Validarea anticorpilor

Resurse „Centre de resurse tehnice „Resurse tehnice anticorpi „Validarea anticorpilor

Nu toți anticorpii sunt valabili pentru fiecare experiment și condiție, aceștia trebuie să fie validați pentru aplicația și specia specifice. În prezent, nu există niciun mijloc standard de „validare a anticorpilor”, iar acest lucru poate avea un mare impact asupra reproductibilității și fiabilității experimentale. Revistele și agențiile de finanțare au luat măsuri pentru a remedia această lacună. Multe dintre ele au acum cerințe de a indica în mod explicit modul în care veți valida un anticorp pentru o utilizare specifică. Din păcate, nu există criterii universal acceptate pentru validarea anticorpilor. Astfel, depinde de fiecare cercetător să valideze fiecare anticorp pentru aplicația prevăzută.

Validare de bază

Metodele standard de validare a anticorpilor includ western blot, ELISA, citometrie de flux și IHC. Cei mai mulți cercetători se simt confortabil cu aceste metode testate și verificate. Procesul de validare poate fi consumator de timp, deoarece cercetătorul sau producătorul trebuie să valideze anticorpul pentru fiecare aplicație. Această dificultate este agravată de faptul că fiecare condiții ale fiecărui test sunt diferite. De exemplu, un western blot depinde de denaturarea proteinelor. Astfel, un anticorp validat pentru western blot poate funcționa bine în condiții de denaturare, dar poate să nu reușească să recunoască antigenii în conformația lor nativă (de exemplu, ELISA).1 De asemenea, un anticorp validat pentru afinitatea proteică nativă ar putea să nu reușească să se lege de același antigen în urma denaturării sau fixării.

Metodele de mai sus joacă roluri necesare în validarea anticorpilor. Cu toate acestea, nu ne putem baza doar pe aceste metode, deoarece ele nu reprezintă aplicațiile în continuă expansiune. Nivelul de încredere al anticorpilor validați poate fi crescut prin includerea altor tehnici de validare.

Tehnici vechi, utilizări noi

Pentru a aborda deficiențele validării anticorpilor de bază, un grup de oameni de știință s-a reunit recent pentru a „propune un set de orientări standard pentru validarea anticorpilor”.2 Aceștia sugerează ca, pe lângă metodele de bază de validare a anticorpilor, cercetătorii să înceapă să se sprijine pe piloni conceptuali. Aceștia includ strategiile genetice, strategiile anticorpilor independenți și expresia proteinelor marcate.2

• Strategii genetice: CRISPR-Cas9 și mai mult

  Strategii genetice constau în tehnici precumCRISPR-Cas9, RNAi și siRNA knockdown, utilizate împreună cu un test de detectare a proteinelor. Aceste metode detectează orice legare nespecifică de către anticorpul în cauză după eliminarea sau reducerea genei corespunzătoare. Dacă anticorpul este specific, atunci nu ar trebui să se detecteze niciun semnal sau un semnal redus al anticorpului în liniile celulare eliminate sau, respectiv, reduse.

• Abordare cu anticorpi independenți

  Utilizarea anticorpilor independenți este o altă metodă care ar putea detecta legarea nespecifică. Abordarea cu anticorpi independenți utilizează doi anticorpi diferiți (independenți) care se leagă de același antigen, dar de epitopi diferiți. Prin urmare, cei doi anticorpi ar trebui să prezinte același tipar de detecție și să nu prezinte nicio legare în afara țintei.2 Această tehnică necesită mai multe probe pentru testare pentru a controla expresia variabilă a proteinei-țintă, ceea ce ar putea deveni costisitor și consumator de timp.2 În plus, tehnica de validare se bazează pe disponibilitatea mai multor anticorpi care recunosc epitopi diferiți pe aceeași proteină-țintă. GenScript oferă binning de epitopi în serviciileMonoExpress™ mAb care includ „anticorpi independenți” pentru antigene proteice.

