Peptide antimicrobiene: Their Role as Infection-Selective Tracers for Molecular Imaging

Abstract

Peptidele antimicrobiene (AMPs) sunt o clasă eterogenă de compuși care se găsesc într-o varietate de organisme, inclusiv la om și, până în prezent, au fost izolate și caracterizate sute dintre aceste structuri. Ele pot fi descrise ca fiind microbicide naturale, selectiv citotoxice pentru bacterii, prezentând în același timp o citotoxicitate minimă față de celulele mamiferelor din organismul gazdă. Acestea acționează prin atracția lor electrostatică relativ puternică față de celulele bacteriene încărcate negativ și printr-o interacțiune relativ slabă față de celulele gazdă eucariote. Capacitatea acestor peptide de a se acumula în focarele de infecție, combinată cu citotoxicitatea minimă a gazdei, a motivat această trecere în revistă pentru a evidenția rolul și utilitatea AMP-urilor pentru PET, punând accentul pe mecanismul lor de acțiune și pe diferitele interacțiuni cu celula bacteriană. Aceste detalii reprezintă informații esențiale pentru proprietățile lor selective. De asemenea, descriem strategia, proiectarea și utilizarea acestor peptide ca potențiale produse radiofarmaceutice, deoarece combinarea lor cu modalitățile de medicină nucleară, cum ar fi SPECT sau PET, ar permite examinarea neinvazivă a întregului corp pentru detectarea infecției oculte care cauzează, de exemplu, febră de origine necunoscută.

1. Introducere

În comparație cu alte tehnologii convenționale, imagistica tomografică poate evalua procesele patologice în profunzimea corpului, în mod neinvaziv și relativ rapid. Prin urmare, nu este surprinzător faptul că imagistica moleculară a sporit puternic investigarea diferitelor procese de boală și a devenit un instrument esențial în domeniul oncologiei, atât pentru cercetare, cât și pentru îngrijirea pacienților . Un alt avantaj major al imagisticii este capacitatea sa de a oferi o evaluare holistică, tridimensională a întregului organ sau corp, mai puțin susceptibilă de a fi limitată de erori de eșantionare și, prin urmare, de a se corela bine cu procesul global al bolii. În timp ce progresele continue în imagistica moleculară au oferit oportunități de neegalat pentru metode mai rafinate de monitorizare a bolilor, instrumentele de evaluare a infecției și inflamației rămân limitate. Două metode imagistice, utilizate pe scară largă în clinici în prezent, includ tomografia computerizată (CT) de înaltă rezoluție care măsoară modificările anatomice (și, prin urmare, tardive) sau tomografia cu emisie de pozitroni (PET) cu 2-fluoro-deoxi-D-glucoză (18F-FDG) marcată cu 18F, care este un marker general al activității metabolice. Deoarece 18F-FDG se acumulează, de asemenea, în locurile de infecție și inflamație din cauza metabolismului ridicat al glucozei în aceste loci , astfel că este nespecific pentru infecție. Prin urmare, a devenit din ce în ce mai important să se dezvolte agenți de imagistică a infecțiilor mai specifici și mai selectivi. Marcarea directă, ex vivo, a leucocitelor este considerată „standardul de aur” pentru imagistica infecțiilor prin PET. Din păcate, acest proces este foarte laborios și consumator de timp și necesită manipularea produselor sanguine . Alternativ, leucocitele marcate indirect pot fi obținute cu ajutorul unor molecule radiomarcate, cum ar fi peptidele chemotactice sau citokinele, care se leagă de receptorii de pe leucocite . Din păcate, efectele biologice ale unora dintre compușii care țintesc receptorii de leucocite au limitat utilizarea lor clinică ca agenți de imagistică moleculară specifică infecțiilor . Deși leucocitele marcate cel mai frecvent, neutrofilele și limfocitele, sunt destul de selective pentru infecție, există cazuri în care acestea nu reușesc să detecteze o infecție sau se acumulează în locurile neinfectate. Dacă infecția nu reușește să provoace un răspuns imunitar, leucocitele marcate nu se vor acumula la loci infectați, ceea ce poate fi cazul unui individ cu imunitate severă sau în cazul infecției cu anumiți agenți patogeni, cum ar fi Mycobacterium tuberculosis sau Pneumocystis carinii. Unele afecțiuni imunitare neinfecțioase, cum ar fi artrita reumatoidă, pot, de asemenea, să provoace un răspuns imunitar și să acumuleze markerul . Prin utilizarea unor trasori diferiți, sunt posibile diferite strategii de direcționare pentru a obține imagini ale infecției cu ajutorul PET.

Tractorii care interacționează direct cu microbii patogeni responsabili de infecție sunt, prin natura lor, foarte specifici pentru infecție și, spre deosebire de leucocitele marcate, nu ar trebui să se acumuleze în inflamațiile sterile. Aceste tipuri de trasori includ antibioticele și peptidele antimicrobiene radiomarcate. Ciprofloxacina marcată cu technețiu-99m (-ciprofloxacina) a fost cel mai studiat trasor pe bază de antibiotic pentru imagistica SPECT a infecțiilor, vizând ADN-girasa, o enzimă prezentă în toate bacteriile care se divid și despre care se crede că nu se acumulează în bacteriile moarte sau în inflamațiile sterile. Unele probleme asociate cu utilizarea sa ca trasor în imagistica SPECT a infecțiilor au apărut în ceea ce privește puritatea și stabilitatea radiochimică slabă . Mai recent, s-a raportat că localizarea în focarele infectate are loc în principal prin extravazarea și staza crescută. Acest proces are loc, de asemenea, în locurile neinfectate cu permeabilitate vasculară crescută, iar -ciprofloxacina se poate acumula în locurile de inflamație sterilă, reducând astfel specificitatea sa pentru infecție .

Peptidele antimicrobiene (AMP) au atras interesul ca vectori potențiali de direcționare pentru dezvoltarea de trasori PET concepuți pentru detectarea infecției. Aceste peptide se găsesc într-o varietate de organisme, inclusiv la om, și, până în prezent, au fost izolate și caracterizate sute de peptide. Se crede că aceste peptide funcționează ca microbicide cu spectru larg și fac parte din sistemul imunitar înnăscut al multor eucariote, inclusiv al oamenilor. Indiferent de originea lor, ele au multe proprietăți comune, cum ar fi faptul că au o sarcină pozitivă netă, sunt amfipatice și, în majoritatea cazurilor, sunt active la nivelul membranei. Datorită rolului lor în organism ca microbicid natural, aceste peptide antimicrobiene sunt selectiv citotoxice pentru bacterii, prezentând în același timp o citotoxicitate minimă față de celulele organismului gazdă. Se crede că natura cationică netă a peptidelor are ca rezultat o atracție electrostatică relativ puternică față de celulele bacteriene încărcate negativ și o atracție relativ slabă față de celulele gazdă eucariote, care sunt, de obicei, mai puțin încărcate negativ decât cele procariote, și se crede că acestea stau la baza acestei discriminări de tip celular . Capacitatea acestor peptide de a se acumula la locurile de infecție, combinată cu citotoxicitatea sau atracția lor aproape neglijabilă față de celulele gazdă, face ca aceste peptide să fie atractive ca vectori de direcționare pentru imagistica PET a infecției .

2. Prezentare generală a peptidelor antimicrobiene

Peptidele antimicrobiene sunt biomolecule conservate din punct de vedere evolutiv care fac parte din mecanismele de apărare în multe organisme , de la procariote până la animale multicelulare precum oamenii . Ele fac parte din prima linie de apărare împotriva microbilor patogeni la animalele superioare și la multe forme de viață inferioare; ele sunt singura formă de apărare împotriva microbilor patogeni și saprofiți . Citotoxicitatea selectivă a acestor peptide, care atacă microbii patogeni și lasă celulele gazdă nevătămate, se datorează diferențelor fundamentale în compoziția și structura celulelor gazdă față de cele ale bacteriilor și drojdiilor patogene. În ciuda faptului că unele AMP prezintă efecte imunomodulatoare și/sau un comportament chemotactic, o trăsătură comună a acestor peptide antimicrobiene este aceea că sunt amfipatice, dar posedă o sarcină globală pozitivă . Aproximativ 1 500 de peptide antimicrobiene au fost caracterizate la o gamă largă de organisme, iar clasificarea acestor peptide poate fi complicată din cauza gradului ridicat de disimilaritate a secvențelor între diferitele peptide. Cu toate acestea, s-a încercat clasificarea pe baza compoziției de aminoacizi și a structurilor secundare.

Au fost identificate trei grupuri mari (tabelul 1), și anume, peptidele α-helicoidale, peptidele β-sheet care conțin cisteină și peptidele flexibile bogate în aminoacizi specifici, cum ar fi prolina, triptofanul, histidina, arginina și glicina .

