de bază ale arrestinelor în două orientări care diferă cu un unghi de aproximativ 90°, așa cum se arată în Fig. 2c. Orientările diferite ale structurilor de bază ale Arr2 și ale arrestinei vizuale în complexele lor GPCR au ca rezultat moduri diferite de legare a regiunilor de creastă ale arrestinelor cu buclele intracelulare ale receptorilor, în special ICL1 și ICL2, în aceste două complexe arrestină-GPCR (Fig. 2c și 4).

Compararea structurală a NTSR1 și rodopsinei relevă faptul că acestea împărtășesc o conformație conservată a TMD, ICL1 adoptând o buclă extinsă, iar ICL2 formând o elice scurtă în complexele lor respective legate de arestină. Spirala ICL2 a rodopsinei este inserată în fanta formată de bucla centrală, bucla inferioară și bucla lariat a arestinei vizuale (denumită fanta MBL).7 Cu toate acestea, aceeași fantă MBL din Arr2 este ocupată de ICL1 a NTSR1 (Fig. 4a) din cauza orientării diferite a arestinei. În mod corespunzător, ICL2 din NTSR1 este rotit departe de fanta MBL pentru a se repoziționa în partea superioară a buclei lariatului (Fig. 4a). Experimentele de încrucișare a disulfurilor au arătat semnale de încrucișare între reziduurile receptorilor L94 până la S96 pe ICL1 din NTSR1 și reziduul G286 din bucla inferioară a Arr2, ceea ce este în concordanță cu interfața ICL1 din NTSR1 cu această regiune de creastă a Arr2 (Fig. 4b).

ICL3 al receptorului, în ciuda faptului că este invizibil în harta densității, formează probabil o interfață cu domeniul N al β-arrestinei pe baza conformației complexului Arr2-NTSR1 (Fig. 2b). Datele de reticulare disulfidică au arătat că reziduurile ICL3 Q275, C277, T278 și V279 din NTSR1 s-au reticulat cu reziduurile T56, T58, V81 și N83 la suprafața superioară a domeniului N al Arr2 (Fig. 4c și informații suplimentare, Fig. S6). Aceste reziduuri ICL3 au prezentat, de asemenea, semnale puternice de reticulare cu reziduul K160 din Arr2 (Fig. 4d). S-au observat semnale suplimentare de reticulare disulfidică între majoritatea reziduurilor de la Q273 până la G280 din NTSR1 ICL3 și reziduul P14 din Arr2 (Fig. 4d). Aceste date de reticulare indică faptul că ICL3 al receptorului este poziționat aproape de domeniul N și poate interacționa cu reziduurile de la suprafața domeniului N al Arr2 (Fig. 4e).

Interfața cozii Arr2-NTSR1

În timp ce interfața nucleului Arr2-NTSR1 este foarte dinamică, interfața cozii dintre coada C-terminală a NTSR1 și domeniul N al Arr2 pare similară cu cea din complexul arestină vizuală-rodopsină9 (Fig. 5). Am observat densitatea electronică la un nivel de contur de 0,016 (la care densitatea structurii globale a complexului poate fi reprezentată în mod corespunzător) a aproximativ zece reziduuri ale cozii C-terminale a NTSR1 care se leagă la prima catenă β a Arr2 (Fig. 5a). Cu toate acestea, informațiile detaliate despre această regiune a cozii C-terminale, inclusiv reziduurile sale specifice, sunt dificil de identificat din cauza rezoluției limitate a hărții de densitate. Analizele proteinei de fuziune NTSR1-Arr2-Fab30 prin spectrometrie de masă (Fig. 5b și Informații suplimentare, Fig. S7) au arătat că șapte reziduuri de serină sau treonină de la S401 la T416 de pe coada C-terminală a NTSR1 au fost fosforilate, sugerând o posibilă implicare a acestei regiuni în legarea la suprafața încărcată pozitiv a domeniului N al arrestinei. Experimentele de reticulare cu disulfură au arătat că reziduul P14 din Arr2 de la cotitura C-terminală a primei coarde β s-a reticulat puternic cu reziduurile H406 până la S410 ale receptorului (Fig. 5d și informații suplimentare, Fig. S6), ceea ce a indicat că reziduurile C-terminale ale receptorului până la H406 sunt probabil regiunea care se leagă de domeniul N al arrestinei (Fig. 5c).

