Precipitarea PEG: A Powerful Tool for Monoclonal Antibody Purification

S-a demonstrat că metoda de captare a peleților are un impact semnificativ asupra purității produsului redisolvat. Etapa de precipitare este ușor scalabilă și se potrivește unui proces în aval complet de unică folosință.

Percivia LLC

Eforturile sunt în curs de desfășurare pentru a identifica alternative la cromatografia în pat compact pentru a reduce timpul și costurile de procesare a fluxurilor de produse cu titru ridicat. Deși multe eforturi se concentrează pe adsorbanți cu membrană care înlocuiesc direct coloanele de aceeași compoziție chimică sau de compoziții chimice similare, unele tehnologii mai vechi încep să câștige teren în producția de proteine recombinate. O alternativă atractivă la cromatografie este precipitarea, care este utilizată de mulți ani în industria proteinelor plasmatice.1 O metodă simplă de precipitare implică titrarea fluidului de proces până la punctul izoelectric al proteinei care urmează să fie precipitată.2 Sărurile liotrope, cum ar fi sulfatul de amoniu, au, de asemenea, un istoric îndelungat de utilizare în procesele de precipitare.3 Acizii grași cu lanț scurt, cum ar fi acidul caprilic, sunt bine cunoscuți pentru capacitatea lor de a precipita ADN-ul și proteinele celulei gazdă (HCP).4 Speciile polionice sunt, de asemenea, precipitanți utili pentru captarea unui produs de interes sau pentru eliminarea proteinelor contaminante.5,6

Polietilenglicolul (PEG) a fost utilizat pentru precipitarea produsului și a impurităților.7,8 De asemenea, acesta poate fi combinat cu precipitarea izoelectrică pentru a îmbunătăți eficiența separării.9,10 După precipitare, se poate utiliza centrifugarea sau filtrarea pentru a realiza separarea solid-lichid.11 Deși centrifugarea este o metodă bine stabilită pentru a realiza această separare, spălarea peletului de produs pentru a elimina impuritățile ar putea fi problematică și nu este potrivită pentru un proces de unică folosință. Filtrarea – cu flux normal sau tangențial – necesită mai multă dezvoltare, dar spălarea peletului este mai simplă și se poate adapta ușor la un proces de unică folosință.

În lucrarea de față, a fost dezvoltată o etapă de precipitare a produsului folosind PEG pentru a recupera un anticorp monoclonal (MAb) din mediile de cultură celulară PER.C6 clarificate. Condițiile adecvate de precipitare au fost identificate prin utilizarea unor planuri experimentale factoriale complete. Au fost evaluate două etape de filtrare pentru captarea și spălarea produsului precipitat, iar metoda superioară a fost extinsă de 10 ori. Procesul de precipitare totală a dus la randamente de aproximativ 90 % și la o reducere a HCP de 1 LRV, fără o creștere semnificativă a nivelului de agregate al MAb-ului redisolvat. În cele din urmă, a fost investigat impactul etapei de precipitare asupra etapei ulterioare de captare prin schimb cationic (CEX).

Materiale și metode Reactivi

Sărurile de calitate USP, Tween 20, acidul clorhidric, acidul acetic și hidroxidul de sodiu au fost achiziționate de la JT Baker (Phillipsburg, NJ). PEG a fost de calitate reactiv și a fost achiziționat de la JT Baker sau EMD Chemicals (Gibbstown, NJ). Toate tampoanele au fost preparate folosind apă de calitate MilliQ (Millipore, Billerica, MA) și au fost filtrate prin filtrare de 0,22 μm înainte de utilizare.

Feedstock

Un MAb uman (IgG1, pI = 8,3, 150 kDa) a fost produs la Percivia, LLC folosind o linie celulară PER.C6. Celulele PER.C6 sunt celule retiniene embrionare umane imortalizate prin gena E1 a adenovirusului, așa cum este descris în brevetul american 5,994,128.12 Celulele au fost cultivate într-un proces standard de tip fed-batch sau în procesul XD, ambele folosind medii definite chimic.13,14 Mediile fed-batch au fost clarificate prin sedimentare și filtrare în profunzime, iar mediile XD au fost clarificate prin metoda de sedimentare celulară îmbunătățită (ECS) urmată de filtrare în profunzime.15 În timpul ECS, s-a utilizat rășina Silica-PEI pentru a îmbunătăți sedimentarea celulelor și, de asemenea, pentru a reduce ADN și HCP.

