Současné aplikace protilátkových mikročipů

Vzhledem k jedinečným schopnostem protilátkových mikročipů a jejich použitelnosti v řadě biomedicínských projektů byla vyvinuta řada různých protilátkových mikročipů, z nichž některé jsou již komerčně dostupné. V tomto článku jsme shromáždili některé reprezentativní studie za posledních 7 let (tabulka 1) a uspořádali jsme náš přehled do dvou částí podle zaměření projektů: studie zaměřené na základní biologii a klinický výzkum. Jelikož je prakticky nemožné obsáhnout všechny nedávné aplikace protilátkových mikročipů, zaměřili jsme se na ty aplikace, které jsme považovali za velmi zajímavé, a na zjištění s důležitým klinickým významem.

Základní výzkum

Související se signálními drahami

Změny v signálních drahách jsou charakteristickým znakem mnoha chorobných stavů, včetně rakoviny , diabetu a neurodegenerativních poruch. Sestavení soustav protilátek pomocí záchytných činidel zaměřených na proteiny v signalizační kaskádě, která je předmětem zájmu, umožnilo vědcům zkoumat změny v profilech proteinů a modifikace v signalizačních drahách při normálních biologických procesech a chorobných stavech. Výzkumníci použili tento koncept na celou řadu materiálů a preparátů biologických vzorků, včetně buněčných lyzátů , tkáňových extraktů a plazmy .

Kalbindin-D28 k (CB), důležitý protein vázající vápník, který funguje jako vápníkový pufr a u kterého bylo zjištěno, že je exprimován v nižších hladinách v mozcích myší a lidí s Alzheimerovou chorobou, ale není známo, zda tyto změny přispívají k dysfunkci související s Alzheimerovou chorobou (AD). Kook a spol. vytvořili transgenní myš s deficitem CB u Alzheimerovy choroby (CBKOTg), aby prozkoumali příspěvek CB k signálním drahám u AD . S využitím protilátkových mikročipů ke zkoumání mozkové tkáně myši identifikovali významné změny v drahách buněčné smrti, synaptického přenosu a signálních drahách MAPK po odstranění CB. Tato zjištění byla ověřena pomocí imunohistochemie, která prokázala zvýšený výskyt apoptotických markerů a zvýšenou neuronální smrt, což ukazuje, že protilátkové mikročipy mohou poskytnout nové informace a zlepšit tak naše chápání úlohy CB a jeho vlivu na patofyziologii AD.

Protilátkové mikročipy byly použity k odhalení fyziologické úlohy u vysoce konzervovaných proteinů, včetně elongačního faktoru 4. Na základě těchto poznatků bylo zjištěno, že CB je ve fyziologické fyziologii důležitý. Gao a spol. rozpitvali mechanismus kontroly kvality faktoru mitochondriálního elongačního faktoru 4 (mtEF4) při translaci pomocí mikročipu s protilátkami fosfo-explorer . Porovnáním buněčných lyzátů mezi tkáněmi varlat myší s vyřazeným mtEF4 a WT zjistili, že obohacení násobků mTOR bylo nejvyšší z různých signálních drah. Autoři ukázali, že při deleci mtEF4 je hlavním zpětnovazebním signálem ze somatické cytoplazmy upregulace mTOR. Ta byla doprovázena zvýšenou cytoplazmatickou translací, což naznačuje, že mTOR hraje klíčovou roli jako následný efektor kompenzující nedostatek mitochondriální translace . Studie navíc propojila dříve nepopsané vzájemné vazby mezi kontrolou kvality závislou na mtEF4 v mitochondriích a dráhou mTOR v cytoplazmě.

Lékový mechanismus

Pomocí protilátkových microarray testů mohou vědci systematicky a efektivně zkoumat lékové mechanismy. Z mnoha možných aplikací byla studována angiogeneze vyvolaná nádorem, protože hraje klíčovou roli při progresi rakoviny . P11, nový peptidový ligand obsahující vazebný motiv PDZ (Ser-Asp-Val) s vysokou afinitou k integrinu αvβ3, byl identifikován z hexapeptidové knihovny (PS-SPCL) pomocí protilátkového mikročipu . Farmakologický mechanismus P11 byl objasněn pomocí speciálně navrženého farmakoproteomického mikroarray přístupu obsahujícího 48 protilátek souvisejících s rakovinou . Studie odhalila, že P11 inhibuje proliferaci endoteliálních buněk lidské pupečníkové žíly indukovanou bFGF prostřednictvím inhibice mitogenem aktivované proteinkinázy a extracelulárním signálem regulované kinázy. Kromě toho mikročipy odhalily, že P11 způsobuje upregulaci apoptotického markeru p53 a vede k indukci apoptózy prostřednictvím aktivace systému kaspáz, což naznačuje, že P11 může hrát klíčovou roli v prevenci progrese nádoru. Spojení mezi P11 a p53 představuje klinickým a základním výzkumníkům rakoviny pomůže objasnit další stopy o roli P11 a jeho inhibičním cíli.