Un model pentru interacțiunea Arr3-GPCR

Genomul uman conține două subtipuri de β-arrestină: Arr2 și Arr3, care au o identitate de secvență de peste 53%, dar au atât unele funcții care se suprapun, cât și unele funcții divergente. Deoarece Arr3 a prezentat o afinitate de legare la NTSR1 similară cu cea a lui Arr2 (Fig. 1b), am dorit să testăm dacă modul de legare a lui Arr3 la NTSR1 este conservat cu cel al lui Arr2. Experimentele noastre de reticulare disulfidică au arătat că reziduurile E67 până la L72 ale buclei de degete Arr3 (care corespund la E66 până la L71 ale Arr2) s-au reticulat cu setul corespunzător de reziduuri (A369 și N370) la întoarcerea dintre TM7 și helixul 8 al NTSR1 (informații suplimentare, Fig. S8), indicând o interfață conservată a buclei de degete cu TM7 și H8 a receptorului între aceste două β-arrestine.

În plus, datele de reticulare a disulfurilor au arătat că reziduul P15 din Arr3 (corespunzător lui P14 din Arr2) s-a reticulat cu reziduurile N405 până la T407 din coada C-terminală a receptorului, sugerând o interfață de coadă similară între Arr3 și NTSR1 (informații suplimentare, Fig. S8). S-a observat, de asemenea, un model similar de reticulare între reziduurile NTSR1 ICL3 și reziduurile din domeniul N al Arr3, inclusiv P15 la extremitatea C-terminală a primei ramuri β și K161 (corespunzător lui K160 din Arr2) pe bucla dintre ramurile β superioare (informații suplimentare, Fig. S8). Împreună, aceste date de reticulare sugerează că ansamblul general al lui Arr3 cu NTSR1 este similar cu cel al lui Arr2 cu NTSR1 în această configurație cu nucleu angajat.

Un model pentru recrutarea β-arrestinei de către 5-HTR1A și 5-HTR1B

Mulți GPCR, inclusiv receptorii de serotonină 5-HTR1A și 5-HTR1B, precum și mai mulți receptori de dopamină, fie lipsesc, fie conțin o coadă C-terminală foarte scurtă și se propune ca aceștia să utilizeze ICL3 ca interfață alternativă pentru a recruta β-arrestine.28 5-HTR1A și 1B au ICL3 lungi cu multiple situsuri de fosforilare pentru o interacțiune potențială cu dominele N încărcate pozitiv ale β-arrestinelor. Testele noastre biochimice de legare au demonstrat că ambii receptori s-au legat de Arr2 și 3 cu o activitate similară cu cea a NTSR1 cu Arr2 (informații suplimentare, Fig. S9). Cu toate acestea, atunci când structura complexului vizual arrestin-rhodopsină a fost utilizată ca șablon, a fost dificil să se modeleze modul de legare a ICL3 fosforilat al 5-HTR1A sau 1B la fisura încărcată pozitiv de pe domeniul N al β-arrestinelor. Acest lucru se datorează faptului că TM5 și 6, precum și ICL3 al rodopsinei sunt poziționate la locul opus față de suprafața încărcată pozitiv a domeniului N al arestinei în structura complexului arestină vizuală-rodopsină.

