PLOS ONE

Discuție

Majoritatea medicamentelor chimioterapeutice sunt special concepute pentru a interfera cu sinteza ADN, metabolismul celular și diviziunea celulară. Datorită acestui mod de acțiune, este de așteptat ca aceste medicamente să provoace mai multe tipuri de mutații . Mutagenitatea medicamentelor chimioterapeutice asupra celulelor normale este una dintre cele mai grave probleme în chimioterapie, din cauza posibilității de a induce tumori maligne secundare și rezultate reproductive anormale, cum ar fi sindroamele Down, Klinefelter și Turner. Prin urmare, este imperios necesar să se determine efectul mutagen al medicamentelor chimioterapeutice asupra celulelor normale. Testul micronucleului a fost utilizat pe scară largă pentru a măsura leziunile nereparate ale genomului, iar frecvența crescută a MN prezice riscul de cancer la om . Deoarece MN poate rezulta din ruperea cromozomilor (clastogenitate) sau din cromozomi întârziați (aneugenicitate), detectarea MN are potențialul de a fi utilizată ca un screening pentru inducerea aberațiilor cromozomiale numerice dacă sunt incluse testele care permit identificarea cromozomilor întregi în interiorul MN, cum ar fi testul FISH.

Activitatea clastogenă a epirubicinei în timpul mitozei in vivo a fost raportată prin testul MN din măduva osoasă . În prezent, originea MN induse de epirubicină nu a fost încă determinată. Prin urmare, studiul actual a fost conceput pentru a investiga capacitatea epirubicinei de a induce aneuploidie în celulele somatice și germinale ale șoarecilor masculi. Pentru a determina eficiența metodei, au fost utilizați ca martori pozitivi doi mutageni model, colchicina și mitomicina C, cunoscuți ca având acțiuni aneugenice și, respectiv, clastogene. Rezultatele observate ale MNPCE și distribuția semnalelor per MN în cazul controlului și al celor doi mutageni pozitivi din studiul actual corespund bine cu datele publicate , . Aceste date au confirmat sensibilitatea protocolului experimental urmat în detectarea efectelor genotoxice.

Rezultatele testului MN au arătat că epirubicina produce creșteri dependente de doză în formarea MN în măduva osoasă de șoarece in vivo (Fig. 1) și o creștere a MN colorate centromeric-negativ și centromeric-pozitiv, indicând inducerea atât a clastogenității, cât și a aneugenicității (Fig. 2). Atât potențialul clastogenic, cât și cel aneugenic al epirubicinei în celulele somatice pot da naștere la dezvoltarea de tumori secundare. Rezultatele privind clastogenitatea confirmă constatările studiilor anterioare in vivo, în care s-au observat creșteri ale formării de MN și aberații cromozomiale structurale în celulele somatice de șoarece pe un interval de doze similar după tratamentul cu epirubicină . Rezultatele acestor studii sunt, de asemenea, în concordanță cu inducerea de micronucleu raportată anterior de către epirubicină în celulele canceroase murine in vitro , în eritrocitele din ouăle de găină incubate și în linia celulară limfoblastoidă umană TK6 . Mai mult, inducerea de aberații cromozomiale structurale și numerice a fost, de asemenea, raportată anterior la pacienții cu cancer care au primit chimioterapie cu epirubicină . Studii anterioare au arătat, de asemenea, că epirubicina induce aberații cromozomiale structurale în culturile de celule HeLa , aberații cromozomiale atât structurale, cât și numerice și schimburi de cromatide surori într-o linie celulară de hamster chinezesc și aberații cromozomiale în culturile de limfocite din sângele periferic de la femei cu cancer de sân tratate cu un regim care conține epirubicină in vitro .