Optimizarea condițiilor de precipitare

Condițiile utilizate pentru precipitarea MAb – greutatea moleculară a PEG, concentrația de PEG și pH – au fost optimizate prin planuri experimentale factoriale complete utilizând software-ul Minitab (State College, PA). pH-ul mediului XD clarificat a fost ajustat la nivelul dorit cu 2-M Tris într-un tub conic de 15 ml. PEG a fost adăugat sub formă de soluție stoc de 40% (g/g) până la concentrația finală dorită. Tubul a fost apoi centrifugat la 1.000 g, iar supernatantul a fost decantat. În cele din urmă, peletul a fost redisolvat în soluție salină tamponată cu fosfat (PBS).

Capturarea peletelor prin filtrare în profunzime sau microfiltrare

Filtrarea în profunzime a fost realizată cu diferite grade de medii de filtrare. Millistak+HC D0HC, C0HC și X0HC au fost achiziționate de la Millipore Corp. (Billerica, MA), iar ZetaPlus 60SP02A a fost achiziționat de la Cuno (Meriden, CT). Precipitarea a fost efectuată folosind o soluție stoc de PEG-3350 de 40% (p/p), iar mediul precipitat a fost încărcat la un flux de alimentare de 50 L/m2 /h până când tot materialul a fost încărcat sau până când presiunea transmembranară (TMP) a fost de 15 psid. Filtrele au fost apoi spălate cu 20-30 L/m2 de 20 mM Tris pH 8,5 + 14,4% (g/g) PEG-3350. După spălare, 80 L/m2 de soluție tampon de resolubilizare au fost trecute prin filtre la 100 L/m2 /h, iar permeatul a fost recirculat prin dispozitiv la 600 L/m2 /h până când A280 din fondul de permeat a fost stabil, indicând dizolvarea completă a MAb. În cele din urmă, orice produs reținut a fost recuperat cu o spălare cu soluție tampon de 20 L / m2 și cu ventilarea modulului de filtrare. În unele teste, mediul de filtrare a fost spălat ulterior cu acetat 85-mM pH 5,3 urmat de 1-M NaCl. Datele privind presiunea și debitul au fost colectate cu ajutorul unui sistem special conceput de ARC Technology Services (Nashua, NH).

Microfiltrarea a fost realizată cu o membrană din fibre goale de 0,22 µm de la GE Healthcare Life Sciences (Piscataway, NJ). PEG-3350 a fost adăugat sub formă de soluție stoc de 40% (p/p) pentru experimentul la scară mică și sub formă de pulbere pentru lucrările de extindere. Fluxul de alimentare a fost de 710 L/m2 /h, iar retentatul și permeatul au fost nerestricționate. Precipitatul a fost mai întâi concentrat de 10 până la 14 ori și apoi spălat cu trei volume de diafiltrare de 20 mM Tris pH 8,5 plus 14,4% (g/g) PEG-3350. În cele din urmă, precipitatul a fost dizolvat din nou în 85 mM acetat de sodiu pH 5,3 sau 20 mM Tris plus 50 mM NaCl pH 7,5. Datele privind presiunea, debitul și conductivitatea au fost colectate cu ajutorul unui sistem de bancă Slice 200 (Sartorius, Gottingen, Germania) pentru testarea la scară mică și a unui sistem SciPro (SciLog, Middleton, WI) pentru experimentul de extindere.

Cromatografie de schimb cationic

Toyopearl GigaCap S-650 a fost procurat de la Tosoh Bioscience (Montgomeryville, PA) în format Toyoscreen de 5 ml. Această rășină a fost demonstrată anterior ca fiind o etapă de captare de mare capacitate pentru MAbs.16 Coloana a fost echilibrată cu acetat de sodiu 74-mM pH 5,3 și încărcată cu 90-95 mg-MAb/mL de rășină folosind fie mediu clarificat, fie material clarificat și tratat cu PEG, fiecare fiind ajustat la același pH și conductivitate ca și tamponul de echilibrare. Coloana a fost apoi spălată cu tampon de echilibrare, iar anticorpul a fost eluat cu 50 mM acetat de sodiu pH 5,3 plus 90 mM NaCl.

Tehnici analitice

Concentrația de MAb în probele care conțin mediu a fost determinată prin HPLC analitic cu proteină A (Applied Biosystems, Foster City, CA). Nivelurile de agregate au fost măsurate prin cromatografie de excludere a dimensiunilor (SEC) utilizând o coloană TSKgel G3000SWXL de la Tosoh Bioscience (Montgomeryville, PA), cu detectarea vârfurilor prin absorbție UV la 280 nm. Nivelurile de HCP au fost cuantificate cu ajutorul unui ELISA specific PER.C6 de la Cygnus Technologies (Southport, NC). SDS-PAGE a fost realizat cu geluri NuPAGE 4-12% Bis-Tris și colorarea a fost efectuată cu SimplyBlue SafeStain, ambele de la Invitrogen (Carlsbad, CA).

