Rădăcina adventice
Metode de înrădăcinare a microradăcinilor
Dacă microradăcinile nu formează rădăcini în timpul etapei de înmulțire, acestea trebuie să primească tratamente speciale pentru a iniția și dezvolta un sistem radicular adventice. Micromițeii pot fi înrădăcinați in vitro și apoi aclimatizați în mediul ambiant, sau pot fi înrădăcinați ex vitro, combinând astfel înrădăcinarea și aclimatizarea.
Facilitatea și rata de succes a înrădăcinării determină metoda care se folosește la un anumit soi. Metoda cea mai eficientă din punct de vedere al costurilor este înrădăcinarea microrețetelor ex vitro. Înrădăcinarea ex vitro economisește un transfer in vitro suplimentar în mediul de înrădăcinare și accelerează aclimatizarea, făcând micropropagarea mai eficientă. Înrădăcinarea in vitro se utilizează în cazul în care lipsesc instalațiile de înrădăcinare ex vitro și de aclimatizare, dacă ratele de succes sunt scăzute cu înrădăcinarea ex vitro și la discreția managerului de laborator.
Înrădăcinare in vitro. Ingredientele din mediu și condițiile de incubare sunt ușor de modificat atunci când se utilizează condiții in vitro pentru a promova inițierea rădăcinilor și dezvoltarea timpurie. Formulele de săruri nutritive pot rămâne aceleași, pot fi schimbate sau reduse, adesea la macrosăruri de jumătate de concentrație, iar umiditatea relativă poate fi redusă prin utilizarea unor capace ventilate (figura 5). Condițiile de incubare a culturii de lumină și temperatură pot fi modificate pentru înrădăcinare. Mulți microrețete sunt incubate în întuneric pentru o perioadă pentru inițierea rădăcinilor și apoi sunt transferate în condiții de iluminare.
Figura 5. Banda chirurgicală microporoasă asigură ventilația acestui vas de lăstari care se înrădăcinează; acest lucru ajută la reducerea umidității relative și pregătește noile plante pentru mediul de seră.
Mediul nutritiv de înrădăcinare pe care se plasează micromăstarii proaspăt tăiați conține, în general, auxină. De obicei, se adaugă în mediu concentrații micromolare de IBA și/sau NAA înainte de autoclavare. Concentrația de auxină depinde de specie și de cultivar. Aceste informații sunt de obicei disponibile online folosind un motor de căutare științifică, cum ar fi Google Scholar http://scholar.google.com/. De obicei, numele plantei, cuvintele „vitro” și „root” (sau rădăcină adventice) în șirul de căutare vor oferi informații specifice. Dacă literatura de specialitate lipsește pentru o anumită plantă, folosiți rude apropiate în căutare pentru a determina cum au răspuns acestea.
Pentru că este recunoscut faptul că aceleași concentrații de auxină care stimulează inițierea rădăcinilor adventive pot inhiba dezvoltarea rădăcinilor, unii folosesc o abordare pe două medii. Atunci când microradăcini de Cotinus coggygria au fost pe un mediu care conținea 10 µM IBA timp de 5 zile înainte de a fi transferați pe un mediu fără auxină, 100% au înrădăcinat; în timp ce doar 40% au înrădăcinat în cazul unei culturi continue pe un mediu cu 10 µM IBA (Metivier et al., 2007). Padilla și Burgos (2010) au cultivat microrețete de măslin pe medii care conțineau până la 4 µM IBA timp de 2 săptămâni, urmate de transferul în mediu bazal fără auxină, care a dus la înrădăcinarea a 65-93%, în funcție de soi.
În unele cazuri, soluțiile de IBA au fost aplicate pe microrețete ca o baie bazală timp de un minut sau mai mult. Tsvetkov et al. (2007) au obținut cea mai bună înrădăcinare a micromițămintelor de Sorbus domestica atunci când acestea au fost scufundate într-o soluție de 14,8 µM IBA timp de 80 s înainte de a fi plasate pe mediul bazal.