2.1. Peptide antimicrobiene α-helicoidale

Aproximativ 30 până la 50% din toate peptidele antimicrobiene identificate și studiate până în prezent conțin structuri α-helicoidale predominante. Acest lucru se poate datora ușurinței relative cu care aceste peptide sunt sintetizate chimic, ceea ce permite o caracterizare extinsă în laborator. Aceste peptide constau, de obicei, din 12-40 de resturi de aminoacizi și conțin o abundență de resturi stabilizatoare de helix, cum ar fi alanina, leucina și lizina, dar niciodată cisteina. În soluțiile apoase, aceste peptide sunt adesea nestructurate, dar își asumă conformațiile α-helicoidale amfipatice atunci când sunt asociate cu o membrană celulară sau într-un mediu mimetic de membrană. Adesea, aceste peptide nu sunt strict α-helice și pot conține o încovoiere internă .

2.2. Peptide antimicrobiene cu foaie β

Celălalt grup major de peptide antimicrobiene sunt cele care conțin, de obicei, între două și zece reziduuri de cisteină care formează între una și cinci legături disulfidice între lanțuri. Această interacțiune de legătură permite acestor peptide să adopte conformația β-sheet. Majoritatea peptidelor antimicrobiene β-sheet fac parte din familia defensinelor, iar aceste peptide sunt conservate din punct de vedere evolutiv în plante, ciuperci, insecte, moluște și animale vertebrate. Defensinele constau, de obicei, din două-trei foițe β antiparalele, stabilizate prin trei-patru legături disulfidice intramoleculare; cu toate acestea, în unele cazuri, la extremitatea N- sau C-terminală se găsește un segment α-helicoidal sau nestructurat. Spre deosebire de peptidele antimicrobiene α-helicoidale, care sunt nestructurate în soluții apoase, defensinele mențin o structură globulară compactă în astfel de condiții . În afară de similitudinea generală în structura secundară, majoritatea α-defensinelor derivate de la mamifere posedă două caracteristici comune suplimentare, și anume, o buclă proeminentă rezultată dintr-o punte de sare conservată arginină/glutamat și un β-bulge cauzat de un motiv conservat glicină-X-cisteină (X: orice aminoacid) între primul și al doilea reziduu de cisteină .

2.3. Peptide antimicrobiene flexibile bogate în aminoacizi specifici

O minoritate de peptide antimicrobiene conțin o proporție mare de anumiți aminoacizi, cum ar fi prolina, triptofanul, histidina, arginina și glicina. Printre membrii reprezentativi ai acestei clase se numără indolicidina bovină bogată în triptofan și tritrpticina porcină, histatinele umane bogate în histidină și PR-39 porcină bogată în arginină și prolină. Datorită compoziției lor neobișnuite de aminoacizi, aceste peptide au structuri secundare foarte variabile. De exemplu, indolicidina de 13 aminoacizi (ILPWKWPWPWWPWRR), adoptă o conformație în mare măsură extinsă în prezența micelilor zwitterionice compuse din substanțe precum dodecil-fosfocholina sau sulfatul de sodiu-dodecil anionic .

3. Mecanisme de specificitate celulară și selectivitate a peptidelor antimicrobiene

Diferențele inerente în compoziția și arhitectura membranei microbiene față de cea a celulei gazdă ajută la selectivitatea peptidelor antimicrobiene. Reglarea expresiei sau a localizării peptidelor este, de asemenea, considerată a preveni interacțiunile nedorite cu celulele gazdă vulnerabile.

3.1. Specificitatea țintei și toxicitatea celulară selectivă

O membrană biologică poate fi privită ca un simplu mozaic fluid format din fosfolipide intercalate cu proteine. La diferite organisme, gliceridele și sterolii pot contribui, de asemenea, la arhitectura biochimică și la topologia de suprafață a acestor membrane. Cu toate acestea, există diferențe fundamentale între membranele celulelor microbiene și cele ale celulelor animale, care permit peptidelor antimicrobiene să facă distincția între aceste celule și să vizeze selectiv una în detrimentul celeilalte, așa cum este schițat în figura 1 .

Figura 1

Direcționarea pe membrană a peptidelor antimicrobiene și baza selectivității lor (adaptat din ).

3.2. Compoziția membranară, sarcina și hidrofobicitatea

Componenta centrală a aproape tuturor biomembranelor naturale este bistratul fosfolipidic. Aceste bilayere sunt amfipatice, ceea ce înseamnă că au atât regiuni hidrofobe, cât și hidrofile. Cu toate acestea, membranele celulare eucariote și procariote diferă semnificativ în ceea ce privește compoziția exactă și energetica celulară (figura 2). Fosfatidilcolina (PC) și analogul acesteia, sfingomielina (SM), precum și fosfatidiletanolamina (PE) nu au sarcină în condiții fiziologice . Colesterolul și alți steroli, cum ar fi ergosterolul, care se găsesc din abundență în membranele eucariote, dar foarte rar în membranele procariote, au, de asemenea, în general, sarcină neutră (figura 2) . Fosfolipidele hidroxilate, cum ar fi fosfatidilglicerolul (PG), cardiolipina (CL) și fosfatidilserina (PS), posedă o sarcină negativă netă în condiții fiziologice. Se poate observa cum sarcina membranei se datorează în principal raportului și localizării diferitelor fosfolipide, membranele celulare care cuprind în principal PG, CL și PS, cum este cazul majorității bacteriilor patogene, fiind foarte electronegative, în timp ce membranele bogate în PC, PE sau SP tind să aibă o sarcină netă neutră, cum este cazul membranelor celulelor de mamifere .

Figura 2

Arhitectura lipidică comparativă a membranelor citoplasmatice microbiene și umane. Membranele citoplasmatice ale agenților patogeni bacterieni (Escherichia coli, Staphylococcus aureus sau Bacillus subtilis) și fungici (Candida albicans) sunt comparate cu cea a eritrocitelor umane în ceea ce privește compoziția relativă și distribuția între frunzele membranei interne și externe. Constituenții membranari, de la anionic (stânga) la neutru (dreapta), sunt CL, PG, PE, PC, SM și steroli (colesterol sau ergosterol, ST). Observați că diferența marcantă dintre agenții patogeni microbieni și eritrocitele umane rezidă în compoziția și asimetria fosfolipidică. Se crede că aceste diferențe explică afinitatea selectivă a peptidelor antimicrobiene pentru celulele microbiene față de celulele gazdă, în măsura în care aceasta există pentru o anumită peptidă antimicrobiană. Chei: deschis, E. coli; hașurat orizontal, S. aureus; umbrit, B. subtilis; în carouri, C. albicans; solid, eritrocit uman (adaptat din ).

3.3. Asimetria membranelor

Deși membranele celulare nu sunt nici simetrice, nici statice, diferențele dintre bistraturile fosfolipidice ale mamiferelor și microbienelor pot servi ca potențiale ținte pentru peptidele antimicrobiene. În unele celule, cum ar fi eritrocitele bovine, doar 2% din conținutul total de PE este localizat pe frunza membranei externe . Diferențele în ceea ce privește simetria membranei, saturația straturilor bistratificate de fosfolipide și stoichiometria compozițională vor influența fluiditatea membranei și tranziția de fază. În mod similar, sarcina folioanelor interioare și exterioare ale bicameralului celular poate fi, de asemenea, diferită .

3.4. Liganzi și receptori microbieni ca ținte pentru peptidele antimicrobiene

Experimentele au arătat că versiunile cu D și L-aminoacizi ale peptidelor antimicrobiene prezintă afinități de legare similare pentru celulele-țintă, sugerând că receptorii stereospecifici nu sunt implicați în direcționarea celulelor patogene . Cu toate acestea, mai multe studii par să infirme acest lucru și sugerează că anumite proteine situate în membrana celulelor microbiene pot servi drept ținte de legare pentru anumite clase de peptide antimicrobiene, cum ar fi histatinele. Acest lucru ar susține constatările conform cărora histadinele sunt implicate în mecanismele de apărare locală cu un anumit tip de agenți patogeni și au fost recuperate în răni dentare sau cutanate. Unii cercetători postulează, de asemenea, că componentele anionice ale membranelor celulare, de exemplu, CL, PG sau lipopolizaharida (LPS), pot servi drept pseudoreceptori, permițând interacțiunea inițială dintre peptida antimicrobiană și ținta celulară microbiană . Prin urmare, receptorii de legare antimicrobiană pot fi o cale alternativă de interacțiune a AMP cu învelișul celular bacterian.