Lovastatin, přírodní produkt získaný z Aspergillus terreus nebo Monascus ruber, je v klinice široce používán jako lék snižující hladinu cholesterolu. Yang a spol. použili protilátkový mikročip obsahující 656 protilátek se zaměřením na různé funkční buněčné dráhy, který naznačil, že lovastatin má také protinádorové vlastnosti, a to prostřednictvím nedostatečně definovaných mechanismů. Existuje silná potřeba nalézt účinné léky proti rakovině a pochopit mechanismy jejich účinku. Pomocí mikročipu byly studovány buňky karcinomu prsu v hypoxických podmínkách, aby se prozkoumaly molekulární mechanismy, jejichž prostřednictvím lovastin vykazuje svůj účinek. Ukázalo se, že u buněk karcinomu prsu léčených lovastatinem došlo v porovnání s kontrolou k regulaci 17 proteinů směrem nahoru a 20 proteinů směrem dolů, a výsledky byly následně ověřeny pomocí PCR v reálném čase . Proteinový podpis zahrnoval proteiny zapojené do apoptózy, buněčné proliferace a metastazování nádorů, což dává modulaci těchto drah do souvislosti s farmakologickým účinkem lovastinu.

Lék na cukrovku 2. typu metformin, má podle návrhu také protinádorové vlastnosti. Lee a spol. zkoumali účinnost nových derivátů metforminu pomocí protilátkového mikročipu sestaveného ke studiu molekul souvisejících s buněčným cyklem. Autoři prokázali, že metformin-butyrát (MFB) má lepší protinádorovou účinnost než metformin-HCl, a to díky větší neoplastické aktivitě a lepší účinnosti při narušení progrese buněčného cyklu během fází S a G2/M, navíc se zdá, že má preferenční cytotoxické účinky na populace kmenových buněk karcinomu prsu . Tato zjištění zdůrazňují, jak mohou protilátkové mikročipy poskytnout proteomické důkazy podporující vývoj léčiv s lepší účinností.

Pro základní biologický výzkum mohou protilátkové mikročipy sloužit při detekci signálních proteinů a proteinů spojených s určitým fenotypem. Mřížky s paralelní detekcí proteinů vytvářejí příležitost ke zkoumání více signálních drah v jednom experimentu, což umožňuje nahlédnout do nových mechanismů, například při studiu progrese onemocnění, interakce s léky a reakce na infekce.

Klinický výzkum

Analýza klinických vzorků na úrovni proteinů umožní zlepšit diagnostické markery a nasměrovat možnosti léčby. Vzhledem k tomu, že se proteiny podílejí na většině buněčných procesů, může analýza proteinů poskytnout biologickou signaturu onemocnění a získat tak podrobné informace o aktuálním stavu buňky, orgánu nebo systému. Mikročipy protilátek mohou poskytnout průvodce aktuálními změnami biologických procesů během zdraví a nemoci v reálném čase. V této části uvedeme příklady použití protilátkových mikročipů při zkoumání klinických kohort, především při analýze vzorků séra a plazmy. Není možné obsáhnout všechny aspekty využití protilátkových mikročipů pro klinický výzkum, zde se zaměříme pouze na několik nejdůležitějších onemocnění, tj. autoimunitní onemocnění, infekční onemocnění, rakovinu a neurodegenerativní onemocnění.

Autoimunitní onemocnění

Diagnostika systémového lupus erythematodes (SLE) je náročná vzhledem k jeho heterogennímu klinickému obrazu a nedostatku spolehlivých biomarkerů, které by jej odlišily od aktivního a neaktivního onemocnění i od jiných autoimunitních onemocnění. Lin a kol. provedli DotScan™ mikroarray screening protilátek v mononukleárních buňkách periferní krve od 60 pacientů se SLE s různou aktivitou onemocnění, 25 pacientů s revmatoidní artritidou, 28 vzorků jiných autoimunitních onemocnění a 24 zdravých kontrol. Protilátkové microarray profily dokázaly odlišit aktivní pacienty se SLE od zdravých kontrol. Použití pole pro zachycení leukocytů zlepšilo diskriminační schopnost konvenční diagnostiky SLE tím, že ověřilo sérové anti-dsDNA, komplementy C3 a C4, mikročipy zvýšily schopnost rozlišení semiaktivního a aktivního SLE, což je informace, která pomůže lepšímu managementu onemocnění.