Obscuritatea din timpul sau înainte de înrădăcinare poate crește succesul înrădăcinării și sincronizarea înrădăcinării între micromițăminte. Etiolarea, dezvoltarea lăstarilor fără lumină, va crește competența celulară pentru înrădăcinarea adventice (Murray et al., 1994). În cazul în care microrețetele de nuc au fost etiolate, înrădăcinarea a fost mai bună, cu o apariție mai rapidă a rădăcinilor decât din lăstarii verzi (Leslie et al., 2010); cu toate acestea, lăstarii etiolați au fost fragili și au necesitat o manipulare mai atentă.
Cultivarea microrețetelor verzi pe mediu de înrădăcinare în întuneric pentru o perioadă relativ scurtă poate spori considerabil înrădăcinarea. O perioadă de întuneric timp de 4-7 zile pe un mediu Murashige și Skoog de jumătate de concentrație care conține 1 µM de floroglucinol și 1,4 µM de IBA, urmată de incubarea în condiții de lumină, a dus la o înrădăcinare mai bună a micromușilor de măr „Delicious” decât dacă sunt cultivați numai la lumină sau în întuneric pentru perioade mai lungi (Zimmerman, 1984). Atunci când se cultivă microrețete de portaltoi de măr „MM106” pe mediu cu 4 µM IBA în întuneric timp de 0-10 zile, s-a descoperit, prin investigații histologice, că inducerea rădăcinilor a avut loc în primele 3 zile sau mai puțin în întuneric și că primordiile rădăcinilor conice erau vizibile în ziua 7 (Naija et al., 2008). Sincronizarea tratamentului în întuneric este critică și poate fi necesar să fie determinată pentru fiecare cultură sau genotip; cu toate acestea, poate spori considerabil succesul înrădăcinării.
Câteva specii înrădăcinează cel mai bine dacă vârfurile microstructurilor sunt luminate, iar porțiunea bazală din mediu se află în întuneric, similar cu modul în care sunt înrădăcinați macroaltoi într-un mediu de seră sub ceață. Întunecarea mediului se poate realiza prin vopsirea în negru a exteriorului vaselor de cultură până puțin deasupra nivelului mediului și acoperirea mediului cu granule sterile de policarbonat sau cu o altă substanță care exclude lumina sau prin întunecarea mediului însuși prin adăugarea de cărbune activat. Uneori, pentru înrădăcinarea in vitro se folosește un mediu de seră, cum ar fi vermiculita, care, de asemenea, exclude lumina, după ce a fost umezit cu mediul nutritiv.
S-a demonstrat că întunecarea doar a bazelor microstructurilor a crescut înrădăcinarea migdalului, piersicului și măslinului (Rugini, 1988) și a mărului (Mencuccini și Rugini, 1993) în comparație cu martorii incubați fie în întuneric, fie sub lumină. Cu toate acestea, într-un studiu separat, Mencuccini și Rugini (1993) au raportat că întunecarea bazei a avut un efect redus asupra înrădăcinării microstructurilor de migdal, cais, castan, jojoba și măslin și a fost inhibitor pentru nuc. Prin urmare, în cazul în care succesul înrădăcinării este sub ceea ce este de dorit, întunecarea bazală poate fi utilă.
Înrădăcinare ex vitro. În cazul în care procentele de înrădăcinare sunt similare, înrădăcinarea ex vitro poate fi mai eficientă și mai rentabilă decât înrădăcinarea in vitro (Leva, 2011). Costurile sunt mai mari la înrădăcinarea in vitro din cauza ingredientelor, a timpului de pregătire, a mediului de autoclavare, a forței de muncă pentru transferuri și deplasarea culturilor și a spațiului de incubare. Deplasarea în seră este similară între înrădăcinarea in vitro și ex vitro, iar timpul de transplantare poate fi similar sau mai lent atunci când există rădăcini pe microstructuri (figurile 4 și 6). Eficiența este sporită prin înrădăcinarea ex vitro. S-a raportat că calitatea rădăcinilor microplantelor de nuc este superioară atunci când rădăcinile se formează ex vitro în condiții de ceață decât in vitro într-un mediu gelificat (Leslie et al., 2010).