3.5. Potențialul transmembranar

Potențialul transmembranar este încă un alt mod în care variază celulele microbiene și cele de mamifere și constă în separarea de sarcină care există între straturile interne și externe ale membranei citoplasmatice. Un gradient electrochimic, care rezultă din ratele diferite sau din schimbul de protoni de-a lungul membranei celulare, este denumit potențial transmembranar (Δψ). O celulă normală de mamifer are un Δψ cuprins între -90 și -110 mV. Cu toate acestea, bacteriile patogene prezintă, în general, Δψ în intervalul -130 – -150 mV. Această diferență semnificativă de potențial electrochimic poate fi un alt factor care permite peptidelor antimicrobiene să facă distincția între celulele gazdă și cele țintă .

4. Toxicitate selectivă bazată pe proiectarea peptidelor antimicrobiene

În mediul intercelular apos, se crede că multe peptide antimicrobiene adoptă conformații extinse sau nestructurate, deși este posibil ca acest lucru să nu fie cazul dacă sunt prezente legături intramoleculare, care vor asigura o conformație specifică într-o varietate de medii datorită rigidității induse. Odată ce peptida antimicrobiană se leagă de membrana celulară a unui microb patogen, aceasta poate suferi modificări conformaționale semnificative și poate adopta o conformație specifică, cum ar fi o α-helix. Studiile sugerează că conformațiile dinamice și/sau inerente ale peptidelor antimicrobiene au un efect asupra citotoxicității lor selective . În plus, peptidele antimicrobiene pot suferi tranziții conformaționale, autoasociere sau oligomerizare în membrana agentului patogen țintă, dar nu și în membrana celulei gazdă, pentru a crește toxicitatea specifică a celulei . Zhang și colaboratorii au utilizat peptide sintetice de testare care au fost uniform cationice, dar au variat în conformație și au inclus structuri extinse, ciclice, α-helicoidale și β-sheet. S-a stabilit că toate peptidele de test au fost capabile să interacționeze cu și să penetreze monostraturile lipidice compuse din PG, un fosfolipid încărcat negativ. Cu toate acestea, numai peptidele α-helicoidale și extinse au fost capabile să interacționeze cu membrana PC, care este mai încărcată neutru. În cadrul aceluiași studiu s-a constatat, de asemenea, că peptidele β-sheet au fost capabile să translocheze fosfolipidele de la frunza interioară la cea exterioară la concentrații mai mici decât cele necesare pentru permeabilizarea membranei. În mod similar, Kol și colaboratorii au arătat că peptidele cu o conformație comparabilă, dar bogate în histidină și lizină și lipsite de triptofan, au fost, de asemenea, capabile să inducă niveluri semnificative de translocare a fosfolipidelor. Din aceste studii se poate concluziona că nu numai că peptidele antimicrobiene interacționează cu membranele fosfolipidice cu o compoziție și simetrie doar specifice, dar sunt, de asemenea, capabile să afecteze remodelarea membranelor în celule specifice.

4.1. Afinitatea preferențială in vivo pentru celulele microbiene față de celulele de mamifere

Welling și colegii săi au efectuat un experiment in vivo în care au testat afinitatea de legare a unui fragment radiomarcat al peptidei antimicrobiene ubiquicidină cationică -UBI 29-41 pentru celulele microbiene în comparație cu celulele gazdă. În cadrul studiului, animalele au fost infectate cu Candida albicans, Klebsiella pneumonia sau Staphylococcus aureus. Inflamațiile sterile au fost, de asemenea, induse în mușchii coapsei animalelor prin injectarea de microorganisme omorâte termic sau de LPS purificat, pentru a servi drept controale. Peptidele radiomarcate s-au acumulat într-o măsură semnificativă în locurile infectate în raport cu părțile sterile sau cu părțile inflamate neinfectate ale corpului. Acest experiment in vivo a demonstrat că peptidele pot face distincția între celulele gazdă și cele microbiene și, de asemenea, se acumulează în locurile infectate. Prin măsurători scintigrafice s-a stabilit că peptidele radiomarcate s-au acumulat în țesuturile infectate într-un ritm rapid și că rata de acumulare în țesuturile infectate a fost de până la cinci ori mai mare decât în țesuturile neinfectate. Această localizare rapidă a fost interpretată ca urmare a faptului că peptidele au o afinitate mai mare sau preferențială pentru suprafața celulei-țintă în raport cu suprafața celulei gazdă.

4.2. Localizarea peptidelor antimicrobiene citotoxice limitează expunerea țesuturilor vulnerabile ale gazdei

Este posibil ca citotoxicitatea celulelor gazdă să fie redusă la multe organisme multicelulare datorită localizării lor în țesuturile care nu sunt vulnerabile la efectele lor citotoxice. La majoritatea animalelor, aceste peptide sunt secretate de celule pe suprafețe relativ inerte și robuste, cum ar fi epiteliile intestinelor sau ale plămânilor sau, la amfibieni, pe piele. Aceste localități sunt cele mai susceptibile de a interacționa cel mai frecvent cu microbi potențial dăunători, iar expresia majorității peptidelor antimicrobiene este fie constitutivă, fie rapid inductibilă, pentru a le permite să facă parte din primele apărări împotriva agenților patogeni . Un alt mijloc de protejare a țesuturilor sensibile ale gazdei împotriva peptidelor antimicrobiene este reprezentat de includerea acestora în granulele din leucocitele fagocitare, care înghit agenții patogeni și îi expun la concentrații letale de peptide antimicrobiene și agenți oxidanți. Clasa defensinelor de peptide antimicrobiene este utilizată în acest mod, deoarece acestea sunt unele dintre cele mai toxice și mai puțin selective dintre peptidele antimicrobiene produse de gazdă. Micro-mediul ușor acid din cadrul fagolizozomului matur este, de asemenea, cel mai eficient mediu pentru defensine, deoarece acestea prezintă citotoxicitate maximă în aceste condiții .

5. Mecanismele de acțiune a peptidelor antimicrobiene

Structurile în general conservate ale peptidelor antimicrobiene, la o mare varietate de organisme, oferă unele indicii cu privire la mecanismele lor de acțiune. Aceștia sunt aproape exclusiv amfipatici și cationici în condiții fiziologice, iar acest lucru se crede că ajută la selectivitatea celulelor lor țintă. Peptida antimicrobiană ideală ar trebui să aibă o citotoxicitate scăzută pentru celulele gazdă, dar să fie toxică pentru o gamă largă de microbi patogeni. Determinanții antimicrobieni ar trebui să fie ușor de accesat și nu ar trebui să fie predispuși la schimbări sau modificări. În general, peptidele antimicrobiene au structuri amfipatice care le permit să interacționeze cu membranele fosfolipidice, structuri care sunt esențiale pentru toți agenții patogeni . Parametrii cum ar fi conformația (), hidrofobicitatea (), momentul hidrofob (), sarcina (), unghiul polar () și amfipacitatea () sunt toți importanți pentru funcționarea peptidelor antimicrobiene. Mai mult, toți acești determinanți sunt interrelaționați și modificarea uneia dintre aceste caracteristici va conduce la modificarea celorlalte .

5.1. Conformație ()

Deși peptidele antimicrobiene pot fi găsite într-o gamă largă de organisme gazdă și au secvențe de aminoacizi diferite, ele pot fi clasificate în câteva grupe discrete pe baza structurii lor secundare. Cele două grupuri cele mai mari includ peptidele care posedă o structură secundară β-sheet sau α-helicoidală. Majoritatea peptidelor antimicrobiene rămase sunt cele care au o proporție neobișnuit de mare de unul sau mai mulți aminoacizi, cum ar fi triptofanul sau prolina și arginina. Peptidele α-helicoidale se găsesc frecvent în lichidul intercelular al insectelor și al amfibienilor și, în general, adoptă o conformație nestructurată sau extinsă în soluție apoasă, adoptându-și structura elicoidală doar la interacțiunea cu o membrană fosfolipidică . Acest lucru se datorează faptului că legătura de hidrogen intramoleculară necesară pentru o conformație α-helică este întreruptă într-un solvent polar, cum ar fi apa. Într-o membrană, grupurile polare de legătură de hidrogen sunt protejate de mediul membranar lipofil (apolar) prin formarea α-helic. Conformația helix expune, de asemenea, lanțurile laterale apolare la mediul lipidic neutru din interiorul membranei. Deși structura primară a clasei β-sheet a peptidelor antimicrobiene prezintă un nivel de disimilaritate în ceea ce privește secvența de aminoacizi, toate acestea au caracteristici comune în ceea ce privește structura amfipatică, posedând domenii hidrofile și hidrofobe distincte .