Rezultate și discuții Condiții de precipitare

Pentru ambele greutăți moleculare de PEG, 3.350 și 6.000 Da, concentrația de PEG a fost factorul dominant în recuperarea și puritatea MAb-ului redisolvat. Precipitarea cu PEG-3350 a dus la cea mai mare recuperare (figura 1). Cu toate acestea, recuperarea mai mare a venit în detrimentul unei încărcături mai mari de HCP în MAb redisolvat. În cazul MAb-ului agregat, nivelurile nu au fost semnificativ diferite față de materialul de plecare, dar trebuie remarcat faptul că MAb-ul special utilizat în această lucrare nu este predispus la formarea de agregate. Îmbunătățirea reducerii HCP prin utilizarea de PEG-6000 a fost compensată de reducerea randamentului produsului. Condiția finală selectată a fost de 14% (p/v) de PEG-3350 (echivalent cu 14,4% p/p) și pH 8,5.

Figura 1

Capturarea peleților prin filtrare în profunzime

În primul experiment, mediul XD clarificat cu ECS a fost precipitat și peleții au fost capturați prin filtrare în profunzime cu mediul X0HC. Nu s-a observat nicio creștere substanțială a presiunii transmembranare (TMP) în timpul încărcării cu 361 g-MAb/m2 (datele nu sunt prezentate). După spălare, rezolubilizarea peletului imobilizat a fost realizată cu acetat 85 mM pH 5,3. Chiar și după recircularea timp de 2 h, anticorpul nu s-a redisolvat complet, astfel încât s-a adăugat 0,1% v/v Tween 20 în tamponul de resolubilizare. După încă 30 min de resolubilizare, MAb a fost complet dizolvat.

Tabelul 1. Randamentul și eliminarea impurităților pentru operația de precipitare cu PEG utilizând filtrarea în profunzime cu X0HC pentru recuperarea produsului

Datele privind balanța de masă sunt rezumate în tabelul 1. Reducerea HCP a fost mai mică decât în experimentul anterior (figura 1), în care doar 5.000 ppm de HCP se aflau în piscina finală, față de 8.300 ppm în acest experiment. Cu toate acestea, se știe că unele filtre de adâncime au caracteristici de adsorbție hidrofobe și de schimb anionic (AEX).17 Mediul precipitat a fost încărcat la un pH relativ ridicat (8,5) și o conductivitate scăzută (<10 mS/cm), ceea ce ar fi putut induce legarea proteinelor acide pe o matrice AEX. Mai mult, s-a demonstrat că, în prezența PEG, capacitatea de legare a proteinelor din matricile schimbătoare de ioni crește.18,19 Prin urmare, este probabil ca unele dintre HCP care au rămas în soluție după precipitare să se lege de mediul de filtrare în profunzime și să fie eluate în produs în timpul resolubilizării. Această ipoteză este, de asemenea, susținută de diferența dintre conținutul de HCP din supernatantul de precipitare și fluxul de filtrare în profunzime (9 900 față de 240 mg), care indică eliminarea HCP din soluție de către filtrul de profunzime. În urma imobilizării anticorpului pe filtrul de adâncime, acesta a fost redisolvat la un pH semnificativ mai mic (5,3), ceea ce a dus la eluția HCP legate și la reducerea purității produsului final. Acest fenomen ar putea fi atenuat prin utilizarea unor medii de filtrare în profunzime mai puțin adsorbante, cum ar fi Millistak+HC D0HC/C0HC și filtrele ZetaPlus SP, cum ar fi 60SP02A, sau prin redisolvarea produsului într-un tampon cu conținut scăzut de sare și cu pH mai ridicat, cum ar fi Tris 20-mM pH 7,5.

