Precipitarea proteinelor cu sulfat de amoniu: The key to Salting-Out

Precipitarea cu sare poate fi un instrument foarte puternic pentru purificarea proteinelor prin precipitare. Sulfatul de amoniu este de obicei sarea aleasă, deoarece este ieftină, foarte solubilă în apă și este capabilă să devină mult mai hidratată (interacționează cu mai multe molecule de apă) decât aproape orice alt solvent ionic. În practică, sulfatul de amoniu este fie adăugat direct sub formă solidă, fie adăugat sub formă de soluție (de obicei) saturată pentru a precipita proteinele dorite.

La concentrații scăzute de sare (<0,15M), adăugarea unei cantități mai mari de sare tinde, în general, să crească solubilitatea proteinelor, deoarece ionii protejează moleculele proteice de sarcinile altor molecule; această tendință este denumită „sărare”. La un moment dat, forța ionică devine prea mare și începe să aibă un efect negativ asupra solubilității proteinelor, ceea ce se numește „salting-out”. Acest lucru se întâmplă deoarece sarea dizolvată concurează cu proteinele pentru moleculele rare de apă, crescând tensiunea superficială a apei și, prin urmare, determinând proteina să se plieze mai strâns. Reducerea suprafeței proteinelor înseamnă mai puține interacțiuni proteină-apă, ceea ce permite mai multe interacțiuni hidrofobe între moleculele proteice, provocând agregarea și, ulterior, precipitarea.

Proteinele în soluție pot fi, de asemenea, fracționate, deoarece acestea vor precipita în funcție de concentrația de sare. În acest fel, este posibilă purificarea unor proteine specifice prin adăugarea unei cantități specifice de sulfat de amoniu pentru a precipita proteinele nedorite, recuperarea supernatantului și apoi adăugarea unui pic mai mult sulfat de amoniu pentru a precipita proteina dorită și apoi salvarea acelui pelete de proteină precipitată. Deoarece precipitarea cu sare afectează doar solubilitatea proteinelor și nu le denaturează, fracția recuperată poate fi depozitată în soluția de sare pentru perioade îndelungate de timp, fără a trebui să ne facem griji cu privire la contaminarea bacteriană, deoarece conținutul ridicat de sare inhibă orice creștere microbiană sau activitate a proteazei.

Pentru că precipitarea cu sulfat de amoniu reduce doar solubilitatea proteinelor și nu le denaturează, proteinele pot fi concentrate prin îndepărtarea soluției de sulfat de amoniu rămase, apoi peletul de proteine poate fi solubilizat în soluții tampon standard sau într-o concentrație mai mică de sulfat de amoniu. Cromatografia de interacțiune hidrofobă sau cromatografia de filtrare pe gel pot fi apoi folosite pentru a purifica în continuare soluția de proteine. Sulfatul de amoniu poate fi, de asemenea, utilizat pentru a ghida unele proteine desfășurate de denaturanți, cum ar fi ureea, înapoi la conformația lor nativă adecvată prin creșterea treptată a concentrației de sulfat de amoniu.

Există câteva bune practici care ar trebui luate în considerare atunci când se lucrează cu sulfat de amoniu, cum ar fi:

• Utilizați un mortar și un pisălog pentru a sparge aglomerările și pentru a măcina în alt mod sulfatul de amoniu pentru a facilita adăugarea și dizolvarea.
• Adaugați doar o cantitate mică de sulfat de amoniu la un moment dat, așteptați să se dizolve și amestecați ușor pentru a evita formarea de spumă.
• Utilizați un tampon cum ar fi 50 mM HEPES sau Tris pentru a minimiza natura acidifiantă a sulfatului de amoniu.
• Utilizați sulfat de amoniu de calitate analitică, deoarece calitățile inferioare prezintă de obicei contaminare cu metale grele.

Procesul de precipitare a sării vine cu unele dezavantaje. Sărarea proteinelor necesită o cunoaștere prealabilă a solubilității proteinei. În plus, orice contaminanți prezenți în proba inițială pot fi încă prezenți în fracția care conține proteina de interes; acest proces concentrează proteina, dar nu o purifică. Mai mult, poate fi necesară eliminarea sării din proba de proteină, astfel încât va fi necesară o prelucrare ulterioară sub formă de dializă sau cromatografie.

Posturi conexe pe blog

• Ce tehnici de precipitare a proteinelor sunt utilizate pentru concentrare și curățare?
• Tehnici de extracție a proteinelor vegetale și tehnici de precipitare a proteinelor

.