Tehnologia ADN ramificat (bADN)

BY admin
|

Introducere

Testul ADN ramificat (bADN) oferă un instrument unic și puternic pentru cuantificarea fiabilă a moleculelor de acid nucleic. Fundamental diferit de metodele de amplificare a țintei, cum ar fi PCR, testul bDNA măsoară direct moleculele de acid nucleic la niveluri fiziologice prin amplificarea semnalului reporter, mai degrabă decât prin replicarea secvențelor țintă ca mijloc de detecție și, prin urmare, evită erorile inerente extracției și amplificării secvențelor țintă. Testul bDNA utilizează amplificarea liniară a semnalului folosind sonde oligonucleotide sintetice și molecule de bDNA și poate măsura cu acuratețe și precizie între aproximativ 500 și 10.000.000 de molecule. Noile progrese în tehnologia bDNA includ adăugarea de molecule preamplificatoare și încorporarea unor nucleotide noi, isoC și isoG, în secvențele de sonde oligonucleotide pentru a spori și mai mult semnalul și a reduce zgomotul cauzat de hibridizarea nespecifică a componentelor testului bDNA. Aceste îmbunătățiri au extins limita de detecție cantitativă a testului bADN până la 50 de molecule.

Istoria tehnologiei bADN

Bine adaptat pentru utilizarea de rutină într-un cadru clinic sau de cercetare, testul bADN a fost aplicat cu succes într-o serie de domenii, inclusiv în prognosticul și monitorizarea pacienților cu boli virale. Furnizând un mijloc fiabil pentru cuantificarea directă a încărcăturii virale în probe clinice, au fost dezvoltate teste bDNA pentru a măsura ADN-ul virusului hepatitei B, ARN-ul virusului hepatitei C), ARN-ul virusului imunodeficienței umane de tip 1 și ADN-ul citomegalovirusului. Odată cu proiectarea personalizată a sondelor oligonucleotide, aplicațiile potențiale ale testului bDNA ajung mult dincolo de cuantificarea acidului nucleic viral. Prin crearea de sonde oligonucleotide pentru secvențe specifice de molecule de acid nucleic țintă, testul bDNA a fost adaptat la o mare varietate de aplicații. De exemplu, cercetătorii au conceput sonde pentru testul bDNA pentru a măsura nivelurile de ARNm celular. Aceasta s-a dovedit a fi o abordare fructuoasă pentru o serie de aplicații de cercetare, inclusiv monitorizarea modificărilor nivelurilor de ARNm al citokinelor în populațiile de pacienți sănătoși și imunocompromiși, investigarea modelelor de splicing al insulinei și evaluarea inducerii genelor de stres pentru aplicații de toxicologie moleculară. Având în vedere versatilitatea, ușurința de utilizare și nivelul ridicat de performanță, testul bDNA devine rapid metoda de elecție pentru cuantificarea acizilor nucleici

Outline

Testul bDNA utilizează un format de microplăci cu 96 de godeuri și se bazează pe o serie de reacții de hibridizare specifice și pe detecția chemiluminiscentă a sondelor hibridizate. Pe suprafața fiecărui microcuvă sunt atașate sonde de „captură” care conțin o secvență nucleotidică specifică. Aceste sonde de captare se leagă de un subset de „sonde țintă” care sunt legate de secvențe nucleotidice specifice din molecula de acid nucleic țintă. Această serie de hibridizări ancorează molecula de acid nucleic țintă pe suprafața micropodiței. Detectarea acidului nucleic țintă și amplificarea semnalului se realizează printr-o altă serie de hibridări.