Studii la om au arătat că anumite regimuri de chimioterapie cresc frecvența aneuploidiei în celulele germinale , , sugerând că astfel de pacienți pot prezenta un risc mai mare de rezultate reproductive anormale, în special la vârstele reproductive. Prin urmare, este de interes general să se diminueze riscul de producere a aneuploidiei, să se detecteze aneugenia celulelor germinale și să se înțeleagă mecanismele cauzale. În studiul actual, aneuploidia a fost determinată în celulele germinale prin testul spermatozoizilor-FISH cu sonde de ADN specifice pentru cromozomii 8, X și Y de șoarece, fiecare fiind marcat cu o culoare diferită. Pentru a determina fiabilitatea metodelor, colchicina, cunoscută ca fiind predominant aneugenică, a fost utilizată ca substanță de control pozitiv, iar rezultatele controlului pozitiv și negativ au fost în același interval cu cele din studiile anterioare , -. Aceste date au confirmat sensibilitatea protocolului experimental în detectarea efectelor aneuploidogene ale compușilor testați.

Epirubicina este cea mai activă în fazele S și G2 ale ciclului celular; cu toate acestea, are o anumită activitate detectabilă în toate fazele ciclului celular . S-a raportat adesea că substanțele chimice cu proprietăți aneugenice pot modifica progresia diviziunii celulare atât în celulele meiotice, cât și în cele mitotice . În studiul actual, timpul de dezvoltare de la diviziunile meiotice în spermatozoizii la spermatozoizii epididimali a fost evaluat prin testul de încorporare a BrdU. Rezultatele indică în mod clar că epirubicina a prelungit durata diviziunilor meiotice în spermatozoizii de șoarece timp de 48 h (Fig. 3). Prin urmare, aceste observații confirmă constatările anterioare conform cărora inhibarea indusă de epirubicină a funcției topoizomerazei II în timpul diferitelor faze ale ciclului celular încetinește progresia ciclului celular și determină oprirea celulelor în faza G2/M . O astfel de arestare G2/M se poate datora inducerii mașinăriei de control G2, care permite repararea ADN-ului deteriorat înainte ca celulele să treacă la următoarea etapă a ciclului celular .

Informațiile in vivo privind efectele epirubicinei asupra nedisjuncției în timpul meiozei sunt limitate, dar anumite alte antracicline, cum ar fi doxorubicina și derivatul său idarubicina, împiedică segregarea cromozomială și induc creșteri semnificative ale frecvențelor de spermatozoizi disomici și diploizi . Mai mult, un studiu in vitro a arătat că tratamentul culturilor de hamster chinezesc cu epirubicină a indus aberații numerice sub formă de hipodiploidie și hiperdiploidie . În plus, analiza citometrică în flux și histologică a spermatogenezei la șoareci a arătat o creștere a coeficientului de variație în histograma ADN, ca măsură a aneuploidiei, și o creștere a spermatidelor diploide după tratamentul cu epirubicină . În concordanță cu rapoartele citate mai sus, experimentul de față a arătat că expunerea la epirubicină a provocat creșteri semnificative, dependente de doză, ale frecvenței spermatozoizilor disomici și diploizi și că inducerea aneuploidiei a fost sensibilă în mod liniar la doză între 0 și 12 mg/kg de epirubicină (Fig. 4). Aceste observații in vivo sunt, de asemenea, în concordanță cu un raport anterior in vitro asupra limfocitelor umane cultivate de la indivizi sănătoși și de la pacienți cu cancer, la care expunerea la doxorubicină a determinat o creștere a trisomiei cromozomilor 7 și 17 . Mai mult, Ganapathi și colab. au raportat că celulele leucemice umane HL-60 care poartă monosomia 8 ca singura modificare cariotipică au dobândit markerii 7q21 în urma expunerii la doxorubicină. În plus, constatările citogenetice au arătat trisomia 8 la pacienții care au primit cure de chimioterapie sistemică cu antraciclină . Monosomia 7, 7q-, și translocația dezechilibrată incluzând cromozomul 7 au fost observate la pacienții care au primit chimioterapie cu antracicline . Mai mult, aberațiile cromozomiale structurale ale cromozomilor 1, 9 și 16 au fost legate de medicamentele chimioterapeutice care conțin antraciclină .