5.2. Sarcina ()

Majoritatea peptidelor antimicrobiene sunt în general cationice și au sarcini cuprinse între +2 și +9, multe dintre ele posedând domenii foarte bine definite cu sarcină negativă. Această sarcină pozitivă este importantă pentru atragerea inițială și interacțiunea cu membranele celulare anionice ale bacteriilor și ale altor microorganisme patogene. De asemenea, membranele relativ mai puțin anionice ale gazdei nu atrag în mod electrostatic peptidele antimicrobiene și pot conferi peptidelor o anumită selectivitate față de celulele țintă. Bacteriile patogene sunt în general bogate în fosfolipide acide, cum ar fi CL, PG și PS. În plus, acizii teicoici și teichuronici din pereții celulari ai bacteriilor Gram-pozitive și LPS-ul bacteriilor Gram-negative conferă o sarcină electronegativă suplimentară suprafeței celulare bacteriene. S-a stabilit că Δψ a bacteriilor este de obicei cu 50% mai mare decât cea a celulelor mamiferelor și s-a propus ca peptidele antimicrobiene să fie concentrate pe suprafața microbilor patogeni în mod electroforetic. Deși multe studii au reușit să coreleze cationicitatea peptidelor antimicrobiene cu activitatea lor antimicrobiană, nu există o relație strict liniară. Dathe și colaboratorii au demonstrat, în cadrul unor studii cu analogi ai magaininei, că o creștere a cationicității de la +3 la +5 a dus la o creștere a activității antibacteriene atât împotriva speciilor Gram-pozitive, cât și a celor Gram-negative. Cu toate acestea, ei au observat că există o limită a cationicității, după care orice creștere a sarcinii pozitive nu mai crește activitatea antibacteriană. Se crede că această scădere a activității antibacteriene se poate datora faptului că peptidele se leagă atât de puternic de grupul de cap al fosfolipidului încărcat negativ încât translocarea peptidei în celulă a fost imposibilă .

5.3. Amfipaticitatea () și momentul hidrofob ()

Amfipaticitatea este o caracteristică aproape universală în rândul peptidelor antimicrobiene și se obține printr-o serie de structuri peptidice diferite. α-helixul amfipatic este una dintre cele mai comune și mai simple dintre aceste caracteristici. Prin alternarea reziduurilor de aminoacizi anionici și cationici la fiecare trei sau patru poziții, peptida este capabilă să adopte o structură secundară care permite o interacțiune electrostatică optimă cu membranele fosfolipidice amfipatice (figura 3). Această caracteristică permite peptidei să exercite o activitate citotoxică nu numai față de membranele celulare cu sarcină negativă, ci și față de cele cu sarcină neutră sau de natură amfipatică .

Figura 3

Analiză statistică a distribuției reziduurilor în AMP-urile α-helicoidale cu 20 de resturi de întindere N-terminală din surse naturale. Este prezentată o reprezentare grafică a frecvenței diferitelor tipuri de reziduuri în fiecare poziție pe o proiecție a roții elicoidale. Distribuția neuniformă a peptidelor hidrofobe și încărcate contribuie la natura amfipatică a peptidei (adaptat după Tossi et al. ).

Amfipacitatea unei peptide poate fi descrisă prin momentul său hidrofob () care poate fi calculat ca suma vectorială a hidrofobiciilor individuale ale aminoacizilor, normalizată la o helix ideală. O creștere a momentului hidrofob este corelată cu o permeabilizare crescută a membranei celulei țintă. Acest lucru este deosebit de important în interacțiunile cu membranele lipidice care sunt încărcate neutru, în cazul în care este puțin probabil ca factorii de sarcină să determine atracția necesară și interacțiunea cu membrana celulară țintă . Ca și peptidele antimicrobiene α-helicoidale, peptidele β-sheet de apărare a gazdei prezintă, de asemenea, amfipacitate. Aceasta se manifestă sub forma unui număr variabil de ramificații β organizate pentru a forma suprafețe hidrofobe și hidrofile. Ramificațiile β, care sunt adesea antiparalele, sunt stabilizate prin legături disulfidice regulat distanțate sau prin ciclificarea coloanei vertebrale peptidice. Această legătură intramoleculară permite peptidelor antimicrobiene β-sheet să mențină o conformație rigidă chiar și în fluidul extracelular apos și facilitează, de asemenea, multimerizarea, deoarece suprafețele hidrofobe se vor grupa pentru a evita expunerea la mediul apos. Deși mecanismele exacte prin care peptidele antimicrobiene amfipatice determină întreruperea membranei în membrana celulei țintă sunt nedeterminate în prezent, în mare parte pentru că nu se cunoaște conformația exactă a peptidelor în membrane, studiile au arătat că amfipacitatea segregată atât în peptidele antimicrobiene α-helicoidale, cât și în peptidele antimicrobiene cu foaie β are un efect profund asupra întreruperii peptidice a biomembranelor naturale.

5.4. Hidrofobicitatea ()

Hidrofobicitatea unei peptide poate fi definită ca fiind procentul de reziduuri de aminoacizi hidrofobi care alcătuiesc structura sa primară. Pentru majoritatea peptidelor antimicrobiene, hidrofobicitatea este de aproximativ 50% și este esențială pentru funcționarea peptidei, deoarece permite peptidei să interacționeze cu și să pătrundă în bistratul fosfolipidic. Deși o anumită cantitate de hidrofobicitate este esențială pentru funcționarea peptidei antimicrobiene, o hidrofobicitate excesivă va crește probabilitatea ca aceasta să distrugă celulele gazdei și îi va reduce specificitatea pentru celulele microbiene . Wieprecht și colaboratorii au studiat relația dintre hidrofobicitatea peptidelor și capacitatea acestora de a permeabiliza biomembranele. Utilizând analogi ai magaininei ca model de peptide antimicrobiene, aceștia au reușit să mențină aproape constanți factori precum momentul hidrofob, elicitatea și sarcina, producând în același timp analogi cu hidrofobicitate variabilă. Experimentele lor au arătat că hidrofobicitatea a avut un efect redus sau chiar inexistent asupra capacității peptidei de a se lega de membrană sau de a o permeabiliza atunci când aceasta era formată exclusiv din PG. Cu toate acestea, în membranele compuse dintr-un raport 3:1 de PC : PG, peptidele cu cea mai mare hidrofobie au avut o capacitate de permeabilizare de aproximativ 60 de ori mai mare decât cea a peptidei cel mai puțin hidrofobe, iar în membranele compuse numai din PC a existat o diferență de 300 de ori.

5.5. Unghiul polar ()

Unghiul polar al unei peptide se referă la proporția relativă a fațetelor polare față de cele nepolare ale peptidei conformate cu un helix amfipatic. O peptidă elicoidală cu o fațetă compusă în întregime din reziduuri de aminoacizi polari și cealaltă fațetă compusă în întregime din reziduuri nepolare ar avea un unghi polar de 180°. O mai mică segregare între domenii sau o supraabundență de reziduuri hidrofobe ar duce la un unghi polar mai mic. Studiile efectuate de Uematsu și Matsuzaki atât pe peptidele sintetice, cât și pe cele naturale au arătat că un unghi polar mai mic și, prin urmare, o fațetă mai hidrofobă este mai favorabilă permeabilizării membranei. Unghiul polar a fost, de asemenea, corelat cu stabilitatea porilor induși de peptide în biomembrane. Aceștia au demonstrat, de asemenea, că peptidele antimicrobiene cu unghiuri polare mai mici au fost capabile să inducă grade mai mari de permeabilizare a membranei și de translocare la viteze mai mari decât peptidele cu unghiuri polare mai mari. Cu toate acestea, porii formați de peptidele cu unghiuri polare mai mici au fost mai puțin stabili decât cei formați de peptidele cu unghiuri polare mai mari. Se poate observa că proprietățile hidrofobe și hidrofile ale peptidelor antimicrobiene joacă un rol vital în interacțiunile cu membranele celulare fosfolipidice și în permeabilizarea acestora .

5.6. Caracteristici structurale comune ale peptidelor antimicrobiene

Chiar dacă în natură există o mare varietate de peptide antimicrobiene, s-a observat o conservare a caracteristicilor cheie și a structurilor secundare. Extremele caracteristicilor, cum ar fi amfipacitatea, sarcina, momentul hidrofob sau unghiul polar, nu sunt benefice, deoarece tind să compromită fie activitatea antimicrobiană, fie să conducă la creșterea citotoxicității celulelor gazdă. Sarcina minimă pe care o pot avea peptidele pentru a exercita orice fel de activitate antimicrobiană pare a fi +2. Această cationicitate minimă este importantă deoarece permite atracția electrostatică inițială față de membrana bacteriană, care este încărcată negativ. De asemenea, permite deplasarea oricăror alți cationi care ar putea fi deja legați de membrana celulei-țintă și translocarea în interiorul bistratului membranar. În mod similar, hidrofobicitatea peptidei ar trebui să fie moderată, deoarece peptidele antimicrobiene foarte hidrofobe ar viza membranele cu o sarcină net-neutră, cum ar fi celulele gazdă, ceea ce ar duce la o reducere a selectivității țintei și la deteriorarea organismului gazdă. Se poate observa că țintirea selectivă a microbilor patogeni se datorează în mare măsură unui echilibru între electronegativitatea și hidrofobicitatea peptidelor antimicrobiene .