V jiné studii Carlsson a kol. zkonstruovali 135 lidských rekombinantních jednořetězcových proměnných fragmentů (scFv) zaměřených na imunitní proteiny za účelem vytvoření vlastního protilátkového mikročipu. V této studii zkoumali pacienty se systémovou sklerózou (SSc), SLE a 15 zdravých dobrovolníků. SSc je autoimunitní onemocnění postihující spojovací tkáně, které může být náročné odlišit od SLE. Pomocí array bylo identifikováno 40 diferenciálně exprimovaných proteinů, které vytvořily kandidátní proteomový podpis pro odlišení SLE a jeho závažnosti od SSc. Tento proteinový podpis byl lepší klasifikací onemocnění než jednotlivé nebo dokonce kombinace konvenčních klinických parametrů, včetně ANA, anti-DNA, SLEDAI-2 k, C1q, C3, C4 a CRP, což ilustruje potenciální využití protilátkových mikročipů k vytvoření nových podpisů onemocnění, které budou mít přidanou klinickou hodnotu pro léčbu onemocnění.

Infekční onemocnění

Infekce aktivují imunitní systém různě a tyto mechanismy lze zkoumat pomocí protilátkových polí na úrovni celého proteomu. Helicobacter pylori je patogen, který kolonizuje zhruba polovinu světové populace, což způsobuje chronickou gastritidu. Sukri a spol. použili DotScan™ antibody microarray ke stanovení tolerance imunitního systému vůči nádorovým buňkám u karcinomu žaludku pomocí 144 CD protilátek k profilování distribuce CD markerů mezi buňkami žaludečního adenokarcinomu infikovanými Helicobacter pylori a neinfikovanými. Zajímavé je, že zjistili, že buněčná linie žaludečního adenokarcinomu AGS infikovaná cagA + H. pylori vykazuje zvýšenou expresi CD27, která je nezbytná pro udržení populace T buněk, a zvýšené CD markery byly zjištěny také u pacientů s karcinomem žaludku infikovaným H. pylori. Tato studie naznačuje nejen toleranci imunitního systému vůči rakovině žaludku, ale také variace imunitní odpovědi využívané různými kmeny H. pylori.

Dále mohou být protilátkové soustavy užitečné při sledování průběžné změny fyziologického prostředí, včetně stavu onemocnění a odpovědi na terapie a intervence. Po transplantaci jater bylo u 94 % pacientů zjištěno histologické poškození vyvolané virem hepatitidy C (HCV), přičemž u některých pacientů došlo k závažné recidivě onemocnění . Existuje naléhavá potřeba prediktivních biomarkerů k identifikaci závažnosti recidivy onemocnění. Pomocí mikročipu protilátek proti CD byla vyšetřena periferní krev pacientů definovaných jako skupina před transplantací, časná, střední a pozdní transplantace s cílem předpovědět závažnost rekurence HCV po transplantaci . Sériové vzorky krve odebrané pacientům před transplantací jater a po ní umožnily sledovat prostředí onemocnění s vlastními vnitřními kontrolami. Pět CD markerů (CD27, CD182, CD260, CD41 a CD34) bylo významně zvýšeno u těžké rekurence ve srovnání s mírnou rekurencí. Tento výsledek ukazuje, že protilátkové matice mohou pomoci při posuzování závažnosti rekurentního onemocnění HCV po transplantaci jater.

Ellmark a kol. navrhli mikroarray s jedním rámcem rekombinantních protilátek (SinFabs) obsahující 127 různých protilátek proti imunoregulačním antigenům vybraným z knihovny n-CoDeR na adenokarcinom žaludku. Objasnili, že z plazmatických proteomů lze identifikovat odlišné expresní znaky proteinů spojených s nádorem i infekcí, jako jsou IL-9, IL-11 a MCP-4, které slouží jako potenciální biomarkery. Tato zjištění mohou přispět k lepšímu pochopení rakoviny vyvolané H-pylori a mohou v budoucnu vydláždit cestu ke zdokonalené diagnostice.