Printre alte clase de inhibitori ai topoizomerazei II, etoposida a fost studiată anterior în spermatozoizii de șoarece , . Rezultatele acestor studii indică faptul că etopozidul acționează ca un agent genotoxic și induce aneuploidii în celulele germinale în principal meiotice după tratamentul celulelor pachitene. Pe de altă parte, Kallio și Lähdetie, au constatat că sensibilitatea la etopozidă la șoareci a fost cea mai mare în timpul diplotenei-diachinezei spermatozoizilor primari, redusă în timpul pachitenei târzii și scăzută în timpul etapelor preleptotene; un model foarte diferit față de cel al substanțelor chimice care alchilizează ADN-ul. Acești autori au sugerat că etopozidul a cauzat un eșec al rezoluției brațelor cromozomiale recombinate, probabil asociat cu oprirea ciclului celular și declanșarea căii apoptotice. În studiile lor citogenetice detaliate, Marchetti et al. au raportat că pachitena a fost cel mai sensibil stadiu al spermatogenezei pentru inducerea aberațiilor cromozomiale structurale și a aneuploidiei. Deoarece datele lui Schmid et al. și cele ale lui Kallio și Lähdetie au putut demonstra că etopozidul a prelungit ciclul celular meiotic, pare posibil ca efectele observate în primele diviziuni de clivaj de către Marchetti et al. în grupul de 24,5 zile de împerechere să fi fost de fapt induse într-un stadiu ulterior, și anume în timpul diacinezei meiotice, MMI sau MMII, în loc de pachitene, așa cum au sugerat autorii.

În studiul actual, am planificat un studiu spermatozoizilor-FISH pentru a determina dacă tratamentul subacut cu doze mici de epirubicină, inhibitor al topoizomerazei II, ar avea un efect, deoarece etapele mai timpurii ale profazei ar fi fost incluse în tratamentul cu epirubicină. Doze individuale de 0,25, 0,5 și 1 mg/kg de epirubicină au fost injectate în 12 zile consecutive, iar sperma a fost prelevată la 23 de zile după ultimul tratament cu epirubicină. O doză totală de 12 mg/kg de epirubicină aplicată pe întreaga profază a meiozei a crescut semnificativ frecvența spermatozoizilor disomici și diploizi, în timp ce o doză totală de 3 și 6 mg/kg de doxorubicină a fost negativă (Fig. 5). În schimb, o singură doză de 6 mg/kg de epirubicină aplicată spermatozoizilor în timpul MMI/MMII a dat un rezultat pozitiv (Fig. 4). Aceste date sugerează că stadiile anterioare ale profazei contribuie relativ mai puțin la aneuploidia indusă de epirubicină în celulele germinale masculine.

În studiul de față, s-a constatat că epirubicina a provocat creșteri notabile ale spermatozoizilor autodiploizi (XX88 și YY88). După tratamentul cu epirubicină, spermatozoizii autodiploizi rezultați din stoparea MMII au fost mai frecvenți decât spermatozoizii diploizi rezultați din stoparea în timpul MMI (XY88). Astfel, a doua diviziune meiotică a fost mai sensibilă la tratamentul cu epirubicină decât prima diviziune meiotică. Concluzia conform căreia a doua diviziune meiotică a fost mai sensibilă la tratamentul cu epirubicină decât prima diviziune meiotică este, de asemenea, susținută de frecvențele observate ale cromozomilor sexuali disomici. Spermatozoizii cu semnale de XX8 sau YY8 au fost mai frecvenți decât spermatozoizii cu semnale de XY8. Aceste observații confirmă faptul că testul FISH pe spermă pentru disomie sau diploidie este capabil să detecteze efectele induse în timpul ambelor diviziuni meiotice și să compare sensibilitatea ambelor diviziuni meiotice, așa cum s-a raportat anterior , .

În prezentul test FISH pe spermă, s-a constatat că cea mai mică doză pozitivă pentru a provoca spermatozoizi disomici sau diploizi a fost de 6 mg/kg de epirubicină. Cu toate acestea, studiile MN din măduva osoasă de șoarece au arătat că expunerea la 3 mg/kg de epirubicină a dus la o creștere semnificativă a MNPCE. Această observație sugerează că MN în măduva osoasă sunt induse la doze mai mici decât disomii sau diploidii în spermă. Prin urmare, măduva osoasă este cel mai sensibil țesut. Cu toate acestea, testele măsoară puncte finale diferite. Pierderea și ruperea cromozomilor se măsoară în testul MN, iar non-disjuncția este detectată în testul spermatozoizilor-FISH. Prin urmare, datele prezente confirmă paradigma generală de evaluare a pericolelor, care afirmă că un rezultat pozitiv al testului MN pe măduva osoasă este un indicator al potențialului genotoxic al unui compus în celulele germinale. Cu toate acestea, cuantificarea aneuploidiei în celulele germinale este importantă în scopul evaluării riscurilor.