Un al doilea subset de sonde țintă leagă molecula de acid nucleic țintă de moleculele amplificatoare de bADN. Prin adăugarea de molecule preamplificatoare pentru a asigura un strat suplimentar de amplificare între sondele țintă și moleculele amplificatoare de bADNb, se poate obține o amplificare și mai mare a semnalului. Fiecare moleculă amplificatoare de bADN a fost concepută pentru a conține 15 brațe, fiecare dintre acestea conținând trei situsuri de legare pentru „sonde de marcare” conjugate cu fosfatază alcalină. Un semnal chemiluminescent este generat la introducerea unui substrat de dioxetan care este activat de fosfataza alcalină. Acest semnal este ușor de cuantificat prin numărarea numărului de fotoni emiși într-un luminometru. Testul bDNA este în mod inerent cantitativ, deoarece numărul de fotoni emiși este direct legat de cantitatea de acid nucleic țintă din specimen.

Materiale

Echipament – Încălzitor de plăci Chiron echipat cu un suport pentru microplăci 8×12 – Luminometru Chiron pentru citirea plăcilor

Reactivi pentru ziua 1

  • Oligonucleotide-microcuve modificate
  • Diluant de liză
  • Reactiv de liză (proteinaza K)
  • Sondele țintă pentru captare
  • Sondele țintă pentru marcare
  • Specimeni

    • .

  • Standarde și controale (opțional)

Reactivi pentru ziua 2

Procedură

Ziua 1

  1. Pregătiți reactivul de lucru pentru specimen prin combinarea:
  • 6 ml de diluant de liză
  • 600 ml de reactiv de liză
  • 32 ml de sonde țintă de 500 fm/ml pentru captare (20 fm/200 ml final)
  • 96 ml de sonde țintă de 500 fm/ml pentru marcare (60 fm/200 ml final)

Nota: Concentrațiile reale ale sondelor țintă vor varia în funcție de molecula de acid nucleic țintă.

  1. Pentru probele de plasmă sau de ser, pipetați 150 ml de reactiv de lucru pentru probe și 50 ml de ser sau de plasmă în micropuțuri modificate cu oligonucleotide în duplicat. Pentru probele de celule sau țesuturi, se prepară și se extrag pelete de ARN în Specimen Working Reagent, așa cum este descris, și se pipetează 200 ml din fiecare extract de ARN în două micropuțuri modificate cu oligonucleotide.
  2. Dacă se dorește, se pot include controale pozitive și negative în scopul specificității. Controalele trebuie tratate în același mod ca cel descris pentru specimene în etapa 2 (de mai sus) și analizate în dublu exemplar.
  3. Dacă se dorește, se pot include standarde pentru o cuantificare absolută. Se pipetează 150 ml de reactiv de lucru pentru probe și 50 ml din membrul corespunzător al curbei standard în microcuve modificate cu oligonucleotide în duplicat.
  4. Sigilează microcuvele cu folie Mylar și incubează microcuvele peste noapte la 53°C în încălzitorul de plăci Chiron. (Notă: Temperatura va depinde de temperatura optimă definită pentru testul specific.)

Ziua 2

  1. Se scoate placa din încălzitorul de plăci Chiron și se lasă să stea 10 minute la temperatura camerei. În timp ce placa se răcește, pregătiți soluția de amplificare prin diluarea concentratului de amplificare la 200 fm/ml în diluant de etichetă. Concentrația finală ar trebui să fie de 10 fm/50 ml.
  2. Spălați micropuțurile de două ori cu Wash A, apoi pipetați 50 ml de amplificator diluat în fiecare puț. Incubați microcuvele timp de 30 min la 53°C în încălzitorul de plăci Chiron.
  3. Scoateți placa din încălzitorul de plăci Chiron și lăsați-o să stea 10 min la temperatura camerei. În timp ce placa se răcește, pregătiți soluția de lucru pentru etichete prin diluarea sondei de etichetare la 500 fm/ml în diluant pentru etichete. Concentrația finală ar trebui să fie de 20 fm/50 ml.
  4. Spălați micropuțurile de două ori cu Wash A, apoi pipetați 50 ml de soluție de lucru cu etichete în fiecare puț. Incubați microcuvele timp de 15 min la 53°C în încălzitorul de plăci Chiron.
  5. Scoateți placa din încălzitorul de plăci Chiron și lăsați-o să stea 10 min la temperatura camerei. În acest timp, pregătiți soluția de substrat formată din 99,7% v/v LumiphosPlus și 0,3% v/v 10% SDS (de exemplu: 3 ml LumiphosPlus, 9 ml 10% SDS).
  6. Spălați micropuțurile de două ori cu Wash A și apoi de trei ori cu Wash B. Adăugați 50 ml de soluție de substrat în fiecare puț.
  7. Măsurați chemiluminescența în luminometrul de citire a plăcii. (Aceasta include incubarea micropuțurilor timp de 30 de minute la 37°C înainte de măsurare pentru a ajunge la o cinetică în stare de echilibru).

