Secvențierea cu bisulfit

Secvențierea cu bisulfit aplică metode de secvențiere de rutină pe ADN genomic tratat cu bisulfit pentru a determina starea de metilare la dinucleotidele CpG. Alte strategii de nesecvențiere sunt, de asemenea, utilizate pentru a interoga metilarea la loci specifici sau la nivelul întregului genom. Toate strategiile pornesc de la premisa că conversia indusă de bisulfit a citosinelor nemetilate în uracil este completă, iar acest lucru servește drept bază pentru toate tehnicile ulterioare. În mod ideal, metoda utilizată ar trebui să determine starea de metilare separat pentru fiecare alelă. Metodele alternative la secvențierea cu bisulfit includ analiza combinată de restricție cu bisulfit și imunoprecipitarea ADN-ului metilat (MeDIP).

Metodologiile de analiză a ADN-ului tratat cu bisulfit sunt în continuă dezvoltare. Pentru a rezuma aceste metodologii care evoluează rapid, au fost scrise numeroase articole de analiză.

Metodologiile pot fi împărțite, în general, în strategii bazate pe PCR specifică metilării (MSP) (figura 4) și strategii care utilizează reacția în lanț a polimerazei (PCR) realizată în condiții nespecifice metilării (figura 3). Metodele bazate pe microarray-uri utilizează, de asemenea, PCR bazată pe condiții nespecifice de metilare.

Metode bazate pe PCR nespecifică de metilareEdit

Figura 3: Metode de analiză a metilației ADN care nu se bazează pe PCR specifică de metilare. După conversia cu bisulfit, ADN-ul genomic este amplificat cu PCR care nu face discriminare între secvențele metilate și cele nemetilate. Numeroasele metode disponibile sunt apoi utilizate pentru a face discriminarea pe baza modificărilor din cadrul ampliconului ca urmare a conversiei cu bisulfit.

Secvențiere directăEdit

Prima metodă raportată de analiză a metilației utilizând ADN tratat cu bisulfit a utilizat PCR și secvențierea ADN cu dideoxinucleotide standard pentru a determina direct nucleotidele rezistente la conversia cu bisulfit. Primerii sunt concepuți pentru a fi specifici pentru fiecare catenă, precum și pentru a fi specifici pentru bisulfit (adică primeri care conțin citosine non-CpG, astfel încât să nu fie complementari cu ADN-ul netratat cu bisulfit), care flanchează (dar nu implică) situsul de metilare de interes. Prin urmare, aceasta va amplifica atât secvențe metilate, cât și nemetilate, spre deosebire de PCR specifică pentru metilare. Toate situsurile de citosine nemetilate sunt afișate sub formă de timine în secvența amplificată rezultată a șirului sens și sub formă de adenine în șirul antisens amplificat. Prin încorporarea unor adaptoare de secvențiere de mare randament în primerii PCR, produsele PCR pot fi secvențiate cu secvențiere masivă paralelă. În mod alternativ, și cu un volum mare de muncă, produsul PCR poate fi clonat și secvențiat. Se pot utiliza metode Nested PCR pentru a îmbunătăți produsul pentru secvențiere.

Toate tehnicile ulterioare de analiză a metilării ADN-ului utilizând ADN tratat cu bisulfit se bazează pe acest raport al lui Frommer et al. (Figura 2). Deși majoritatea celorlalte modalități nu sunt adevărate tehnici bazate pe secvențiere, termenul „secvențiere cu bisulfit” este adesea utilizat pentru a descrie tehnicile de analiză a metilării ADN-ului prin conversie cu bisulfit în general.

PirosecvențieEdit

Pirosecvențierea a fost, de asemenea, utilizată pentru a analiza ADN-ul tratat cu bisulfit fără a utiliza PCR specifică pentru metilare. În urma amplificării PCR a regiunii de interes, se utilizează pirozecvențierea pentru a determina secvența convertită cu bisulfit a situsurilor CpG specifice din regiune. Raportul dintre C și T la siturile individuale poate fi determinat cantitativ pe baza cantității de încorporare a C și T în timpul extinderii secvenței. Principala limitare a acestei metode este reprezentată de costul tehnologiei. Cu toate acestea, Pyrosequencing permite foarte bine extinderea la metodele de screening de mare randament.

O altă îmbunătățire a acestei tehnici a fost descrisă recent de Wong și colab. care utilizează amorsă specifică alelei care încorporează polimorfismele cu un singur nucleotid în secvența amorsă de secvențiere, permițând astfel analiza separată a alelei materne și paterne. Această tehnică este deosebit de utilă pentru analiza amprentării genomice.