Inhibitorii de ADN topoizomerază au o tendință clară de a provoca rupturi de ADN dublu-catenar, care au ca rezultat principal formarea de MN negative pentru centromeri . În mod similar, demonstrarea faptului că epirubicina este un inhibitor eficient al topoizomerazei II sugerează că epirubicina își produce efectele clastogene prin acest mecanism. Metaboliții epirubicinei pot, de asemenea, să activeze celulele pentru a spori producția intracelulară de specii reactive de oxigen, ale căror forme stabile și difuzabile pot deteriora ADN-ul nuclear . În cazul în care mecanismele celulare de reparare sunt suprasolicitate, leziunile primare ale ADN-ului pot duce la aberații cromozomiale structurale sau numerice și, în cele din urmă, pot provoca tumori . Această sugestie este susținută de faptul că indivizii care au dezvoltat un al doilea neoplasm malign după tratamentul pentru un prim neoplasm malign au avut o capacitate mai scăzută de reparare a rupturilor de dublu catenar al ADN decât cei care nu au dezvoltat un al doilea neoplasm malign, măsurată prin intensitatea γH2AX . Inducerea MN centromerice-pozitive de către epirubicină indică faptul că ar putea exista un alt mecanism prin care epirubicina își induce efectul genotoxic. Această observație subliniază importanța utilizării modificării FISH a testului MN pentru determinarea originii MN induse. Mecanismul potențial prin care epirubicina își poate exercita efectul aneugenic este prin inhibarea topoizomerazei II, care poate duce la o segregare greșită a cromozomilor în timpul diviziunii celulare. Acest lucru se întâmplă deoarece ADN topoizomeraza II este necesară pentru separarea corectă a cromatidelor surori în timpul diviziunilor celulare, în absența acesteia având loc atât non-disjuncția, cât și ruperea, , . Astfel, epirubicina poate fi capabilă să inhibe două roluri cheie ale topoizomerazei II; capacitatea sa de a segregarea corectă a cromozomilor nou replicați, precum și funcția sa de relegare a rupturilor tranzitorii de ADN dublu catenar.

În concluzie, prin utilizarea testului FISH cu o sondă de ADN centromeric pentru eritrocitele MN, s-a demonstrat că epirubicina nu este doar clastogenă, ci și aneugenică în celulele somatice in vivo. Prin utilizarea testului de încorporare a BrdU, s-a demonstrat că întârzierea meiotică cauzată de epirubicină a fost de aproximativ 48 de ore. Cu ajutorul analizei FISH a spermatozoizilor, s-a demonstrat că epirubicina induce aneuploidii în timpul meiozei care au ca rezultat spermatozoizi disomici, precum și oprirea meiotică completă care creează spermatozoizi diploizi. Prevalența spermatozoizilor autodiploizi (XX88, YY88) și disomici (XX8 sau YY8) indică faptul că a doua diviziune meiotică este mai sensibilă la epirubicină decât prima diviziune meiotică. Rezultatele sugerează, de asemenea, că etapele anterioare ale profazei contribuie relativ mai puțin la aneuploidia indusă de epirubicină. Atât potențialul clastogenic, cât și cel aneugenic al epirubicinei pot da naștere la apariția unor tumori secundare și la rezultate reproductive anormale la pacienții cu cancer și la personalul medical care se expun la regimuri medicamentoase care includ epirubicina. Deși epirubicina are o toxicitate sistemică și cardiacă mai mică decât doxorubicina și alte antracicline cu un spectru echivalent de acțiune antitumorală , aceasta are efecte aneuploidogene și citotoxice în celulele nontumorale. Acest efect aneuploidogenic al medicamentului poate fi responsabil pentru apariția unor rezultate reproductive anormale și a unor tumori secundare, care sunt observate la unii pacienți cu cancer la un moment dat după tratamentul cu succes al cancerelor lor primare cu chimioterapie care conține epirubicină.

.