Soluționarea problemelor

  • Puțurile modificate cu oligonucleotide trebuie manipulate cu grijă. Nu rupeți benzile de godeuri în segmente. Sigilați bine godeurile cu un sigilator de plăci nou pentru a preveni evaporarea în timpul incubărilor. Atunci când îndepărtați dispozitivul de sigilare a plăcii după incubări, aveți grijă să nu scoateți godeurile din suportul pentru micropuțuri.
  • Toate probele, standardele și controalele trebuie analizate în dublu exemplar pentru o cuantificare optimă. A se omite probele lipemice sau tulburi, deoarece acestea pot da rezultate neconcludente.
  • Pentru rezultate optime, toți reactivii trebuie aduși la temperatura indicată în procedura de analiză înainte de utilizare. Adăugați reactivul în microcuve prin atingerea vârfului pipetei de peretele din apropierea punctului median al godeului, deasupra suprafeței lichidului din gode.

Aplicații

Cuantificarea virală sau testarea încărcăturii virale a devenit parte din managementul de rutină al pacienților infectați cu HIV-1 sau cu virusul hepatitei C (VHC). În prezent, există mai multe tehnologii moleculare care sunt disponibile pentru utilizare în cadrul laboratorului clinic. Dintre acestea, doar testele cu ADN ramificat (bDNA) sunt aprobate de FDA pentru testarea încărcăturii virale HIV-1 și VHC. Această tehnologie de amplificare a semnalului este construită pe o serie de reacții de hibridizare care se pretează foarte bine la automatizare completă și, astfel, diminuează cantitatea de muncă necesară pentru a efectua acest tip de analiză.

Testele de diagnosticare moleculară care utilizează tehnologia bADN pentru detectarea moleculelor țintă de acid nucleic sunt instrumente sensibile, specifice și fiabile în diagnosticarea infecțiilor virale și bacteriene și pentru monitorizarea progresiei bolii în timpul tratamentului. testele bADN au evoluat de la stadii de dezvoltare în laboratoarele de cercetare la teste cantitative aprobate de US Food and Drug Administration cu aplicații clinice valoroase. Testele bADN sunt mai puțin laborioase decât multe proceduri bazate pe molecule, deoarece se pretează foarte bine la automatizare totală. Utilizând bADN, nu este necesară amplificarea unei secvențe țintă și, astfel, contaminarea încrucișată între probele replicate din cauza ampliconilor excesivi sau a reportului este mai puțin probabilă în testele bADN. În plus, deoarece bDNA este o tehnologie de amplificare a semnalului, testul este capabil să cuantifice cu o variabilitate mai mică de 0,5 log sau de 3 ori pentru întregul său interval dinamic.

tehnologia bDNA s-a dovedit a fi versatilă, deoarece au fost dezvoltate metode pentru detectarea infecției cu o gamă largă de microorganisme, inclusiv parazitul Trypanosoma

brucei, citomegalovirusul, bacteriile Staphylococcus sensibile și rezistente la antibiotice, papilomavirusul uman și virusul hepatitei B. Cu toate acestea, eforturile mai recente s-au concentrat asupra dezvoltării de teste bADN pentru cuantificarea ARN al HIV-1 și al virusului hepatitei C (HCV), ceea ce a condus la aplicarea de rutină a metodelor bADN în laboratorul de diagnostic molecular clinic. În descrierea progresului metodelor bADN, această trecere în revistă pune accentul pe testele bADN pentru HIV-1 și HCV.