Structura complexului Arr2-NTSR1, cu toate acestea, prezintă un ansamblu complex distinct cu Arr2 rotit cu 90° față de poziția arestinei vizuale în complexul arestină-rodopsină (Fig. 2c). TM5 și TM6 din NTSR1 sunt, prin urmare, poziționate deasupra suprafeței frontale a domeniului N al lui Arr2, permițând ICL3 al receptorului (care nu este vizibil în structură) să ajungă la domeniul N încărcat pozitiv al lui Arr2 (Fig. 4e). Datele noastre de reticulare a disulfurilor oferă dovezi că NTSR1 ICL3 poate interacționa cu despicătura încărcată pozitiv a domeniului N al Arr2 și 3 (Fig. 4c-e, Informații suplimentare, Fig. S6 și S8). Prin urmare, structura complexului Arr2-NTSR1 poate servi drept șablon adecvat pentru a modela interfața β-arrestinelor cu 5-HTR1A și 5-HTR1B.

Utilizând structura Arr2-NTSR1 ca șablon și structura cristalină a 5-HTR1B legată de ergotamină ca model inițial pentru 5-HTR1B (PDB: 4IAR),29 am generat un model homologic al complexului Arr2-5-HTR1B, în care interfața centrală dintre Arr2 și 5-HTR1B este similară cu cea a complexului Arr2-NTSR1 (Fig. 6a, b). Am efectuat apoi experimente de reticulare a disulfurilor pentru a testa asamblarea complexului Arr2-5-HTR1B prezentată în modelul de omologie (Fig. 6c și informații suplimentare, Fig. S10).

Am observat semnale de reticulare între reziduurile de buclă a degetelor D67 L68, V70 și L71 din Arr2 și reziduurile N373, E374 și D375 la întoarcerea dintre TM7 și helixul 8 din 5-HTR1B (Fig. 6c). Reziduurile D67, L68, V70 și L71 din bucla degetului s-au încrucișat cu reziduurile receptorului R308 și K311 la suprafața interioară a TM6 (informații suplimentare, Fig. S10). Aceste date de reticulare au susținut un mod conservat de legare a buclei degetelor Arr2 cu cavitatea intracelulară a domeniului TM al 5-HTR1B (Fig. 6a, b). Datele de reticulare disulfidică au arătat, de asemenea, semnale de reticulare între reziduurile R285 și G286 ale reziduurilor Arr2 din bucla inferioară a arrestinei cu reziduul K79 al ICL1 din 5-HTR1B (Fig. 6c și informații suplimentare, Fig. S10). Această reticulare specifică este în concordanță doar cu orientarea arrestinei în modelul Arr2-NTSR1, dar nu este compatibilă cu complexul vizual arrestin-rhodopsină. Împreună, aceste date de reticulare au susținut o interfață centrală între regiunea de creastă Arr2 și partea intracelulară a domeniului TM al 5-HTR1B, care este conservată cu cea din complexul Arr2-NTSR1 (Fig. 6a-c).

5-HTR1B conține mai multe reziduuri de serină și treonină în zona centrală a ICL3 lung care pot fi fosforilate pentru legarea la suprafața domeniului N al arrestinei încărcate pozitiv (Fig. 6d). Am proiectat mutații ale perechilor de cisteină în interfața potențială dintre ICL3 a receptorului și domeniul N al Arr2 și am constatat că reziduurile T268, S295, L298 și E300 ale ICL3 au fost reticulate cu reziduurile de la suprafața foii β superioare, inclusiv T56, V81, N83, K147 și K157 ale Arr2 (Fig. 6e și informații suplimentare, Fig. S10). Reziduurile S260 și T268 de pe ICL3 au prezentat semnale de încrucișare cu reziduurile K11 de pe primul β-strand și N15 de pe virajul care urmează primului β-strand din Arr2 (Fig. 6e și informații suplimentare, Fig. S10). Reziduul S260 se află aproape de capătul C-terminal al TM5, iar reticulația sa cu K11 pe partea încărcată pozitiv a domeniului N al Arr2 este posibilă numai în orientarea Arr2-NTSR1, dar nu și în orientarea arestină vizuală-rodopsină, deoarece în structura complexului arestină vizuală-rodopsină, atât TM5, cât și 6 al receptorului sunt poziționate la locul din spate al suprafeței încărcate pozitiv a domeniului N al arestinei.