6. Interacțiuni inițiale cu membrana celulară vizată

Interacțiunea inițială dintre peptida antimicrobiană și membrana fosfolipidică a celulei este importantă, deoarece determină selectivitatea celulei țintă și influențează, de asemenea, orice interacțiuni ulterioare cu celula țintă. Interacțiunile inițiale sunt determinate în mare măsură de caracteristicile fizice și chimice atât ale peptidei antimicrobiene, cât și ale membranei celulei țintă .

6.1. Interacțiuni electrostatice

Se crede pe scară largă că interacțiunile electrostatice sunt responsabile pentru direcționarea inițială a celulei microbiene. Un studiu realizat de Matsuzaki a corelat cationicitatea peptidelor antimicrobiene cu capacitatea de legare la membrană, iar faptul că cationicitatea este o caracteristică conservată a aproape tuturor peptidelor antimicrobiene într-o gamă largă de organisme susține și mai mult acest argument. Forțele electrostatice acționează pe o rază lungă de acțiune, iar abundența reziduurilor de lizină și arginină din peptidele antimicrobiene, care sunt atrase de grupările fosfat încărcate negativ ale biomembranelor, conferă și mai multă credibilitate teoriei conform căreia aceste interacțiuni sunt responsabile de atracția inițială către membrana celulei țintă . La bacteriile Gram-negative se crede că peptidele antimicrobiene deplasează cationii care sunt în mod normal asociați cu LPS, deoarece peptidele antimicrobiene posedă o afinitate de legare pentru LPS care este cu aproximativ trei ordine de mărime mai mare decât cationii divalenți asociați de obicei cu această fracțiune. Tulpinile de bacterii în care LPS-ul este puternic substituit cu 4-amino-4-deoxi-L-arabinoză sau este puternic acilatat prezintă o rezistență mai mare la peptidele antimicrobiene încărcate pozitiv, ceea ce conferă și mai multă credibilitate teoriei conform căreia sarcina electrostatică este importantă pentru interacțiunea cu membrana celulară țintă. Bacteriile Gram-pozitive nu au un LPS sau o membrană celulară externă, dar au un perete celular gros alcătuit din polimeri de acid teicuronic sau teicoic. Aceste structuri puternic anionice sunt ținte ideale pentru peptidele antimicrobiene cationice. Tulpinile de Staphylococcus aureus în care acizii teicoici au fost modificați, rezultând o sarcină anionică crescută, sunt mai sensibile la peptidele antimicrobiene cationice . Faptul că majoritatea bacteriilor au un gradient electrochimic puternic (Δψ) în raport cu celulele mamiferelor este, de asemenea, considerat că mărește selectivitatea țintă a peptidelor antimicrobiene .

6.2. Interacțiunile dintre receptor și ligand cu membrana

Câteva studii au arătat că atât peptidele naturale cât și cele sintetice interacționează cu membrana la fel de bine indiferent dacă se utilizează D-aminoacizi sau L-aminoacizi . Acest lucru ar sugera că interacțiunile cu biomembranele nu depind de mecanismele receptor-ligand; cu toate acestea, alte studii au arătat că este posibil ca acest lucru să nu fie valabil pentru toate peptidele antimicrobiene. S-a constatat că nisina, o peptidă ciclică naturală cu acțiune antimicrobiană puternică, se leagă în mod specific de lipidele II legate de membrana bacteriană . În mod similar, s-a demonstrat că tachyplesina are o afinitate specifică pentru LPS. Datele din aceste studii sugerează că legarea mediată de receptori este importantă pentru țintirea celulară la un număr mic de peptide antimicrobiene .

7. Evenimente care urmează legării inițiale la membrană

Determinarea experimentală a atracției inițiale a peptidelor și a interacțiunii cu membranele celulare este, de obicei, mai simplă decât determinarea interacțiunilor care urmează acesteia. O varietate de metodologii, cum ar fi dicroismul circular , cristalografia cu raze X, rezonanța magnetică nucleară , cromatografia lichidă de înaltă performanță în fază inversă și rezonanța plasmonică de suprafață , printre alte tehnici, au fost utilizate pentru a elucida interacțiunile peptidă-membrană. Cu toate acestea, se sugerează că eficacitatea și mecanismele antimicrobiene sunt extrem de sensibile la condiții precum pH-ul, forța osmotică, vâscozitatea soluției și temperatura, astfel încât orice date obținute prin tehnicile menționate mai sus trebuie privite în raport cu aceste condiții . Ulterior legării inițiale la membrană, peptidele antimicrobiene pătrund în membrana fosfolipidică exterioară, fază denumită concentrație de prag, și, în acest fel, este capabilă să își exercite efectele citotoxice în interiorul celulei. Intrarea peptidelor în celulă necesită un număr minim sau o concentrație prag de peptide antimicrobiene pentru a se acumula la suprafața membranei lipidice. Acest eveniment poate fi afectat de alți factori decât concentrația, cum ar fi capacitatea peptidelor de a se multimeriza și, de asemenea, caracteristicile membranei fosfolipidice în sine, cum ar fi compoziția sa lipidică, dimensiunea grupului de cap și fluiditatea . Potențialul transmembranar al bicameralului poate influența, de asemenea, modul în care peptida intră în membrană, deoarece un potențial transmembranar foarte negativ va facilita formarea porilor prin atragerea peptidei încărcate pozitiv în membrană .

8. Modificări ale conformației peptidelor la interacțiunea cu membrana

Multe peptide antimicrobiene, în special cele cu structuri secundare α-helicoidale, suferă o rearanjare conformațională semnificativă la intrarea în mediul nepolar al membranei interne. Peptidele antimicrobiene α-helicoidale sunt în mod normal dezordonate în mediul extracelular, prezentând structuri spiralate sau extinse aleatorii, dar se conformează rapid la un α-helix structurat atunci când sunt asociate cu biomembrana . Unele peptide antimicrobiene pot suferi această schimbare de conformație numai în asociere cu o membrană bistratificată încărcată negativ. Acest lucru se poate datora modului în care sunt dispuse lipidele în astfel de membrane, grupările de cap ale fosfolipidelor inducând periodicitatea optimă a reziduurilor de aminoacizi cationici din peptidă, ceea ce, la rândul său, promovează o conformație corectă în structura secundară elicoidală . S-a sugerat că această caracteristică asigură faptul că peptidele antimicrobiene vor fi „activate” în forma citotoxică numai în prezența membranei celulei-țintă, în acest caz o bacterie încărcată negativ, și nu vor afecta fără discriminare celulele gazdă care nu sunt vizate. Legăturile disulfidice intramoleculare care se găsesc în peptidele β-sheet asigură faptul că acestea își mențin structura secundară chiar și în medii apoase și, astfel, nu suferă rearanjările conformaționale drastice observate în cazul peptidelor α-helicoidale, deși structurile peptidice cuaternare se pot disocia la intrarea în membrană, ceea ce ar putea facilita toxicitatea selectivă . În urma interacțiunii inițiale cu membrana celulară, multe peptide pot suferi o autoasociere care, atunci când este combinată cu interacțiunile lipide-peptide, poate duce la crearea unor structuri complexe care contribuie la efectele citotoxice ale peptidei. Secvența de aminoacizi și conformația peptidei antimicrobiene sub formă de monomer vor dicta capacitatea acesteia de a forma aceste structuri. În cazul peptidelor amfipatice, domeniile hidrofobe sunt capabile să interacționeze cu regiunea hidrofobă nepolară a miezului central al stratului bilapeutic lipidic, conducând astfel peptida mai adânc în membrană. Alternativ, ar putea interacționa și cu fațetele hidrofobe ale altor peptide, promovând multimerizarea în încercarea de a evita expunerea acestor fațete la mediul apos. Acest tip de multimerizare și de interacțiune cu interiorul stratului bilapeutic lipidic poate duce la formarea de pori sau canale în biomembrană căptușite cu peptide, ceea ce duce la pierderea integrității și la permeabilizare. Deoarece biomembranele sunt foarte variabile în ceea ce privește compoziția și structura, este posibil ca o peptidă să se comporte în mai multe moduri diferite atunci când este asociată cu diferite membrane celulare . Au fost propuse mai multe modele pentru a descrie formarea de pori observată în membranele care au fost expuse la peptide antimicrobiene.