Prima generație de teste bADN HIV-1

S-au dezvoltat teste bADN de primă generație precise și reproductibile pentru detectarea ARN HIV-1 și ARN HCV în plasma umană (Quantiplex HIV-1 sau HCV ARN 1.0, Bayer, Tarrytown, NY).9-11 Într-unul dintre primele rapoarte privind testul Quantiplex bDNA, nu s-a observat nicio reactivitate folosind probe de plasmă de la donatori seronegativi cu ajutorul testului de prima generație

bDNA, ceea ce indică o specificitate excelentă.9 Rezultate pozitive la testul bADN au fost observate la 83% din probele de la 348 de pacienți care erau seropozitivi pentru HIV-1.9 Intervalul dinamic pentru cuantificare cu ajutorul testului Quantiplex HIV-1 ARN 1.0 s-a extins de la 104 (limita inferioară de detecție) la peste 106 copii ARN HIV/mL.9,11 Modificări ale încărcăturii virale de 2 până la 3 ori au fost semnificative din punct de vedere statistic folosind testul bDNA, ceea ce indică faptul că testul Quantiplex HIV-1 RNA 1.0 a fost foarte precis și reproductibil.11 Prin comparație, au fost necesare modificări ale încărcăturii virale de cel puțin 3,7 până la 5,8 ori înainte ca rezultatele să fie semnificative din punct de vedere statistic folosind primele versiuni ale testului RT-PCR.11 Astfel, bADN a devenit metoda de alegere pentru majoritatea studiilor clinice care evaluează testarea încărcăturii virale și eficacitatea clinică a noilor inhibitori de transcriptază inversă și de protează HIV-1.

Sensibilitatea metodei de detectare a bADN a fost îmbunătățită în testul HIV-1 de a doua generație (testul Quantiplex HIV-1 ARN 2.0, Bayer) prin modificarea designului sondelor țintă și de captură și prin adăugarea de oligonucleotide preamplificatoare. Proiectarea îmbunătățită a sondei țintă și a sondei de captare a permis o creștere a rigurozității hibridizării, reducând astfel fundalul testului. Preamplificatorii cresc dramatic intensitatea semnalului, deoarece fiecare moleculă de preamplificator are mai multe regiuni pentru hibridizarea cu multe molecule de ADNb. În plus, fiecare moleculă de ADNb are secvențe multiple și repetate pentru hibridizarea sondelor marcate cu AP. Semnalul de ieșire folosind testul Quantiplex HIV-1 RNA 2.0 a arătat liniaritate de la aproximativ 500 de copii/mL la 1,6 × 106 copii/mL (intervalul dinamic declarat a fost de 500 până la 8 × 105 copii/mL). Sensibilitatea testului HIV-1 bADN de a doua generație a crescut de 20 de ori în comparație cu testul de primă generație (limitele inferioare de detecție au fost de 500 copii/mL și, respectiv, 10 × 104 copii/mL). Într-o analiză amplă a preciziei, au fost comparate rezultatele testelor inițiale și rezultatele retestelor în testul Quantiplex HIV-1 ARN 2.0. S-a constatat că testul HIV-1 ARN 2.0 este foarte reproductibil.14 Din 174 de probe cu încărcături virale de peste 5 000 de copii/mL, 96% au avut diferențe de mai puțin de 0,3 log10 în ceea ce privește numărul de copii între rezultatele inițiale și rezultatele retestelor. Din 69 de probe cu încărcături virale între 500 și 5.000 de copii/mL, 86% au avut diferențe mai mici de 0,3 log10 între rezultatele inițiale și cele ale retestelor. Cu toate acestea, în rândul celor 5.339 de pacienți care au fost testațiîn cadrul testelor clinice de rutină pe parcursul unui interval de 1 an, încărcături virale mai mici de 500 de copii/mL au fost observate în 41,6% dintre probe.

Prin urmare, a fost necesar un test bADN cu o sensibilitate mai mare (adică o limită inferioară de detecție de <500 de copii/mL) pentru o proporție substanțială de pacienți.

