[Recuperarea antigenului: semnificația și dezavantajele sale în imunohistochimie]

Una dintre cele mai mari probleme în imunohistochimie a fost aceea de a menține atât morfologia bună, cât și imunoreactivitatea antigenelor în secțiunile de țesut. Au fost concepute diverse tehnici de recuperare a imunoreactivității antigenelor (demascare) după prepararea de rutină a țesuturilor, cum ar fi fixarea, deshidratarea și încorporarea, care se utilizează acum pentru imunomarcații nu numai în investigațiile citohistologice, ci și în diagnosticele patologice. În acest raport, în primul rând, mecanismele și semnificația atât a fixării, cât și a recuperării antigenului au fost analizate din punctul de vedere al inactivării proteinelor. În al doilea rând, au fost trecute în revistă unele probleme și note practice în două dintre cele mai populare tehnici de demascare, digestia enzimatică și recuperarea epitopilor indusă de căldură (HIER), pentru a adapta tehnicile cu precizie în imunohistochimie. Principalul artefact indus de fixare este mascarea antigenelor tisulare din cauza reticulației dintre reziduurile de aminoacizi ale proteinelor. Este important să se aleagă o condiție de fixare adecvată pentru fiecare antigen, ținând cont de natura biochimică și de rezistența acestuia la fixare. (tabelul 2) și să se mențină condițiile de fixare la un nivel minim, astfel încât imunoreactivitatea antigenului să poată fi recuperată cu ușurință prin diferite tehnici de demascare (tabelul 3, figura 1). Recuperarea antigenului în sine este procesul care provoacă denaturarea proteinelor în țesuturi, la fel ca multe alte procese de inactivare a proteinelor (tabelul 1). Digestia enzimatică poate ataca părțile de mascare a proteinelor din jurul unui antigen pentru a expune epitopul acestuia. Deși digestia enzimatică este relativ simplă și condițiile de tratament sunt ușor de controlat, rezultatele nu sunt neapărat dramatice și consecvente în funcție de tipurile sau loturile de enzime. Astfel, trebuie să se găsească propriul manual de digestie pentru a obține cel mai bun rezultat de colorare pentru fiecare antigen (de exemplu, tabelul 4). De exemplu, digestia cu pepsină a dat cele mai bune rezultate în ceea ce privește imunomarcajul bromo-deoxiuridinei (BrdU) și al antigenului nuclear al celulelor proliferante (PCNA), în timp ce alte enzime au avut un efect redus (tabelul 5). Încălzirea poate, de asemenea, să scindeze coloana vertebrală polipeptidică și să întrerupă legăturile încrucișate produse prin fixare. Efectul încălzirii asupra recuperării antigenului este dependent de temperatură și pare să fie proporțional cu produsul dintre temperatură și timp. În cazul imunocolorației PCNA pe secțiuni de parafină fixate cu paraformaldehidă, a fost necesară încălzirea la 90 grade C timp de cel puțin 3 minute; cu toate acestea, pe măsură ce condiția de încălzire a devenit mai severă, au crescut și colorațiile de fond nespecifice (tabelul 6), ceea ce reprezintă una dintre cele mai grave probleme de recuperare a antigenului (Fig. 2a, c). O alegere posibilă pentru evitarea unor astfel de rezultate nedorite este combinarea încălzirii suboptime (la 80 de grade C timp de 10-15 min) și a digestiei cu pepsină (Fig. 2b, d). Un considerent teoretic important pentru utilizarea unei astfel de metode dramatice de denaturare este dacă epitopi antigeni mascați pot fi expuși în mod adecvat fără a da naștere la rezultate fals pozitive (sau fals negative) cu anticorpi de încredere anterior. Se pare că fiecare antigen necesită un preparat tisular „pe măsură” pentru o conservare optimă a antigenității sale și o localizare precisă. În conformitate cu dezvoltarea imunologiei, a biologiei moleculare, a geneticii sau a embriologiei, nevoia de imunomarcații multiple în combinație cu alte tehnologii, cum ar fi hibridizarea in situ, ar trebui să crească pentru a analiza relațiile spațiale și funcționale dintre diverse molecule in situ. Recuperarea antigenului ar deveni atunci o strategie puternică.