Figura 6. (a) și (b) Plantule de cireș micropropagate înrădăcinate in vitro, pregătite pentru transplantarea într-un mediu de seră cu turbă de sphagnum înainte de plasarea sub umiditate relativă ridicată pentru aclimatizare. (c) Plantulele de cireș plantate ca primă etapă a aclimatizării în seră. (d) Plantule de nuc fiind plantate într-un platou înainte de a fi plasate sub umiditate relativă ridicată într-o seră.
Înrădăcinarea ex vitro poate fi o îmbunătățire a înrădăcinării in vitro. Deși micromițeii in vitro de Gardenia jasminoides au înrădăcinat în 10 zile, comparativ cu 14 pentru micromițe ex vitro, toți micromițeii înrădăcinați ex vitro au supraviețuit aclimatizării, comparativ cu o supraviețuire de 80% pentru micromițeii înrădăcinați in vitro (Hatzilazarou et al., 2006). O supraviețuire mai slabă a micromarcănilor înrădăcinați in vitro comparativ cu micromarcănii înrădăcinați ex vitro a fost, de asemenea, raportată pentru nuc (Leslie et al., 2010).
Poate fi necesară tratarea micromarcănilor cu auxină înainte de plantarea în mediul de înrădăcinare pentru înrădăcinarea ex vitro. Micropuii de fistic tratați cu 2% IBA în talc au înrădăcinat ex vitro în proporție de 79% față de 48% în cazul martorilor (Benmahioul et al., 2012).
Înrădăcinarea ex vitro îmbunătățită poate fi obținută, de asemenea, cu auxină aplicată sub formă de baie lichidă aplicată pe porțiunea bazală a micropuiilor. Un impuls de 15 minute în 250 µM IBA a determinat înrădăcinarea a 90 % din microstructurile din specia de arbore Melia azedarach, comparativ cu absența înrădăcinării pe microstructurile de control (Husain și Anis, 2009). O scufundare de 2 h într-o soluție apoasă de 588 µM IBA a provocat înrădăcinarea a 90 % din micromarcănii de Malus zumi, comparativ cu 20 % înrădăcinare la martori (Xu et al., 2008).
Poate din cauza unei reveniri la juvenilitate, creșterea timpului de multiplicare in vitro poate crește înrădăcinarea micromarcănilor. Leva și Petruccelli (2012) au testat înrădăcinarea până la șapte subculturi și au constatat că înrădăcinarea a fost cea mai bună după a șaptea subcultură.
Instalațiile, specia, metoda de expediere, cererea clienților și preferințele manageriale, toate acestea dictează modul în care sunt înrădăcinați micromițeii. Speciile care înrădăcinează foarte ușor sau care înrădăcinează în timpul fazei de proliferare a lăstarilor pot fi aclimatizate rapid la mediul ex vitro. Speciile dificile sunt cele care primesc o atenție specială, în ceea ce privește iluminarea, tratamentul cu auxină, înrădăcinarea in vitro sau ex vitro și alți factori. Clonele care sunt dificil de înrădăcinat cer prețuri mai mari din partea clienților, deoarece înrădăcinarea este un impediment pentru o producție eficientă. Înrădăcinarea poate fi îmbunătățită dacă este abordată ca un proces în mai multe etape de dobândire a competenței, de inițiere a rădăcinilor și de creștere ulterioară a rădăcinilor. Toate aceste etape trebuie să fie luate în considerare și abordate, în special în cazul clonelor mai dificil de înrădăcinat.
.