8.1. Modelul Butoi-Stave

Acest mecanism de formare a porilor membranari este denumit astfel deoarece peptidele transmembranare, sau complexele peptidice, care căptușesc canalul sunt poziționate într-un inel asemănător unui butoi, peptidele formând dughene transmembranare. Peptidele amfipatice sunt orientate astfel încât domeniile hidrofobe să interacționeze cu cozile nepolare de hidrocarburi situate în interiorul membranei lipidice, în timp ce domeniile hidrofile sunt orientate astfel încât să fie orientate spre canalul apos al porului și să formeze căptușeala acestuia . Inițial, peptidele monomere se acumulează la suprafața celulară și suferă o rearanjare conformațională atunci când intră în contact cu membrana (figura 4). Se crede că acest lucru forțează grupurile de cap ale fosfolipidelor la o parte și induce o subțiere a membranei. Acest lucru permite părții hidrofobe a peptidei să pătrundă în interiorul nepolar al membranei, în timp ce aminoacizii cationici ai peptidei antimicrobiene interacționează cu grupele de cap încărcate negativ. Atunci când se atinge concentrația de prag a peptidelor, monomerii peptidelor se pot agrega pentru a forma multimeri, ceea ce forțează și mai mult peptidele să intre în centrul hidrofob al membranei, deoarece agregarea împiedică părțile hidrofile ale peptidei să fie expuse la părțile hidrofobe ale membranei interioare [figura 4(a)]. Pe măsură ce un număr din ce în ce mai mare de monomeri peptidici se agregă, porul din membrană se extinde .

(a)

(b)

.
(c)

(a)
(b)
(c)

8.2. Mecanismul porului toroidal sau al găurii de vierme

Acest mecanism de formare a porilor a fost bine studiat cu ajutorul peptidelor magaininice α-helicoidale. La contactul cu membrana celulară încărcată, peptidele dezorganizate capătă structura α-helicoidală. Inițial, elicele se orientează astfel încât să fie paralele cu suprafața membranei. Grupurile de cap ale fosfolipidelor polare sunt deplasate, iar suprafața membranei este slăbită, ceea ce duce la o deformare pozitivă a curburii membranei. Ca urmare a acestei deformări și subțieri, membrana este destabilizată și devine mai susceptibilă la alte interacțiuni peptidice. Odată ce se atinge o concentrație limită de peptide, peptidele se reorientează astfel încât să fie perpendiculare pe membrană și încep să se multimerizeze, astfel încât părțile hidrofile ale peptidelor să nu fie în contact cu părțile hidrofobe ale membranei [figura 4(b)]. Porul toroidal nou format este instabil și, în momentul dezintegrării, o parte din peptide sunt forțate să intre în frunza interioară a membranei celulare. Prin urmare, se crede că etapa de dezintegrare a acestor pori tranzitorii este importantă, deoarece permite peptidelor să se transloce în spațiul intracelular, unde pot acționa asupra altor ținte .

8.3. Modelul covorului

Modelul covorului de permeabilizare a membranei se bazează pe acțiunea difuză a multor peptide monomerice asupra membranei celulare. Atunci când pe membrana celulară sunt prezente concentrații suficient de mari de anumite peptide antimicrobiene, unele dintre fosfolipidele membranei sunt deplasate, ceea ce duce la modificări ale fluidității membranei sau aduce slăbiciuni în proprietățile de barieră ale membranei. Efectul cumulativ al acestor deplasări este acela că membrana este slăbită și își pierde integritatea. După cum s-a sugerat anterior, atracția inițială a peptidelor antimicrobiene față de membrană se face prin forțe de atracție electrostatică. Nu se formează canale sau pori specifici și se crede că permeabilizarea și pierderea integrității membranei se datorează proprietăților energetice nefavorabile pe care le determină dispersia fosfolipidelor [figura 4(c)] .

9. Impactul infecțiilor bacteriene asupra sănătății umane și metodele tradiționale de diagnosticare a infecțiilor

Se estimează că până la 85% dintre pacienții care sunt în stare critică în spital au febră, dar nu prezintă niciun alt semn exterior de infecție. Deoarece episoadele prelungite de febră pot fi fatale, este esențial ca orice infecție subiacentă să fie detectată cât mai curând posibil, astfel încât să poată fi inițiat regimul de tratament corect . Metodele tradiționale de diagnosticare pot include examinarea biopsiilor de țesut și încercarea de cultivare a agenților patogeni, o sarcină adesea inexactă și consumatoare de timp, care poate întârzia începerea tratamentului. Se folosesc, de asemenea, proceduri imagistice de diagnosticare, care pot include tomografia computerizată (CT) sau imagistica prin rezonanță magnetică (IRM). Cu toate acestea, aceste tehnici nu sunt, în general, capabile să detecteze infecțiile în stadii incipiente, deoarece necesită modificări morfologice în țesuturi, o caracteristică asociată de obicei cu infecțiile avansate . În plus, acestea se concentrează, în general, pe anumite părți ale corpului, ceea ce înseamnă că este posibil ca infecția să nu fie observată sau ca adevărata amploare a infecției să nu fie detectată. Anticorpii sau imunoglobulinele sau complexele marcate cu radiolat de galiu, cum ar fi 67/68Ga-citrat, pot fi utilizate pentru a evidenția regiunile în care are loc traficul de leucocite cu ajutorul scanării SPECT sau PET. Cu toate acestea, aceste tehnologii nu sunt în măsură să facă o distincție definitivă între țesuturile infectate și cele care sunt inflamate, dar sterile, deoarece traficul de leucocite are loc în ambele cazuri. Având în vedere afinitatea specifică ridicată a peptidelor antimicrobiene naturale pentru bacteriile sau ciupercile patogene, spre deosebire de celulele organismului gazdă, s-a preconizat că acestea pot fi utilizate pentru a ajuta la rezolvarea proceselor de imagistică de diagnosticare .

9.1. Utilizarea peptidelor antimicrobiene ca produse radiofarmaceutice

În mod normal, un produs radiofarmaceutic utilizat pentru imagistica infecțiilor ar trebui să permită detectarea rapidă a bacteriilor și eliminarea rapidă din locurile neinfectate. De asemenea, ar trebui să prezinte o absorbție ridicată și specifică la nivelul situsului infectat, cu cantități minime care să se acumuleze în țesuturile sterile sau nețintă. Compusul ar trebui, de asemenea, să aibă o toxicitate scăzută și să nu inducă un răspuns imunitar. Foarte important, ar trebui să fie capabil să facă distincția între o inflamație sterilă și una infectată. Având în vedere că peptidele antimicrobiene prezintă, în general, un spectru larg de activitate împotriva unei game largi de drojdii și bacterii patogene, acestea sunt molecule-țintă ideale pentru infecțiile în care agentul patogen suspectat nu a fost identificat. În plus, modul lor de acțiune le obligă să se asocieze fizic cu agentul patogen și, prin urmare, ar fi capabile să aducă o sursă emițătoare de radiații gamma sau de pozitroni, cum ar fi technetium-99m (99mTc) sau gallium-67 (67Ga), la locul exact al infecției. Lipsa lor de afinitate pentru celulele organismului gazdă înseamnă, de asemenea, că nu s-ar acumula în țesuturile inflamate sterile. Peptidele antimicrobiene radiomarcate sunt, de asemenea, atractive, deoarece sunt eliminate rapid din sistemul circulator și excretate de organism. În plus, acestea sunt, de asemenea, capabile să pătrundă în țesuturile extravasculare și, astfel, să se acumuleze în locurile infectate într-un interval de timp foarte scurt . În mod ideal, procedura de radiomarcare a unei molecule de direcționare ar trebui să permită atașarea fermă a unui radionuclid la moleculă fără ca aceasta să afecteze negativ capacitatea de direcționare sau farmacocinetica moleculei. Abordările de marcare pot fi fie directe, fie indirecte, după cum urmează: (i)O abordare de marcare directă [figura 5(a)] implică încorporarea radionuclidului pe molecula țintă prin intermediul unei legături covalente. În cazul moleculelor țintă peptidice, se poate forma o legătură covalentă între radionuclid și un reziduu amidic liber corespunzător de Lys și Arg . Utilizarea reziduului tirozină poate cauza probleme asociate cu marcarea, inclusiv legarea nespecifică sau slabă, instabilitatea in vivo a complexului și modificări nedorite ale structurii peptidei, cum ar fi ruperea legăturilor disulfidice interne, care pot altera funcționarea acesteia .(ii) O strategie de marcare indirectă poate fi utilizată prin adăugarea de agenți chelați la molecula țintă [figura 5(b)] . Chelații bifuncționali au fost utilizați pentru a marca moleculele purtătoare de peptide cu radionuclizi. Agentul de chelatare poate fi preîncărcat cu radionuclidul înainte de a fi lipit de fracțiunea purtătoare sau poate fi atașat mai întâi la molecula purtătoare și apoi expus la nuclid pentru chelatare într-un proces cunoscut sub numele de post-etichetare. Post-etichetarea are avantajul că molecula purtătoare poate fi stocată pentru o perioadă lungă de timp până când este necesară, iar radionuclidul, care se dezintegrează, poate fi adăugat cu puțin timp înainte de administrarea produsului radiofarmaceutic. Acest lucru este benefic pentru comercializarea moleculei purtătoare și face ca tehnologia să fie mai ușor de utilizat în spitale sau clinici .