Figura 2

Aceste strategii au fost testate prin încărcarea mediilor precipitate de tip fed-batch pe filtrele D0HC, C0HC, X0HC și 60SP02A. Toate filtrele au fost spălate în mod identic cu tamponul PEG/Tris, dar rezolubilizarea s-a făcut cu 20 mM Tris pH 7,5 plus Tween 20 pentru filtrele Millipore și 85 mM acetat pH 5,3 plus Tween 20 pentru filtrul Cuno. Filtrele Millipore au fost, de asemenea, decapate cu un tampon cu pH scăzut (85 mM acetat pH 5,3) și sare mare (1 M NaCl) după ce produsul a fost recuperat pentru a determina dacă orice HCP legat poate fi eluat. Figura 2 arată că toate filtrele testate au fost puternic murdărite. Deoarece mediul de hrănire discontinuă nu a fost clarificat prin metoda ECS, care s-a demonstrat că reduce semnificativ nivelurile de ADN în recoltele XD, este posibil să fie prezent mai mult ADN, care precipită în concentrații ridicate de PEG.20 Conținutul mai mare de ADN din precipitat poate fi redus capacitățile de filtrare, dar acest lucru nu a fost investigat. Tabelul 2 arată că fiecare dintre experimente a dus la o reducere mai bună a HCP (84-88 % față de 46 %) și, chiar dacă încărcătura inițială de HCP a fost mai mare (49 000 ppm față de 13 000 ppm), bazinele de MAb redisolvate au avut, în general, conținuturi mai mici de HCP (6 000-7 800 ppm față de 8 300 ppm). Utilizarea filtrelor cu absorbție redusă și redisolvarea într-un tampon cu pH mai ridicat par să rezolve problema HCP care se eluează din mediul de filtrare de adâncime. Analiza SDS-PAGE a fracțiunilor de benzi a arătat că atât HCP, cât și produsul au fost legați de filtre – inclusiv de filtrele D0HC și C0HC mai puțin adsorbante – și a confirmat faptul că mediile X0HC erau mai adsorbante decât mediile D0HC și C0HC (figura 3).

Tabelul 2. Randamentul și eliminarea impurităților pentru operația de precipitare cu PEG utilizând filtrarea în profunzime cu diferite medii de filtrare pentru recuperarea produsului

Capturarea granulelor prin microfiltrare

Deși încărcătura de HCP a MAb-ului redisolvat a fost redusă prin utilizarea unui tampon cu un pH mai ridicat și a unor medii de filtrare în profunzime mai puțin adsorbante, capacitățile filtrelor în profunzime au fost scăzute pentru mediile de tip fed-batch (<400 g-MAb/m2 ). Microfiltrarea (filtrare cu flux tangențial, MF TFF) a fost testată cu scopul de a îmbunătăți capacitatea, cu avantajul suplimentar de a putea utiliza orice tampon pentru resolubilizare datorită caracteristicii de legare scăzută a fibrei goale. Performanța hidraulică a concentrației MF TFF și a spălării precipitatului din lotul alimentat este prezentată în figura 4. Fluxul de permeat a fost de aproximativ 100 L/m2 /h, iar TMP a fost cuprins între 1,0 și 2,5 psid pentru întreaga operațiune. Încărcarea masică de 475 g-MAb/m2 a fost mai bună decât cea obținută în oricare dintre operațiunile de filtrare în profunzime. Recuperarea produsului și reducerea HCP au fost ambele de aproximativ 90 %, ușor mai bune decât cele obținute în filtrarea în profunzime (tabelul 3).

Figura 3

Rezolubilizarea a fost mult mai simplă și mai rapidă decât în cazul filtrării în profunzime; mai degrabă decât recircularea tamponului prin dispozitiv, tamponul a fost pompat prin interiorul lumenurilor în vasul de retentat cu permeatul închis și s-a lăsat să se amestece timp de aproximativ 60 min. Acest lucru a fost suficient pentru a redisolva anticorpul și nu a fost nevoie de excipienți. Din cauza dificultății de rezolubilizare prin filtrare în profunzime, produsul a fost redisolvat la sau aproape de concentrația din mediul de alimentare. Bazinul final rezultat în urma procesului MF TFF a fost de aproape două ori mai concentrat decât materialul de plecare.

Figura 4

Pentru că retentatul și permeatul au fost deschise la presiunea atmosferică, a fost necesară o instrumentație minimă: o pompă de flux încrucișat, un senzor de presiune și o pompă de transfer pentru diafiltrare. Combinația dintre capacitatea ridicată, recuperarea ridicată și clearance-ul HCP, precum și simplitatea operațională fac din MF TFF o opțiune preferabilă pentru captarea peleților în comparație cu filtrarea în profunzime. Etapa de precipitare și MF TFF a fost extinsă de 10 ori la un dispozitiv cu fibre goale de 0,12 m2 , iar performanța a fost comparabilă cu cea de la scară mică (tabelul 4).