Methylation-sensitive single-strand conformation analysis (MS-SSCA)Edit

Această metodă se bazează pe metoda single-strand conformation polymorphism analysis (SSCA) dezvoltată pentru analiza polimorfismelor cu un singur nucleotid (SNP). SSCA diferențiază între fragmente de ADN monocatenar de dimensiuni identice, dar cu secvențe distincte, pe baza migrării diferențiale în electroforeza nedenaturantă. În MS-SSCA, acest lucru este utilizat pentru a distinge între regiunile tratate cu bisulfit, amplificate prin PCR, care conțin situsurile CpG de interes. Deși SSCA este lipsit de sensibilitate atunci când este prezentă doar o singură diferență de nucleotide, tratamentul cu bisulfit realizează frecvent un număr de conversii C-T în majoritatea regiunilor de interes, iar sensibilitatea rezultată se apropie de 100%. MS-SSCA oferă, de asemenea, o analiză semi-cantitativă a gradului de metilare a ADN-ului pe baza raportului dintre intensitățile benzilor. Cu toate acestea, această metodă este concepută pentru a evalua toate situsurile CpG în ansamblu în regiunea de interes, mai degrabă decât situsurile de metilare individuale.

Analiza de topire de înaltă rezoluție (HRM)Edit

O altă metodă de diferențiere a ADN-ului convertit de ADN-ul tratat cu bisulfit neconvertit este utilizarea analizei de topire de înaltă rezoluție (HRM), o tehnică cantitativă bazată pe PCR, concepută inițial pentru a distinge SNP-urile. Ampliconii PCR sunt analizați direct prin rampa de temperatură și eliberarea rezultată a unui colorant fluorescent intercalant în timpul topirii. Gradul de metilare, reprezentat de conținutul C-to-T din amplicon, determină rapiditatea topirii și eliberarea consecventă a colorantului. Această metodă permite o cuantificare directă într-un test cu un singur tub, dar evaluează metilarea în regiunea amplificată ca întreg, mai degrabă decât în situsuri CpG specifice.

Extinderea amorselor cu un singur nucleotid sensibilă la metilare (MS-SnuPE)Edit

MS-SnuPE utilizează metoda de extindere a amorselor, concepută inițial pentru analiza polimorfismelor cu un singur nucleotid. ADN-ul este convertit cu bisulfit, iar amorsele specifice bisulfitului sunt aneantizate la secvența până la perechea de baze imediat înainte de CpG-ul de interes. Amorsele sunt lăsate să se extindă cu o pereche de baze în C (sau T) folosind dideoxinucleotide de terminare a ADN polimerazei, iar raportul dintre C și T este determinat cantitativ.

Pentru a determina acest raport C:T pot fi folosite mai multe metode. La început, MS-SnuPE s-a bazat pe ddNTP-uri radioactive ca raportor al extensiei amorselor. Se pot utiliza, de asemenea, metode bazate pe fluorescență sau pirozecvenție. Cu toate acestea, se poate utiliza, în esență, analiza prin spectrometrie de masă cu ionizare prin desorbție laser asistată de matrice/time-of-flight (MALDI-TOF) pentru a diferenția între cei doi produși polimorfici de extensie a amorselor, pe baza testului GOOD conceput pentru genotiparea SNP. Cromatografia lichidă de înaltă performanță în fază inversă cu pereche de ioni (IP-RP-HPLC) a fost, de asemenea, utilizată pentru a distinge produsele de extensie a amorselor.

Clivaj specific bazei/MALDI-TOFEdit

O metodă descrisă recent de Ehrich et al. profită în continuare de conversiile bisulfitului prin adăugarea unei etape de clivaj specific bazei pentru a spori informațiile obținute din modificările nucleotidelor. Utilizând mai întâi transcrierea in vitro a regiunii de interes în ARN (prin adăugarea unui situs promotor al ARN-polimerazei la primerul PCR în amplificarea inițială), se poate utiliza RNază A pentru a cliva transcrierea ARN-ului în situsuri specifice bazei. Deoarece RNaza A scindează ARN-ul în mod specific la ribonucleotidele citozină și uracil, specificitatea bazei se obține prin adăugarea de dTTP rezistent la scindare atunci când se dorește scindarea specifică pentru citozină (specifică pentru C) și prin încorporarea de dCTP atunci când se dorește scindarea specifică pentru uracil (specifică pentru U). Fragmentele scindate pot fi apoi analizate prin MALDI-TOF. Tratamentul cu bisulfit are ca rezultat fie introducerea/eliminarea situsurilor de clivaj prin conversia C-U, fie modificarea masei fragmentelor prin conversia G-A în lanțul invers amplificat. Clivajul specific C va tăia în mod specific toate situsurile CpG metilate. Analizând dimensiunile fragmentelor rezultate, este posibil să se determine modelul specific de metilare a ADN a situsurilor CpG din cadrul regiunii, mai degrabă decât să se determine gradul de metilare a regiunii în ansamblu. Această metodă și-a demonstrat eficacitatea pentru screeningul de mare randament, permițând interogarea a numeroase situsuri CpG în mai multe țesuturi într-o manieră eficientă din punct de vedere al costurilor.