(a)

(b)

.
(a)
(b)

Figura 5

Abordări în radiomarcarea peptidelor. Metoda directă (a) în care radionuclizii sunt atașați covalent de peptidă și metoda indirectă (b) în care radionuclizii sunt atașați la peptidele țintă prin intermediul unor chelatori bifuncționali .

9.2. Ubiquicidina exemplifică o abordare pentru produse radiofarmaceutice derivate din peptide antimicrobiene

Peptida antimicrobiană ubiquicidină (UBI), cu un reziduu de 59 de aminoacizi, este o peptidă de 6,7 kDa care a fost descoperită pentru prima dată în extractele citosolice ale macrofagului murin (figura 6). S-a demonstrat că această peptidă prezintă efecte antimicrobiene împotriva Salmonella typhimurium și Listeria monocytogenes. Ulterior, aceasta a fost găsită într-o gamă largă de alte organisme, inclusiv la om . Deoarece apare în mod natural la om, ubiquicidina nu este o entitate imunogenă, ceea ce o face potrivită pentru administrare ca instrument de diagnosticare. De asemenea, are o afinitate ridicată pentru celulele bacteriene, dar nu vizează celulele mamiferelor, ceea ce o face netoxică pentru pacient și selectivă, în sensul că este puțin probabil să se acumuleze în locurile sterile de inflamație . Au fost efectuate mai multe studii pe fragmente de ubiquicidină atât in vitro cât și in vivo pentru a evalua capacitatea sa de a se lega de celulele bacteriene.

Figura 6

Structura primară a ubiquicidinei, așa cum a fost raportată inițial de Hiemstra și colaboratorii .

Welling și colaboratorii au evaluat întreaga ubiquicidină marcată și diferite fragmente radiomarcate ale peptidei, inclusiv UBI1-18 (KVHGSLARAGKVRGQTPK), UBI29-41 (TGRAKRRMQYNRR), UBI18-29 (KVAKQEKKKKKKKKT), UBI18-35 (KVAKQEKKKKKKKTGRAKRR), UBI31-38 (RAKRRMQY) și UBI22-35 (QEKKKKKKKTGRAKRR) pentru capacitatea lor de a se lega de celulele bacteriene și/sau de leucocitele umane in vitro. Aceștia au constatat că fragmentele peptidice de ubiquicidină UBI 18-35, UBI 31-38, UBI 22-35 și UBI 29-41 au prezentat afinități de legare considerabil mai mari pentru celulele bacteriene decât pentru leucocitele umane. Rezultatele in vivo, obținute prin scintigrafia șoarecilor infectați experimental în urma administrării intravenoase a diferitelor peptide radiomarcate, au arătat că peptidele UBI18-35 și UBI29-41 par a fi cei mai promițători candidați. După o perioadă de postadministrare de 2 ore și 24 de ore, raportul de legare a leucocitelor la bacterii a fost de 1 : 36, 1 : 166 și, respectiv, 1 : 73, 1 : 220 pentru UBI18-35 și UBI29-41. Cercetătorii au concluzionat că UBI29-41 și UBI18-35 au fost peptidele optime pentru a distinge infecțiile de inflamațiile sterile.

9.3. Încercări clinice la om ale -Ubiquicidinei 29-41 ca agent de imagistică a infecțiilor

Akhtar și colaboratorii au studiat eficacitatea -UBI 29-41 ca agent de imagistică a infecțiilor la optsprezece pacienți cu infecții suspecte ale protezelor sau ale țesuturilor moi. Utilizând scintigrafia pentru a monitoriza peptida radiomarcată, cercetătorii au reușit să monitorizeze raportul dintre țintă și non-țintă (T/NT) al agentului de imagistică. Infecția la pacienți a fost confirmată prin cultivarea bacteriilor de la locul infectat sau, în cazul în care acest lucru nu a fost posibil, prin examinarea completă a sângelui. Studiul a constatat că toți pacienții au tolerat bine peptida radiomarcată, nu au fost observate modificări semnificative ale semnelor lor vitale și nu au fost observate efecte secundare conexe în urma administrării de -UBI 29-41. Raportul T/NT a fost determinat la 30, 60 și 120 de minute, scanarea de 30 de minute prezentând cea mai mare valoare medie T/NT. Scanarea anterioară a întregului corp (figura 7) a oferit informații cu privire la biodistribuția trasorului și la căile de eliminare a acestuia de către organism. Se poate observa că trasorul este eliminat în cea mai mare parte prin sistemul urinar și, de asemenea, s-a observat o anumită activitate hepatică dependentă de perfuzie. S-a constatat că agentul de imagistică are o sensibilitate de 100% și o specificitate de 80%. Cercetătorii au concluzionat că -UBI 29-41 a avut o valoare predictivă pozitivă de 92,9%, o valoare predictivă negativă de 100% și o acuratețe diagnostică generală de 94,4%. Peptida radiomarcată a prezentat eficacitate împotriva unei serii de bacterii diferite, inclusiv Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus și Streptococcus pyogenes. Cercetătorii au fost de părere că -UBI 29-41 este un agent imagistic foarte sensibil și specific pentru detectarea infecțiilor țesuturilor moi și osoase la om.

Figura 7

Imaginea anterioară a corpului întreg realizată la 30 de minute după injectarea trasorului care arată rinichii (săgeată punctată), ficatul (săgeată continuă) și vezica urinară (săgeată cu bilă) (adaptat din ).