Byly provedeny soustavy protilátek na bázi kuliček ke zkoumání rozdílných proteinových profilů v plazmě u dětí trpících malárií a komplikacemi souvisejícími s malárií . Z 1000 vyšetřených proteinů mělo 41 proteinů rozdílnou expresi mezi dětmi nakaženými malárií a kontrolními skupinami v komunitě. Třináct dalších proteinů bylo spojeno se závažností onemocnění malárií. Tato zjištění naznačují zapojení zánětu i nevyrovnaného metabolismu glukózy u těžkých forem onemocnění a největší změny byly pozorovány u dvou svalových proteinů (karboanhydráza 3 a kreatinkináza) poukazujících na poškození a léze svalů u dětí s mozkovou malárií. Tato zjištění mohou pomoci při vývoji jednoduchých testů pro klasifikaci dětí nakažených malárií do skupiny vykazující vyšší riziko těžké formy onemocnění.

Rakovina

Mikrotransformace protilátek byly použity pro výzkum rakoviny především ke studiu progrese rakoviny a kandidátních proteinů, které mohou sloužit jako diagnostické biomarkery . Rakovina slinivky břišní je agresivní onemocnění se špatnou prognózou a biomarkery specifické pro toto onemocnění, které nabízejí včasnou a přesnou diagnózu, jsou naléhavě potřebné. Pomocí vlastnoručně vyvinuté platformy pro mikroarray rekombinantních protilátek provedli Wingren a spol. screening sér 148 pacientů s rakovinou slinivky břišní, chronickou pankreatitidou, autoimunitní pankreatitidou (AIP) a zdravých kontrol. Identifikovali panel 25 proteinových cílů, včetně IL-2, IL-11, IL-12, TNF-, které přispěly k rozlišení karcinomu pankreatu od zdravých kontrol. Tento podpis 25 proteinů vykazuje vysoký diagnostický potenciál (AUC 0,88). Kromě toho skupina nedávno rozšířila analýzu svého panelu na další soubory vzorků, včetně lymfomu , karcinomu prostaty a karcinomu prsu v buněčných lyzátech a plazmě . Tato zjištění jsou užitečná pro pomoc při vývoji nových a vícerozměrných diagnostických metod.

Jednou z nejdůležitějších otázek v biologii rakoviny, je určení invazivity nádoru. V jedné studii byla vyvinuta přizpůsobená platforma protilátkového mikročipu obsahující 4096 prvků k vyšetřování vzorků plazmy zahrnujících preinvazivní a invazivní onemocnění z myšího modelu duktálního adenokarcinomu pankreatu (PDA) . Zjistili proteinový podpis, který se skládá z rozdílné exprese tří proteinů, ERBB2, TNC a ESR1, který lze použít ke zlepšení AUC z 0,86 (95% interval spolehlivosti 0,76-0,96) na 0,97 (95% CI 0,92-1,0) při zahrnutí markeru PDA CA19-9.

Většina nově diagnostikovaných případů karcinomu močového měchýře je nízkého stadia, nízkého stupně, neinvazivní . Po standardní transuretrální resekci recidivuje 50-70 % nádorů, avšak 10-30 % nádorů progreduje do svalově invazivního onemocnění . Pochopení mechanismu progrese nádoru by mohlo přinést více užitečných informací pro klinickou praxi. Srinivasan a kol. studovali buněčné lyzáty s protilátkovým mikročipem obsahujícím 810 protilátek souvisejících s rakovinou, který zkonstruovala Hoheiselova laboratoř . Autoři sestavili vícerozměrný klasifikátor obsahující 20 proteinů, který usnadnil předpověď recidivy se senzitivitou 80 % a specificitou 100 %. Zajímavé je, že u recidivujícího karcinomu zjistili potlačení signální dráhy TGF-β . Signální faktory IFNG, TNF-α a THBS1 byly exprimovány méně a abundance inhibitoru MAPK3 (známého také jako ERK1) byla vyšší, zatímco SMAD2, SMAD3 a SMAD4 byly opět výrazně méně zastoupeny . Tato data naznačují, že inhibitory signální dráhy TGF-β mohou snížit recidivu rakoviny močového měchýře .

Puig-Costa et al. použili k objevení biomarkerů rakoviny žaludku (GC) protilátkové mikročipy. Pozoruhodné je, že protilátkový mikročip obsahoval protilátky zaměřené na různé dobře známé funkční proteiny, které hrají klíčovou roli při progresi rakoviny, včetně 120 cytokinů, 43 angiogenních faktorů, 41 růstových faktorů, 40 zánětlivých faktorů a 10 metaloproteináz. Analýza cest Ingenuity potvrdila, že některé biomarkery, například ICAM-1 a angiogenin, ukazují na vysokou zánětlivou reakci u pacientů s GC. Bylo zjištěno, že u pacientů s GC jsou nadměrně zastoupeny cíle buněčného pohybu a pohybu imunitních buněk, jako je monocytární chemoatraktantový protein (MCP)-1 . Pozitivní prediktivní hodnota v této validační kohortě byla 75 % (95% CI 53-90) a negativní prediktivní hodnota 80 % (95% CI 56-94). A konečně, analýzy protilátkových mikročipů zánětlivého proteomu spojeného s GC identifikovaly 21proteinový zánětlivý proteinový podpis karcinomu žaludku (INPROGAS), který přesně rozlišoval GC od nenádorové žaludeční sliznice a může poskytnout nová vodítka pro analýzu progrese karcinomu.