Caracteristicile de performanță ale testului Quantiplex HIV-1 ARN 2.0 și ale unui test RT-PCR (testul Amplicor HIV-1 Monitor 1.0, Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) au fost comparate folosind diluții de probe standard care aveau un număr cunoscut de copii ale virusului HIV-1. Atunci când diluțiile acelorași standarde au fost testate în cele două teste, numărul de copii HIV-1 a fost, în general, mai mare în cazul testului RT-PCR decât în cazul testului bDNA. De exemplu, intervalele numerelor de copii de ARN au fost cuprinse între 900 și 7,68 × 105 copii/mL în cazul testului bADN și între 3 360 și 1,88 × 106 copii/mL în cazul testului RT-PCR. Ambele teste au fost liniare pentru intervalele dinamice declarate.

Compararea pantelor liniilor de regresie dintre numărul de copii HIV-1 și semnalul de ieșire a sugerat că testul bADN a avut o eroare sistematică mai puțin proporțională. Variabilitatea între cicluri, folosind o probă standard cu 1 650 de copii HIV-1/mL, a fost mai mică în cazul testului bADN decât în cazul testului RT-PCR; coeficienții de variație pentru testele bADN și RT-PCR au fost de 24,3% și, respectiv, 34,3%, ceea ce indică faptul că testul bADN a fost ușor mai precis la acest număr de copii ARN HIV-1. În comparație cu utilizarea standardului de 1 650 de copii/mL, coeficienții de variație între cicluri au fost mai mari pentru o probă care conținea 165 de copii ARN HIV-1/mL (44,0% și 42.7% pentru testele bDNA și, respectiv, RT-PCR). Rezultatele testelor au fost similare atunci când numărul egal de copii HIV-1 a fost comparat între subtipurile HIV de la A la F prin utilizarea testului bADN. Cu toate acestea, prin această versiune de RT-PCR, subtipurile A, E și F au fost detectate mai puțin eficient decât subtipurile B, C și D. Diferențele dintre testul bDNA de a doua generație și testul RT-PCR Amplicor Monitor pentru cuantificarea HIV-1 au indicat faptul că este necesară o consecvență a metodei de testare pentru fiecare pacient în parte, pe parcursul diagnosticării și tratamentului.

Testări bDNAHCV

În timp ce continua să dezvolte un test bDNA HIV-1 de a treia generație îmbunătățit, Bayer a recunoscut necesitatea de a dezvolta un test de încărcare virală a HCV cu o utilitate clinică emergentă similară cu cea pentru testarea HIV-1. Pentru detectarea HCV, testul bADN de primă generație (testul Quantiplex HCV RNA 1.0, Bayer) avea un interval de cuantificare dinamică în plasma umană de la 3,5 × 105 la 1,2 × 108 copii ARN HCV/mL. Genotipurile de la 1 la 6 au fost detectate cu ajutorul acestui test, deși sensibilitatea a fost mai scăzută pentru genotipurile 2 și 3 (rată de detecție de 67 %: semnal pozitiv pentru 60 din 89 de probe de ser cunoscute ca conținând genotipurile 2 sau 3 ale HCV) în comparație cu genotipul 1 (rată de detecție de 97 %: semnal pozitiv pentru 67 din 69 de probe de ser cunoscute ca conținând genotipul 1 al HCV). O comparație între testul Quantiplex HCV ARN 1.0 și un test RT-PCR pentru HCV dezvoltat de un laborator de cercetare a arătat o sensibilitate mai mare în cazul testului RT-PCR, care a avut o limită inferioară de detecție de 2,5 × 104 copii ARN VHC/mL. Cu toate acestea, testul bADN al HCV a avut o reproductibilitate mai mare și a necesitat mai puțin timp decât testul RT-PCR al HCV dezvoltat în laborator.

