Specifické protilátky potřebují specifické ověření

Jedním z nejvyužívanějších nástrojů v biomedicínském výzkumu je monoklonální protilátka. Tyto proteiny mají potenciál vyhledat a navázat se na jakýkoli požadovaný cíl a lze je použít pro zobrazování buněk, třídění buněk, imunoanalýzy a mnoho dalších aplikací.

Tito laboratorní tažní koně však ne vždy fungují věrně. V závislosti na povaze svého cíle může být protilátka v některých testech nekonzistentní – například se naváže na nesprávný cíl a poskytne falešně pozitivní výsledky. Vzhledem k rozšířenosti používání protilátek ve výzkumu je to potenciálně problém za miliardy dolarů.

Hlavním cílem je vyvinout strategie validace protilátek, aby výzkumníci měli jistotu, že protilátka je vhodná pro jejich konkrétní potřeby – a že jejich výsledky budou reprodukovatelné.

Thermo Fisher Scientific vyvinula dvoudílnou platformu validace protilátek, která testuje nejen specifičnost protilátek InvitrogenTM (že se vážou na správný cíl), ale také jejich vhodnost pro různé aplikace. Stejný test však není vhodný pro všechny protilátky: Thermo Fisher používá vhodný test pro každý proteinový cíl v závislosti na jeho biologické funkci. Některé protilátky bude nejlépe testovat pomocí CRISPR-Cas9 k vyřazení genu, který kóduje cílový protein, a kontrole, zda se protilátka již na nic neváže. Jiné protilátky lze testovat pomocí imunoprecipitace s následnou hmotnostní spektrometrií, aby se ověřilo, že se vážou na správné cíle.

Thermo Fisher vyvíjí a zdokonaluje testy validace protilátek na základě biologické funkce cílového antigenu. Zde jsou dvě případové studie specifických proteinů a testů jejich specifičnosti.

Knock-outs pro rakovinu

Receptor epidermálního růstového faktoru (EGFR) je dobře prozkoumaný protein: dysregulace v dráze EGFR se podílí na různých druzích rakoviny. Aby bylo možné otestovat, zda jsou protilátky specifické pro EGFR nebo pro některý z jeho následných cílů, mohou vědci vyřadit kritické proteiny v dráze EGFR a sledovat, jak se změní signál vazby protilátek.

V posledních letech se systém CRISPR-Cas9 stal známým jako nejspolehlivější a nejúčinnější způsob vyřazení genu. Díky tomu je ideální pro testování specifičnosti protilátek v rámci signální kaskády. Výzkumníci společnosti Thermo Fisher vzali standardní linii lidského karcinomu (A-431) a použili western blot k získání základní hodnoty vazebného signálu. Poté použili CRISPR-Cas9 k odstranění cílového genu a vytvoření knockoutů EGFR. Western blot bílkovin extrahovaných z těchto knockoutovaných buněk ukázal, že již neexistuje žádný signál pro cílový protein (obrázek 1).

Další testy výsledek potvrdily. Signalizační kaskáda za EGFR zahrnuje proteiny jako RAS, RAF, MEK a ERK. Aktivace EGFR epidermálním růstovým faktorem (EGF) vede k fosforylaci těchto downstream proteinů, které lze detekovat pomocí dalších protilátek rozpoznávajících tyto fosforylované stavy. Přidání EGF k buňkám s vyřazeným EGFR by však nemělo vést k žádné fosforylaci následných řetězců. Přidání stejných protilátek, které rozpoznávají fosforylované cíle, nevedlo k žádným signálům. Výzkumníci společnosti Thermo Fisher jsou tedy přesvědčeni, že protilátka proti EGFR je specifická pro daný cíl.

Řada modifikací

V buněčném jádře je DNA pevně zabalena – omotána kolem histonových proteinů a tvoří chromatin. Studium histonů je obtížné, protože mohou být ovlivněny řadou chemických změn, známých jako posttranslační modifikace (PTM). Například zbytky na histonu mohou získat jednu nebo více metylových, acetylových nebo fosforylových skupin, z nichž každá má vliv na buněčnou funkci.

Některé techniky, jako je imunoprecipitace chromatinu (ChIP), western blotting, imunofluorescence a imunohistochemie, používají protilátky proti specifickým histonovým PTM, aby pochopily stav histonu a jeho vazbu. Několik modifikací histonů má však podobné vzorce vazby na DNA; protilátka, která nebyla důsledně testována proti všem PTM histonů, se může vázat na nesprávný typ a poskytnout falešně pozitivní výsledek.

Thermo Fisher testovala své protilátky specifické pro PTM histonů pomocí řady peptidů nesoucích různé PTM. Pokud je protilátka skutečně specifická pro jednu PTM, bude se vázat pouze na ty skvrny, které nesou tuto PTM. Výzkumníci společnosti Thermo Fisher měřili signály pomocí faktoru specifičnosti: průměrná intenzita všech skvrn obsahujících určitou PTM dělená průměrnou intenzitou všech skvrn bez ní (obrázek 2). Protilátky vykazovaly 4 až 190krát vyšší faktor specifičnosti pro cílový stav PTM než pro necílové stavy, což dává jistotu, že jsou vysoce selektivní.

Thermo Fisher má sedm dalších testů specifičnosti kromě genetického vyřazení a peptidových polí. Patří mezi ně použití RNAi k vyřazení genové exprese, diferenciálně zvýšené protilátky k nezávislému ověření zacílení a přirozeně se vyskytující proměnné exprese k potvrzení specifity. Pouze díky takto pečlivému a přísnému testování si mohou být výzkumní pracovníci jisti, že jejich laboratorní pracovní koně jsou vhodní pro daný účel – a že jejich práce obstojí i při nejpřísnějším zkoumání.

Poznámky k aplikacím těchto protilátek Invitrogen a další informace o dvoudílném přístupu k testování společnosti Thermo Fisher Scientific najdete zde.