Methylation-specific PCR (MSP)Edit

Figura 4: Methylation-specific PCR este o metodă sensibilă de amplificare și detectare discriminatorie a unei regiuni metilate de interes, folosind primerii specifici pentru metilare pe ADN genomic convertit cu bisulfit. Astfel de primeri se vor aneantiza numai pe secvențe care sunt metilate și, prin urmare, conțin 5-metilcitozine care sunt rezistente la conversia prin bisulfit. În mod alternativ, se pot utiliza amorsori specifici nemetilați.

Această metodă alternativă de analiză a metilației utilizează, de asemenea, ADN tratat cu bisulfit, dar evită necesitatea de a secvenția zona de interes. În schimb, perechile de amorsă sunt concepute ele însele pentru a fi „specifice pentru metilat” prin includerea de secvențe care să completeze doar 5-metilcitozinele neconvertite sau, dimpotrivă, „specifice pentru nemetilat”, care să completeze timinele convertite din citosine nemetilate. Metilarea este determinată de capacitatea amorselor specifice de a realiza amplificarea. Această metodă este deosebit de utilă pentru interogarea insulelor CpG cu o densitate de metilare posibil mare, deoarece un număr mai mare de perechi CpG în amorsă crește specificitatea testului. Plasarea perechii CpG la capătul 3′ al amorsă îmbunătățește, de asemenea, sensibilitatea. Raportul inițial care utilizează MSP a descris o sensibilitate suficientă pentru a detecta metilarea a 0,1 % din alele. În general, MSP și protocoalele sale conexe sunt considerate a fi cele mai sensibile atunci când se interoghează starea de metilare la un locus specific.

Metoda MethyLight se bazează pe MSP, dar oferă o analiză cantitativă folosind PCR cantitativă. Se folosesc primeri specifici pentru metilat și se utilizează, de asemenea, o sondă reporter de fluorescență specifică pentru metilat care se aneantizează la regiunea amplificată. În mod alternativ, primerii sau sonda pot fi concepute fără specificitate de metilare dacă este necesară o discriminare între perechile CpG din cadrul secvențelor implicate. Cuantificarea se face în raport cu un ADN de referință metilat. O modificare a acestui protocol pentru a crește specificitatea PCR pentru ADN-ul convertit cu succes prin bisulfitare (ConLight-MSP) utilizează o sondă suplimentară pentru ADN-ul neconvertit prin bisulfitare pentru a cuantifica această amplificare nespecifică.

O altă metodologie care utilizează ADN-ul amplificat prin MSP analizează produsele utilizând analiza curbei de topire (Mc-MSP). Această metodă amplifică ADN-ul convertit cu bisulfit cu primeri specifici pentru metilat și nemetilat și determină raportul cantitativ al celor doi produse prin compararea vârfurilor diferențiale generate într-o analiză a curbei de topire. A fost introdusă o metodă de analiză de topire de înaltă rezoluție care utilizează atât PCR cantitativă, cât și analiza de topire, în special pentru detectarea sensibilă a metilației la nivel scăzut

Metode bazate pe microarrayEdit

Metodele bazate pe microarray sunt o extensie logică a tehnologiilor disponibile pentru analiza ADN-ului tratat cu bisulfit pentru a permite analiza metilației la nivelul întregului genom. Microrețelele oligonucleotidice sunt concepute folosind perechi de sonde de hibridizare oligonucleotidice care vizează situsurile CpG de interes. Una dintre ele este complementară secvenței metilate nealterate, iar cealaltă este complementară secvenței nemetilate convertite din C în U. Sondele sunt, de asemenea, specifice bisulfitului pentru a preveni legarea la ADN-ul incomplet convertit de bisulfit. Testul Illumina Methylation Assay este un astfel de test care aplică tehnologia de secvențiere cu bisulfit la nivel de microarray pentru a genera date de metilare la nivelul întregului genom.

.