Tabelul 3. Randamentul și eliminarea impurităților pentru operațiunea de precipitare cu PEG utilizând microfiltrarea pentru recuperarea produsului la scară de banc

Cromatografie de schimb cationic

Cromatografia de schimb cationic (CEX) de mare capacitate a fost evaluată cu furaje pretratate cu sau fără precipitare cu PEG. Etapa de precipitare nu a avut niciun impact semnificativ asupra randamentului etapei sau asupra procentului de reducere a HCP, dar eluatul rezultat din materialul de încărcare precipitat a avut de șapte ori mai puține HCP (tabelul 5).

Tabel 4. Randamentul și eliminarea impurităților pentru operația de precipitare PEG folosind microfiltrarea pentru recuperarea produsului la scară pilot

Concluzii

Precipitarea a fost folosită de mult timp în industria proteinelor plasmatice pentru a purifica proteinele la scară mare. Tehnica a fost adaptată aici la purificarea inițială a MAb din medii clarificate de tip fed-batch și XD într-o manieră scalabilă. Au fost dezvoltate două etape de filtrare de unică folosință pentru a capta și spăla produsul precipitat, eliminând necesitatea centrifugării. S-a demonstrat că operațiunea de precipitare nu a afectat în mod negativ randamentul etapei de captare CEX și a redus conținutul de HCP al eluatului de șapte ori.

Tabelul 5. Randamentul și eliminarea HCP pentru GigaCap S-650 încărcat cu anticorpi precipitați (+PEG) și neprecipitați (âPEG)

Capacitatea de a reduce încărcătura de impurități atât de mult în amonte în procesul de purificare este esențială pentru trunchierea procesului din aval sau pentru înlocuirea cromatografiei tradiționale cu alte tehnologii de unică folosință. O încărcătură mai mică de impurități poate îmbunătăți capacitatea de încărcare a adsorbanților cu membrană de curgere și, eventual, a filtrelor de virus, care sunt, în general, elemente foarte costisitoare într-un proces.

Un beneficiu suplimentar este capacitatea de a redisolva anticorpul într-un tampon care facilitează operația unitară ulterioară. De exemplu, mediile de cultură celulară necesită de obicei o titrare și o diluție extinsă sau o etapă UF-DF pentru a fi pregătite pentru cromatografia de captare cu un schimbător de cationi. Aici, anticorpul precipitat poate fi dizolvat în tamponul de echilibrare la o concentrație ridicată, scurtând astfel timpul de procesare. Acest lucru poate fi important pentru produsele care nu tolerează o expunere îndelungată la condiții de pH/conductivitate scăzută. În cazul acestui anticorp particular, mediul clarificat necesită o diluție de peste două ori pentru a fi încărcat pe o coloană CEX, în timp ce MAb-ul redisolvat ar putea fi încărcat direct la o concentrație de aproape două ori mai mare decât cea a mediului neajustat. Aceasta reprezintă o reducere de cel puțin patru ori a volumului de încărcare, ceea ce poate duce la economii substanțiale de timp pentru rășinile CEX moderne, de mare capacitate.

Recunoștințe

Autorii ar dori să mulțumească departamentului de proteine și științe analitice de la Percivia pentru suportul de testare în această lucrare și grupului de dezvoltare a proceselor în amonte de la Percivia pentru furnizarea mediilor de cultură celulară.

Nota privind mărcile comerciale

PER.C6 este o marcă înregistrată a Crucell Holland BV Corporation; XD este o marcă înregistrată a DSM NV; și ECS este o marcă înregistrată a DSM NV. Toate celelalte nume de mărci sunt mărci comerciale ale proprietarilor lor respectivi.

MICHAEL KUCZEWSKI este cercetător științific I, EMILY SCHIRMER, doctor în științe, este cercetător științific II, BLANCA LAIN, doctor în științe, este cercetător senior, iar GREGORY ZARBIS-PAPASTOITSIS, doctor în științe, este director senior, toți la Downstream Process Development, Percivia LLC, Cambridge, MA, 617. 301.8821, [email protected]@percivia.com

1. Cohn EJ, Strong LE, Strong LE, Hughes WL, Mulford DJ, Ashworth JN, Melin M, et al. Preparation and properties of serum and plasma proteins. IV. Un sistem pentru separarea în fracțiuni a componentelor proteice și lipoproteice din țesuturile și fluidele biologice. J Amer Chem Soc. 1946;68(3):459-75.