10. Discuție și perspectivă

Utilizarea modalităților de medicină nucleară, cum ar fi SPECT sau PET, permite clinicienilor examinarea neinvazivă a întregului corp a proceselor fiziologice, cum ar fi infecțiile oculte la nivel celular și, pe lângă faptul că reprezintă un instrument util pentru cercetarea fiziologică și medicală, aceste tehnologii foarte sensibile sunt capabile să detecteze boli fără modificări anatomice sau înainte de acestea (febră de origine necunoscută). Până în prezent, sunt utilizate leucocitele radiomarcate, anticorpii monoclonali împotriva citokinelor/leucocitelor și trasorii asociați cu ținte moleculare sau procese metabolice specifice . Leucocitele radiomarcate au un spectru de limitări (alterarea funcției leucocitare din cauza leziunilor cauzate de radiații), adică au o farmacocinetică greoaie și sunt, de asemenea, relativ nespecifice. În plus, leucocitele marcate și markerii cu greutate moleculară mare, cum ar fi anticorpii, pot avea, de asemenea, o penetrare limitată în țesuturile infectate sau bolnave. Aceasta din urmă a prezentat o imagine de ansamblu care clarifică potențialul larg răspândit al AMP-urilor de a fi evaluate ca sonde de imagistică, având în vedere implicarea lor selectivă unică cu bacteriile. O simplă interogare a literaturii, căutând „peptide antimicrobiene”, a avut ca rezultat aproximativ 6 000 de publicații. Cu toate acestea, de îndată ce interogarea este combinată cu termenul „imagistică”, au rezultat doar 63 de publicații; doar 17 dintre acestea au relevanță clinică (-UBI-29-41 studii/cercetări conexe). Aceasta este o observație importantă, deoarece acest fragment de ubiquicidină poate reprezenta un purtător aproape perfect pentru moleculele de direcționare pentru detectarea infecțiilor. Studiile clinice la om efectuate de Akhtar și colaboratorii cu -UBI 29-41 nu au găsit nicio dovadă de citotoxicitate la pacienți, ceea ce susține constatările din studiul actual. Chiar dacă s-a afirmat că raportul semnal/zgomot este scăzut , acesta este utilizat cu succes de 10 ani. În 2010, studiile clinice efectuate până în prezent au fost justificate de de Murphy et al. față de valoarea lor diagnostică pe o perioadă inițială de 7 ani. -UBI 29-41 meta-analiza a returnat valori ridicate pentru sensibilitate (96,3%), specificitate (94,1%) și acuratețe (95,3%) cu valori predictive pozitive (95,1%) și negative (95,5%) ridicate . Începând cu 2011, au fost efectuate cu succes șapte studii clinice suplimentare (înrolând împreună peste 160 de pacienți) și toate au demonstrat că -UBI29-41-SPECT este un instrument de diagnosticare extrem de precis și selectiv pentru infecția osoasă în cazul piciorului diabetic , al protezelor de șold sau al altor infecții legate de implanturi ; în plus, acesta detectează și osteomielita și endocardita infecțioasă . Se poate afirma că acest domeniu de aplicații pentru imagistica cu -UBI29-41 va continua să crească, de asemenea, deoarece cercetarea cu radioizotopi alternativi, alții decât cei care pot produce în viitor un nou grup de agenți radiofarmaceutici pentru imagistica medicală de diagnosticare prin PET/CT sau PET/MRI clinic. Radioizotopii noi, cum ar fi 68Ga, 82Rb sau 62Cu, pot fi produși la cerere de un generator de radioizotopi fără a fi nevoie de un ciclotron la fața locului și pot servi ca radionuclizi pentru PET. 68Ga a stârnit interes ca emițător de pozitroni pentru imagistica moleculară datorită unora dintre avantajele pe care le oferă în calitate de trasor. Acesta are un timp de înjumătățire radioactivă de 67,71 minute, ceea ce îl face compatibil cu biocinetica majorității produselor radiofarmaceutice cu greutate moleculară mică, cum ar fi peptidele, oligonucleotidele, aptamerii sau fragmentele de anticorpi. Dezintegrarea nucleară a izotopului se face în principal prin emisie de pozitroni (89%), cu o energie medie a pozitronilor de 740 keV. În plus, chimia de coordinare a Ga3+ este bine înțeleasă, ceea ce este util în proiectarea agenților chelați care pot fi utilizați pentru a lega acest radionuclid de un vector de direcționare. Recent, UBI29-41 a fost conjugat cu macrociclul acid 1,4,7-triazacyclonononane-1,4,7-triacetic (NOTA) și ulterior marcat cu 68Ga . Această abordare a fost utilizată inițial cu acidul 1,4,7,10-tetraazaciclododecan-N′,N′′,N′′′,N′′′′ ′′-tetraacetic (DOTA) pentru a obține derivați peptidici cum ar fi DOTA-TOC sau DOTA-TATE pentru complexarea cu 68Ga, care a permis ulterior imagistica PET bazată pe receptori tumorali. Într-un studiu preclinic care a utilizat 68Ga-NOTAUBI29-41-PET s-a demonstrat că conjugarea macrociclului nu a compromis capacitatea peptidei de a se lega selectiv de bacterii in vivo. În afară de UBI, există și alți compuși evaluați pentru imagistica infecțiilor și a inflamațiilor, dar majoritatea peptidelor antimicrobiene disponibile rămân insuficient cercetate în ceea ce privește imagistica infecțiilor. În anul 2000, peptidele neutrofile umane (HNP1-3) au fost considerate, printre alte peptide, ca fiind un agent util pentru identificarea infecțiilor, deoarece, ca parte a mecanismului de apărare în culturile de monocite/limfocite, HNP joacă un rol chemotactic ca molecule mediatoare. Acest rol ambiguu poate fi un dezavantaj în dezvoltarea HNP pentru imagistică; prin urmare, utilizarea anumitor peptide ca vectori de direcționare poate avea unele limitări secundare, în ciuda proprietăților lor celulare favorabile. Deoarece produsele radiofarmaceutice se administrează în principal prin injecție i.v., peptidele pot fi predispuse la degradare enzimatică sau la destabilizarea radioizotopului, așa cum s-a raportat în cazul 18F-UBI29-41 . Peptida derivată din lactoferrină hLF(1-11) s-a dovedit foarte sensibilă ca agent de infecție care vizează tulpini de Acinetobacter baumannii multirezistente la medicamente; cu toate acestea, legarea la Candida albicans, o ciupercă, și excreția hepatobiliară au făcut-o mai puțin favorabilă pentru imagistică . Mai mult, hLF a prezentat efecte imuno-activatoare sau bactericide în funcție de doza administrată, adică s-a întâlnit cu un mecanism de feedback negativ prin modularea interleukinei-10 . Un alt exemplu, AMP Latarcin-2a, extras din veninul păianjenului din Asia Centrală Lachesana tarabaevi, are o activitate litizantă nedorită împotriva bacteriilor Gram-pozitive și Gram-negative, a eritrocitelor și a drojdiilor la concentrații micromolare și, prin urmare, îl face mai puțin luat în considerare pentru detectarea bacteriilor cu PET . În plus, majoritatea bacteriilor sunt capabile să producă atât proteaze de suprafață și/sau secretorii, o strategie de apărare care poate degrada sau inactiva AMP-urile. În consecință, utilizarea compușilor derivați din AMP ca agenți de imagistică ar duce la diagnostice fals-negative, în care o infecție persistentă ar putea fi cu ușurință evaluată greșit sau ar putea fi ignorată în totalitate. Prin înțelegerea acestor mecanisme specifice de apărare intrinsecă a bacteriilor, se poate evita utilizarea structurilor vulnerabile derivate din AMP ca agenți de imagistică a infecției. De asemenea, trebuie remarcat faptul că, cu excepția câtorva structuri, cercetările nu au dezvăluit o țintă de tip receptor specific bacteriilor care să completeze potențialele peptide ca liganzi sau modulatori alosterici. Celulele tumorale, în schimb, exprimă receptori specifici liganzi sau antagoniști ai integrinelor, bombesinei sau somatostatinei, care sunt vizați de trasori SPECT sau PET . În plus, sistemul imunitar al gazdei, atunci când reacționează la infecții, are căi patologice care pot fi imaginate cu ajutorul PET. Macrofagele activate pot acționa ca o țintă echivalentă dependentă de gazdă, care poate fi vizualizată prin 18F-FDG în mod nespecific, dar încărcătura bacteriană reală rămâne supravegheată. În schimb, peptidele derivate din AMP acționează într-un mecanism independent de gazdă: peptidele radiomarcate se vor lega de bacteriile libere și de cele care aderă la celule, dar nu și de cele fagocitate și, prin urmare, bacteriile devin invizibile pentru -UBI29-41-SPECT odată ce sunt încorporate de macrofage . Utilizarea acestei modalități permite, potențial, detectarea timpurie a infecției înainte de a avea loc orice modificări morfologice în organism . De asemenea, permite discriminarea infecției de o inflamație sterilă, care poate părea asemănătoare din punct de vedere superficial, deoarece ambele se pot prezenta ca zone înroșite, umflate și neobișnuit de calde. Acest lucru se datorează fluxului sanguin crescut, permeabilității vasculare îmbunătățite și afluxului de celule albe din sânge care sunt comune în ambele situații . Această din urmă abordare ar pune accentul pe un regim de imagistică cu dublu trasor în viitoarele studii clinice sau chiar pe administrarea dublă a trasorilor (dacă proprietățile radioizotopilor și proprietățile farmacocinetice respective completează abordarea). În concluzie, trasorul ideal pentru imagistica PET clinică a infecțiilor ar trebui să îndeplinească mai multe criterii. (1) ar trebui să susțină o degradare substanțială în sânge și să aibă un grad rezonabil de lipofilie; (2) ar trebui să se acumuleze și să fie reținut la locul infecției (în mod ideal, prin internalizare și amplificare ulterioară), cu o acumulare minimă în locurile neinfectate; (3) ar trebui să aibă o eliminare rapidă a absorbției activității nespecifice din regiunile înconjurătoare pentru un raport semnal/zgomot ridicat; și (4) ar trebui să aibă efecte secundare minime și să fie ușor de preparat, la un cost redus. UBI29-41 și-a dovedit utilitatea pentru imagistica generică a infecțiilor, iar alte produse radiofarmaceutice adecvate pe bază de AMP-uri vor urma, fără îndoială.

Abbreviații

AMP:	Peptide antimicrobiene
B. subtilis:	Bacillus subtilis
C. albicans:	Candida albicans
CL:	Cardiolipină
CT:	Tomografie computerizată
ADN:	Acid dezoxiribonucleic
E. coli:	Escherichia coli
FDG:	Fluorodeoxiglucoză
LPS:	Lipopolizaharidă
MRI:	Imagistică prin rezonanță magnetică
PC:	Fosfatidilcolină
PE:	Fosfatidil-etanolamină
PET:	Tomografie cu emisie de pozitroni
PG:	Fosfatidil-glicerol
PS:	Fosfatidil-serină
S. aureus:	Staphylococcus aureus
SM:	Sphingomyelin
SPECT:	Tomografie computerizată cu emisie de un singur foton
ST:	Steroli
T/NT:	Raportul țintă/nețintă
TATE:	(Tirozină3)octreotat
TOC:	(Fenilalanină1-Tirosină3)octreoidat
UBI:	Ubiquicidină (fragment).

Conflict de interese

Autorii declară că nu au niciun conflict de interese.

Recunoștințe

Lucrările legate de această analiză au fost finanțate și susținute cu amabilitate de Fundația Națională de Cercetare (NRF), de Institutul de Medicină Celulară și Moleculară și de Inițiativa pentru Tehnologii Nucleare în Medicină și Bioștiințe (NTeMBI), o platformă tehnologică națională dezvoltată și gestionată de Corporația Sud-Africană pentru Energie Nucleară (Necsa) și finanțată de Departamentul de Știință și Tehnologie (DST).

.