Pentru a îmbunătăți rata de detecție pentru genotipurile 2 și 3 ale HCV, a fost dezvoltat un test de a doua generație (testul Quantiplex HCV ARN 2.0, Bayer).15 Principala modificare de concepție a testului de a doua generație pentru ARN al HCV a constat în utilizarea de sonde pentru secvențe din genomul HCV care erau mai bine conservate între genotipuri. Aceste regiuni conservate erau secvențe netranslate 5′ și secvențe din gena centrală a genomului HCV. Rezultatul modificărilor aduse la sondele țintă și la sondele de captură a fost reducerea dramatică a variației ratei de detecție între genotipurile HCV în testul de a doua generație. Fiecare dintre cele 6 genotipuri HCV a avut o rată de detecție ridicată și s-a înregistrat o îmbunătățire semnificativă în ceea ce privește detecția genotipurilor 2 și 3 ale HCV (detecția a 93% vs. 67% din probele cunoscute ca conținând genotipurile 2 sau 3 ale HCV în testele HCV 2.0 și, respectiv, HCV 1.0). De asemenea, sensibilitatea testului bADN de a doua generație a fost ușor îmbunătățită în comparație cu testul HCV 1.0 (limitele inferioare de cuantificare au fost de 2,0 × 105 față de 3,5 × 105 ).

Sesizări bADN de a treia generație pentru HIV-1 și HCV

În testele bADN de prima și a doua generație, hibridizarea nespecifică a sondelor oligonucleotide la secvențe nețintă a limitat sensibilitatea testului. Îmbunătățirea tehnologică esențială din a treia generație de teste bDNA (Quantiplex HIV-1 RNA 3.0, Bayer) a fost utilizarea bazelor nenaturale, 5′-metil-2′- deoxiizoguanosină (isoG) și 5′-metil-2′-isodeoxi-citidină (isoC), în sinteza tuturor sondelor din sistemul bDNA, cu excepția extensoarelor de captare care mediază captarea acidului nucleic viral țintă pe suprafața plăcii. Deoarece oligonucleotidele care conțin isoG și isoC nu sunt prezente în natură, hibridizarea nespecifică este redusă semnificativ. Astfel, sondele modificate cu bazele nenaturale nu formează hibrizi stabili cu sonda de captare în absența ARN-ului țintă. În descrierea inițială a testului de a treia generație, limita de detecție a HIV-1 în probele de plasmă de la 11 pacienți a fost de 50 de copii pe ml.Aceasta reprezintă o îmbunătățire de 10 ori a limitei de detecție în comparație cu testul de a doua generație. În timpul tratamentului cu terapie antiretrovirală extrem de activă, încărcătura virală HIV-1 a scăzut până sub limita de detecție pentru toți cei 11 pacienți.

Atestarea VERSANT HIV-1 RNA 3.0 are un interval dinamic de 75 până la 5 × 105 copii ARN HIV/mL. Versiunea 3.0 a fost, de asemenea, aprobată la o limită inferioară de detecție egală cu 50 de copii/mL în alte câteva țări. Atunci când probele potrivite au fost comparate în testul HIV-1 bDNA de a doua generație (Quantiplex versiunea 2.0) și în testul RT-PCR Amplicor Monitor 1.0, s-au obținut în mod constant numere de copii HIV-1 mai mici cu ajutorul testului bDNA. Cu toate acestea, a fost observată o corelație cantitativă strânsă în ceea ce privește numărul de copii de ARN HIV-1 între testul de a treia generație (versiunea 3.0) și testul RT-PCR Amplicor Monitor 1.5.18 Rezultatele încărcăturii virale în testul bDNA versiunea 3.0 și în testul RT-PCR Amplicor au fost de aproximativ 2 ori mai mari decât în cazul testului versiunea 2.0. Rezultatele similare din punct de vedere cantitativ în testul bDNA versiunea 3.0 și în testul RT-PCR sunt importante în îngrijirea pacienților din cauza posibilității probabile ca metode diferite să fie utilizate în testarea probelor de la același pacient pentru cursul terapiilor anti-HIV. Date recente sugerează că este posibil să nu fie necesară o rebasare pentru pacienții testați cu un test RT-PCR.