De asemenea, am observat un model de reticulare Arr2 aproape identic între 5HTR1A și 5-HTR1B. S-au observat semnale de încrucișare între reziduurile D67, L68, V70 și L71 ale buclei finger loop din Arr2 și reziduurile N404, K405 și D406 (care corespund la N373, E374 și D375 din 5-HTR1B) la întoarcerea dintre TM7 și helixul 8 din 5-HTR1A (informații suplimentare, Fig. S11). Reziduurile D67 și L68 din bucla degetului au fost, de asemenea, reticulate cu reziduurile R339 și K342 ale receptorului (care corespund lui R308 și K311 din 5-HTR1B) la suprafața interioară a TM6 (informații suplimentare, Fig. S11). Am observat, de asemenea, reticulații disulfidice între reziduurile R285 și G286 ale buclei inferioare Arr2 și reziduul L67 al ICL1 din 5-HTR1A (corespunzător lui K79 din 5-HTR1B) (informații suplimentare, Fig. S11). Aceste date de reticulare susțin o interfață centrală similară între Arr2 cu 5-HTR1A și 5-HTR1B, care este conservată cu cea din complexul Arr2-NTSR1 (Fig. 6a, c).

ICL3 din 5-HTR1A conține mai mult de 100 de resturi de aminoacizi (de la 233 la 336) cu 12 resturi de serină sau treonină care constituie șase coduri parțiale de fosforilare împreună cu resturi de acid glutamic sau acid aspartic (Informații suplimentare, Fig. S12). Am proiectat mutații ale perechilor de cisteină pentru a cartografia interfața potențială dintre ICL3 a acestui receptor și domeniul N al Arr2. Datele de încrucișare au arătat că reziduurile ICL3 V230, T240, P250, R261, K270 și D285 s-au încrucișat cu V81 și K160 în N-domeniul Arr2 (informații suplimentare, Fig. S11). Reziduul P14 din primul catenar β al Arr2 s-a încrucișat puternic cu reziduurile ICL3 N300, P308, P315, P318, P321 și R323 din 5-HTR1A (informații suplimentare, Fig. S11).Aceste date de reticulare, împreună cu modelul de omologie al complexului Arr2-5-HTR1B, au oferit o imagine de ansamblu a modului în care 5-HTR1A și 5-HTR1B recrutează Arr2.

În această lucrare, raportăm o structură a Arr2 în complex cu NTSR1, un GPCR de clasă A, prin analiza crio-EM cu particule unice. În timp ce modul de legare a interfeței de coadă dintre coada C-terminală a receptorului și domeniul N încărcat pozitiv al arrestinei este conservat cu cel din complexul arestin-rhodopsină vizuală, această structură prezintă o orientare diferită a lui Arr2 față de cea observată în complexul arestin-rhodopsină vizuală. Modelarea omologiei și cartografierea interfeței de reticulare a disulfurilor demonstrează că această interfață centrală este conservată în complexele Arr2 cu subfamilia 5-HTR1A și 1B. În aceste modele de complexe, orientarea lui Arr2 permite ICL3 a receptorului să ajungă la suprafața domeniului N al Arr2, oferind posibilitatea ca un GPCR care nu are o coadă C-terminală să folosească ICL3 pentru a interacționa cu domeniul N al arrestinei. Deoarece Arr2 și Arr3 sunt parteneri proteici exprimați omniprezent pentru transducția semnalului multor GPCR nevăzători, studiile noastre structurale și biochimice privind interacțiunea Arr2 cu membrii subfamiliei NTSR1 și 5-HTR1 au oferit un model alternativ pentru înțelegerea interacțiunii Arr2 și Arr3 cu GPCR nevăzători.

.