Principalele cinci metode de marcare primară a anticorpilor

În orice aplicație care utilizează anticorpi pentru detectarea semnalului (de exemplu, Western blotting, ELISA, imunohistochimie sau FACS), există două abordări pentru marcarea anticorpilor: marcarea directă și cea indirectă. Western blotting-ul standard utilizează etichetarea indirectă deoarece se utilizează un anticorp primar pentru a detecta antigenul țintă, urmat de un anticorp secundar la care este atașată o moleculă de detecție.

În unele situații, poate fi mai bine să se sară peste anticorpul secundar și toate etapele asociate și să se eticheteze direct anticorpul primar. Cazurile care cer cu insistență etichetarea directă a anticorpului primar includ:

• Există o legare nespecifică a anticorpului secundar
• Utilizați anticorpi nespecifici.anticorpi primari de organisme standard – în acest caz poate fi dificil de găsit anticorpi secundari buni
• Când se face multiplexarea cu anticorpi care provin din aceeași specie
• Când trebuie să scurtați timpul experimental prin eliminarea incubării anticorpilor secundari și a etapelor de spălare asociate

Parametrii anticorpilor

Puteți marca anticorpul ales nu numai cu coloranți fluorescenți, ci și cu proteine fluorescente, enzime și particule colorate. Toate acestea sunt de obicei atașate prin intermediul unei grupări terminale de lizină, astfel încât trebuie să evitați tampoanele care conțin amine (de exemplu, Tris) și moleculele pe parcursul tuturor etapelor. În caz contrar, veți eticheta în cea mai mare parte moleculele de tampon! De asemenea, ar trebui să evitați conservantul tampon comun azidă de sodiu, deoarece va interfera cu reacția de marcare.

Anticorpul pentru marcare trebuie să fie la o concentrație nu mai mică de 0,5 mg/ml și >90% pur. Cu cât aveți mai puține proteine care interferează și molecule care conțin grupe amino în preparatul de anticorpi, cu atât reacția de marcare va fi mai eficientă. Dar chiar dacă anticorpul dumneavoastră înoată în glicină și BSA, puteți oricând să eliminați substanțele interferente prin dializă. De asemenea, puteți îmbunătăți puritatea anticorpului dvs. trecându-l printr-o coloană de proteină A sau puteți chiar să vă pregătiți propria coloană de purificare prin afinitate cu un antigen adecvat.

Principalele metode interne de marcare a anticorpilor

Metoda esterului NHS (succinimidil)

Această metodă este utilă pentru conjugarea anticorpilor cu coloranți fluorescenți disponibili pe scară largă, cum ar fi derivații de rodamină. Se realizează de obicei într-un tampon de fosfat cu separare ulterioară pe coloană de colorantul nelansat. Principalul dezavantaj este că esterii sunt instabili, deoarece sunt sensibili la umiditate. Anticorpul marcat trebuie utilizat imediat după terminarea reacției.

Metoda izotiocianatului

Puteți utiliza această metodă pentru a obține izotiocianat de fluoresceină (FITC), care este foarte popular în prepararea proteinelor fluorescente și a anticorpilor. Dacă ați lucrat cu microscopia fluorescentă, ați avut de-a face cu FITC. Analogii de izotiocianat ai diferiților coloranți standard sunt, de asemenea, disponibili.

Izotiocianatul este mai stabil decât NHS, dar este mai greu de fabricat și reacția de marcare va fi probabil mai puțin eficientă cu această metodă. Ca și în cazul NHS, excesul de colorant trebuie eliminat după reacție prin cromatografie.

Metoda carbodiimidelor

Compușii derivați din carbodiimide transformă grupările carboxil de pe proteine în intermediari reactivi care pot reacționa cu lizinele. Reactivitatea ridicată a carbodiimidelor înseamnă că acestea pot fi utilizate pentru a marca anticorpi cu materiale relativ inerte, cum ar fi particulele magnetice sau de aur. Cea mai frecvent utilizată carbodiimidă este EDC. Uneori se adaugă NHS la reacție pentru a ajuta la formarea unor intermediari relativ stabili.

Metoda este simplă, dar, la fel ca NHS, EDC este higroscopică, așa că va trebui să folosiți anticorpul imediat după etichetare.

Metoda cu doi etichete

În acest caz, vă marcați anticorpul cu o altă proteină care servește drept catalizator, de exemplu HRP sau fosfatază alcalină. Deoarece ambele molecule conțin numeroase grupe amino, reticulația directă (ca în cazul metodei NHS) ar duce la polimeri ai aceleiași molecule. Prin urmare, veți efectua legarea în două etape separate. Reticulați anticorpul cu molecula X și catalizatorul cu molecula Y. Trebuie să alegeți cu atenție X și Y, deoarece acestea trebuie să interacționeze pentru a forma conjugatul. De exemplu, ați putea alege maleimida ca X și un tiol ca Y.

În timp ce conjugatul rezultat va fi mai stabil decât cel pe care îl obțineți prin metoda NHS, această metodă va necesita de trei ori mai multă muncă; etape separate de etichetare și purificare pentru anticorp, catalizator și reacția de conjugare. Vestea bună este că puteți cumpăra molecula catalitică pre-etichetată și apoi să vă etichetați anticorpul în mod corespunzător.

Metoda Periodatului

Această metodă este utilă pentru generarea de conjugate HRP-anticorp specifice. Periodatul activează HRP prin crearea de molecule de aldehidă care interacționează cu reziduurile de lizină. HRP-ul în sine are doar câteva reziduuri de lizină, astfel încât polimerizarea enzimei nu reprezintă o preocupare semnificativă. Legăturile dintre HRP și anticorp sunt reversibile dacă nu sunt stabilizate prin adăugarea de cianohidridă de sodiu.

Aceasta a fost prezentarea mea a celor mai bune metode de marcare a anticorpilor făcute în casă. Există o mulțime de kituri comerciale pe piață cu o chimie de bază similară care vă pot face viața mult mai ușoară. Dacă laboratorul dvs. are banii necesari.

Aveți o altă metodă de marcare a anticorpilor pe care ați dori să o împărtășiți cu noi? Intrați în contact scriind în secțiunea de comentarii.

Literatură:

Meyer JP, Adumeau P, Lewis JS, Zeglis BM. Click Chemistry and Radiochemistry: The First 10 Years. Bioconjug Chem. (2016) 27(12):2791-2807. doi: 10.1021/acs.bioconjchem.6b00561. Epub 2016 Nov 22.