• Expresia proteinelor marcate

  Analiza detecției proteinelor țintă marcate poate oferi, de asemenea, o modalitate de a măsura legarea nespecifică a anticorpilor. În această metodă, proteinele țintă sunt modificate fie cu o etichetă de afinitate (de exemplu, FLAG), fie cu o proteină fluorescentă (de exemplu, GFP). Apoi, la fel ca în cazul abordării anticorpilor independenți, modelul de detecție al anticorpului care este validat este comparat cu cel al anticorpului cu tag specific. Deși este simplă, o problemă a acestei metode este aceea de a se asigura că proteinele marcate sunt exprimate la niveluri endogene, deoarece „supraexprimarea ar putea masca detectarea evenimentelor de legare în afara țintei”.2

  Anticorpi recombinanți ca alternativă la anticorpii monoclonali?

  Un apel recent la acțiune în ceea ce privește validarea anticorpilor a sugerat ca cercetătorii să folosească numai anticorpi recombinanți, mai degrabă decât anticorpi policlonali sau chiar monoclonali. Anticorpii monoclonali sunt produșifolosind linii celulare de hibridom. Din nefericire, liniile celulare de hibridom pot muri, își pot pierde genele care codifică anticorpi sau nu se pot dezvolta atunci când sunt scoase din depozitul de congelare.3 În plus, anticorpii monoclonali produși de hibridomuri ar putea să se lege la mai multe ținte. Prin urmare, determinarea secvenței anticorpului codificat de hibridom și producerea anticorpului prin recombinare rezolvă aceste probleme. De asemenea, datorită secvenței definite, anticorpii recombinanți pot oferi un alt nivel de validare în comparație cu utilizarea exclusivă a tehnicilor de mai sus.3

  Aceste metode suplimentare de validare își propun să „furnizeze dovezi că un anticorp se leagă de ținta sa și, în cele mai multe cazuri, ar trebui să permită, de asemenea, evaluarea reactivității încrucișate potențiale în condițiile testate”.2 Cu toate acestea, strategiile vechi și noi vor trebui probabil să fie efectuate în combinație pentru a valida corect anticorpul.

Alegerea metodei adecvate de validare a anticorpilor

Cu toate aceste aspecte legate de anticorpi, cum alegeți metoda adecvată?

În primul rând, trebuie să decideți în ce test veți utiliza anticorpul. De exemplu, metoda CRISPR-Cas9 nu implică modificarea proteinei țintă și validează faptul că anticorpul este lipsit de reactivitate încrucișată cu alte proteine. Astfel, puteți utiliza această tehnică pentru a valida anticorpi pentru o mare varietate de teste, inclusiv western blot, IHC, imunocitochimie (ICC), citometrie în flux, ELISA, imunoprecipitare (IP), imunoprecipitare a cromatinei (ChIP) și teste de proteine în fază inversă.2 Cu toate acestea, din cauza dificultăților legate de exprimarea unei proteine modificate, validarea unui anticorp folosind expresia unei proteine marcate este sugerată numai pentru Western Blot, IHC, ICC și citometria în flux.

În al doilea rând, cercetătorul trebuie să fie conștient de limitările de eșantionare ale acestor metode de validare. De exemplu, atât tehnicile CRISPR-Cas9/KO, cât și tehnicile de expresie a proteinelor marcate nu pot fi utilizate pentru validarea anticorpilor în eșantioane de țesut uman și fluide corporale, cum ar fi plasma și serul.2 Acest lucru se datorează faptului că nu puteți efectua manipulări genetice la om, spre deosebire de liniile celulare.

În cele din urmă, indiferent de anticorpul și de metoda de validare respectivă utilizată de furnizorul de anticorpi, cercetătorul trebuie să efectueze cel puțin o strategie de validare în contextul aplicației sau al probei sale specifice.2

Validarea fiecărui anticorp pentru aplicația și specia dumneavoastră specifice este esențială pentru obținerea unor rezultate reproductibile și fiabile. Aceste informații vă vor ajuta să vă ghidați decizia cu privire la metodele adecvate de utilizat în laboratorul dumneavoastră. Pentru ajutor suplimentar cu privire la validarea anticorpilor sau alte aplicații, vizitațiGenScript Antibody Technical Resources.

Adaptat din conținutul creat de BitesizeBio în numele GenScript.

.