Similar cu testul bDNA HIV-1 versiunea 3.0, testul bDNA de a treia generație pentru HCV a utilizat, de asemenea, oligonucleotide substituite cu izoC și izoG pentru a reduce hibridizarea nespecifică. Utilizarea oligonucleotidelor substituite cu izoC și izoG a crescut sensibilitatea testului de aproximativ 62 de ori. Limita inferioară de detecție a testului HCV ARN 3.0 a fost de 3,2 × 103 copii/mL, comparativ cu 2 × 105 copii/mL în cazul testului HCV ARN 2.0. Intervalul de cuantificare dinamic liniar al testului HCV RNA 3.0 s-a extins de la 3,2 × 103 copii/mL (615 UI/mL) la 4 × 107 copii HCV RNA/mL (7,7 × 106 UI/mL). Testul HCV RNA 3.0 a avut o specificitate ridicată (98,2 %) și, similar cu testul de a doua generație, a fost la fel de eficient în cuantificarea ARN VHC pentru toate genotipurile. Abaterile standard între runde și în cadrul rundei pentru probele replicate au fost de 0,2 log10 și, respectiv, 0,14 log10, ceea ce indică faptul că testul de a treia generație a fost foarte reproductibil.

În plus față de eradicarea VHC în ser, un obiectiv important al terapiilor anti-VHC este reducerea nivelurilor de VHC în ficat. Utilitatea testului HCV RNA 3.0 pentru detectarea și cuantificarea ARN al VHC în probele de biopsie hepatică a fost studiată la 25 de pacienți coinfectați cu VHC și HIV.20 Reproductibilitatea testului HCV bDNA de a treia generație a fost similară între probele de biopsie hepatică și probele de ser. De asemenea, detectarea ARN VHC în probele de ficat de la pacienții infectați cu genotipurile 1, 3 și 4 prin testul HCV ARN 3.0 a fost foarte specifică și sensibilă. În acest studiu efectuat pe 25 de pacienți, nivelurile ridicate de VHC intrahepatic

HCV înainte de tratament s-au corelat cu o frecvență scăzută a răspunsului la tratamentul anti-VHC. Nivelurile intrahepatice de VHC pretratament au fost cele mai ridicate la pacienții infectați cu genotipul 1 al VHC. Rezultatele acestui studiu au demonstrat că markerii importanți ai progresiei bolii HCV, nivelurile de HCV în ficat și în ser, pot fi cuantificate în mod fiabil prin analiza bADN în timpul tratamentului. Metodele pentru a treia generație de teste bDNA includ pregătirea probei, hibridizarea și detectarea semnalului pentru ARN HIV-1 și ARN HCV. Toate cele 3 s eps sunt efectuate în micropuțurile de pe platforma System 340 pentru testul HCV RNA 3.0 care nu necesită o etapă de extracție separată. În testul HIV-1 ARN versiunea 3.0, pregătirea probei este diferită de metoda HCV ARN și se realizează în afara platformei System 340. Un studiu recent a evaluat o adaptare a metodei ARN HIV-1 versiunea 3.0, în care etapa de procesare a probei HIV- 1 a fost modificată pentru a permite testarea simultană pentru HCV și HIV-1 pe platforma System 340. Metoda HIV-1 a fost modificată prin omiterea incubării de 2 ore la 63°C pentru liza virală. În schimb, liza HIV-1 și HCV a fost efectuată pe platforma Sistemului 340. Metodele de testare a HCV bDNA au rămas neschimbate în testul combinat. Specificitatea și cuantificarea prin metoda combinată bDNA au fost în conformitate cu specificațiile pentru testele individuale HIV-1 și HCV. Testarea simultană pentru HIV-1 și pentru VHC a îmbunătățit fluxul de lucru în laboratorul clinic și a dus la reducerea costurilor. Deoarece detectarea și cuantificarea ARN-ului HIV-1 și a ARN-ului VHC sunt esențiale pentru diagnostic și pentru evaluarea răspunsurilor la terapie, capacitatea de a efectua teste simultane pentru ambele virusuri reprezintă un progres semnificativ în diagnosticul molecular.

.