U karcinomu prostaty použili Schwenk et al. protilátkové soustavy na suspenzních kuličkových soustavách k porovnání plazmatických hladin proteinů mezi různými skupinami s cílem najít vedle prostatického specifického antigenu (PSA) další biomarkery. Kromě klasifikace pacientů na základě PSA identifikovali sníženou plazmatickou hladinu CNDP1 a v následných rozsáhlejších studiích se ukázalo, že tato asociace je u agresivnějších forem onemocnění. K ověření těchto zjištění byla vyvinuta sendvičová imunoanalýza u více než 1 200 pacientů a dále byla objasněna souvislost snížené hladiny CNDP1 s metastázami v lymfatických uzlinách . To dokládá jednu z mála studií, která úspěšně potvrdila počáteční indikaci pomocí protilátkového mikročipu a vývoje cíleného testu. Při následném zkoumání nádorové kachexie bylo zjištěno, že plazmatické hladiny CNDP1 jsou u pacientů s kachexií snížené, což poukazuje na metabolickou roli změn hladin CNDP1 .

Ve studii neuroendokrinních nádorů tenkého střeva zkoumali Darmanis et al. plazmatické hladiny dvou nezávislých studijních souborů (77 a 132 vzorků) a cílenou kuličkovou array pro 124 jedinečných proteinů. Pomocí panelu proteinů dokázali dosáhnout klasifikační přesnosti až 85 % a na závěr navrhli nové kandidáty pro klasifikaci nádorů. U kandidátů z užšího výběru, například u IGFBP2 a IGF1, skupina provedla testy ELISA, aby potvrdila indikace. Tato zjištění naznačují metabolickou souvislost plazmatických proteinů s rakovinou a podporují zvážení těchto cílů v budoucích studiích rakoviny.

Neurodegenerativní onemocnění

Analýza exprese proteinů poskytuje možnost rozšířit současné znalosti o neurodegenerativní patofyziologii . Nedávné pokroky v oblasti proteomiky nabídly možnost hledat nové biomarkery pomocí protilátkových mikročipů . Pokrok ve vývoji protokolů umožnil výzkumníkům studovat nejen krev, ale také mozkomíšní mok (CSF) .

V rámci neuroproteomiky provedla Nilssonova laboratoř několik studií s použitím protilátek z Human Protein Atlas spolu s testy suspenzních kuličkových polí. Profilování CSF od pacientů s roztroušenou sklerózou (MS), našli GAP43, cytoplazmatický protein podílející se na tvorbě, a regenerace neuronů, tedy slibný biomarker onemocnění mozku . Nedávno Remnestål a kol. porovnávali hladiny proteinů ve 441 vzorcích CSF odebraných z různých souborů vzorků neurodegenerativních onemocnění a CSF odebraných post mortem. Mezi 376 protilátkami bylo zjištěno, že synaptické proteiny GAP43 a NRGN jsou spojeny s pacienty s AD ve srovnání s kontrolami.

Při použití vzorků plazmy, CSF a mozkové tkáně od pacientů trpících RS byl proveden rozsáhlý screening, který začal využitím 4500 protilátek na korálkových maticích . Bylo zjištěno, že soubor proteinů je spojen s podtypy RS v CSF a plazmě. Využití některých kandidátních protilátek zvýšených proti IRF8, IL7 a METTL14 také pro imunofluorescenční analýzu mozkové tkáně ukázalo barvení neuronů v blízkosti lézí RS. To naznačuje, že protilátky vybrané z analýz založených na matricích pro analýzu tělních tekutin mohou také poskytnout další důkazy u postižené tkáně.

Nakonec byly matrice s kuličkami použity k profilování plazmy pacientů trpících amyotrofickou laterální sklerózou (ALS) , kde bylo 367 pacientů s ALS a 101 kontrol analyzováno na 278 proteinů. V závěru studie byly jako cenné proteiny navrženy neurofilamentový střední polypeptid (NEFM), rodina přenašečů solutů 25 (SLC25A20) a regulátor G-proteinové signalizace 18 (RGS18), protože se podílejí na procesech souvisejících s patofyziologií onemocnění, což vyžaduje další ověření v nezávislých souborech vzorků.

.