2. Van der Wielen L, Hofland G, Ottens M, Gulobovic M, Witkam G-J. Fabricarea structurilor pe bază de proteine folosind un acid volatil. În: 224th National Meeting of the American Chemical Society. Boston, MA; 2002.

3. Habeeb A, Francis R. Preparation of human immunoglobulin by ammonium sulfate precipitation. Vox Sanguinis. 1976;31:423-34.

4. Wang J, Diehl T, Diehl T, Aguiar D, Dai X-P, Arunakumari A. Precipitarea impurităților derivate din proces în schemele de purificare non-proteică A pentru anticorpi. BioPharm Int. 2009 Oct suppl, Downstream Processing 2010: Embracing Innovation;4-10.

5. McDonald P, Victa C, Carter-Franklin JN, Fahrner R. Selective antibody precipitation using polyelectrolytes: O nouă abordare pentru purificarea anticorpilor monoclonali. Biotechnol Bioeng. 2009;102(4):1141-51.

6. Moya W, Jaber J, Moya W, inventatori; Millipore Corp, cesionar. Purificarea proteinelor. Brevetul Statelor Unite US WO/2008/079280. 2006.

7. Polson A, inventator; South African Inventions Development Corporation, cesionar. Fracționarea amestecurilor de substanțe proteice utilizând polietilenglicol. Brevetul Statelor Unite ale Americii US 3415804. 1968.

8. Giese G. Precipitarea cu polietilenglicol a anticorpilor monoclonali și impactul asupra cromatografiei pe coloană. În: In: BioProcess Int. Raleigh, NC; 2009.

9. Thrash S, Otto J, Deits T. Effect of divalent ions on protein precipitation with polyethylene glycol: mechanism of action and applications. Exprimarea și purificarea proteinelor. 1991;2(1):83-9.

10. Ramanan S, Stenson R, Ramanan S, inventatori; Amgen, cesionar. Metodă de izolare a anticorpilor prin precipitare. Brevetul Statelor Unite US 2008/0214795 A1. 2008 2/13/08.

11. Venkiteshwaran A, Heider P, Teysseyre L, Belfort G. Recuperarea selectivă, asistată de precipitare, a imunoglobulinelor din serul bovin utilizând microfiltrarea cu membrană cu flux încrucișat cu murdărire controlată. Biotechnol Bioeng. 2008;101(5):957-66.

12. Fallaux FJ, Hoeben RC, Eb AJvd, Bout A, Valerio D, Fallaux FJ, Hoeben RC, inventatori; IntroGene B.V, cesionar. Sisteme de ambalare pentru adenovirusuri recombinante umane destinate utilizării în terapia genică. Brevetul Statelor Unite US 5994128. 1997.

13. Golden K, Bragg C, Chon J. Procesul XD: dezvoltarea unui proces cu titru ridicat pentru celulele PER.C6. În: A 21-a reuniune a Societății Europene de Tehnologie Celulară Animală. Dublin, Irlanda; 2009.

14. Chon J. Progrese în procesele de producție cu platformă de captură hrănită și XD utilizând linia celulară umană PER.C6. Conferința Wilbio Waterside; 2009 Apr 20-22; South San Francisco, CA.

15. Schirmer EB, Kuczewski M, Golden K, Lain B, Bragg C, Chon J, et al. Clarificarea primară a recoltelor de culturi celulare de densitate extremă prin sedimentarea îmbunătățită a celulelor. Bioprocess Int. 2010;8(1):32-9.

16. Lain B, Cacciuttolo MA, Zarbis-Papastoitsis G. Development of a High-Capacity MAb Capture Step Based on Cation-Exchange Chromatography. Bioprocess Int. 2009;7(5):26-34.

17. Yigzaw Y, Piper R, Tran M, Shukla AA. Exploatarea proprietăților adsorbante ale filtrelor de adâncime pentru eliminarea proteinelor din celulele gazdă în timpul purificării anticorpilor monoclonali. Biotechnol Prog. 2006;22:288-96.

18. 19. Milby KH, Ho SV, Henis JMS. Cromatografia schimbătoare de ioni a proteinelor: efectul polimerilor neutri din faza mobilă. J Chromatogr. 1989;482:133-44.

19. Gagnon P, Godfrey B, Ladd D. Method for obtaining unique selectivities in ion-exchange chromatography by addition of organic polymers to the mobile phase. J Chromatogr A. 1996;743:51-5.

20. Paithankar KR, Prasad KS. Precipitarea ADN-ului de către polietilenglicol și etanol. Nucleic Acids Research.1991;19(6):1346.