A More Accurate Approach to Amyloid Detection and Subtyping: Combining in situ Congo Red Staining and Immunohistochemistry

Abstract

Amyloidos är resultatet av olika, på olika sätt angripbara sjukdomar. Det är viktigt att subtypera amyloidavlagringarna för att kunna fastställa och slutligen behandla den underliggande sjukdomen på rätt sätt. Förutom den klassiska färgningen med Kongoröd behövs ytterligare förfaranden som immunohistokemisk färgning för klassificering. Här presenterar vi ett mer exakt tillvägagångssätt med hjälp av dubbel färgning med Kongorött/immunohistokemisk färgning som är lätt att tillämpa i rutindiagnostik. Det krävdes ändringar av tekniken för färgning med Kongorött och de immunohistokemiska förfarandena för att kombinera båda färgningsförfarandena på ett och samma objektglas. Utvärderingen gjordes med hjälp av konventionell ljus- och fluorescensmikroskopi. Genom att förkorta färgningstiden för Kongorött till 10 s och genom att ändra den endogena peroxidasblockeringen kunde korrekta resultat erhållas för att utvärdera den dubbla färgningen av Kongorött/immunohistokemi med hjälp av ett fluorescensmikroskop. Sektioner med en tjocklek på 2 μm i stället för 4 μm var bättre för utvärdering, eftersom de ökade färgningsspecificiteten. Kombinationen av Kongoröd och immunohistokemi som in situ dubbelfärgning på ett objektglas är ett genomförbart tillvägagångssätt vid diagnos av amyloidos. Det gör det möjligt att fokusera på de fluorescerande kongoröd-positiva områdena vid utvärdering av immunohistokemi, vilket gör att man undviker att signera ut falskt positiva resultat. Dessutom ökar det signal-brusförhållandet för de immunohistokemiskt färgade sektionerna vid konventionell mikroskopi.

© 2016 S. Karger AG, Basel

Introduktion

Amyloidos är den morfologiska beskrivningen av avlagringarna av felaktigt veckade proteiner som kan hittas i många olika vävnadstyper . De proteiner som bildar amyloid kommer från en mängd olika källor, allt från tumörer, som plasmacellsneoplasmer eller medullära sköldkörtelkarcinom, till kroniska infektioner, eller ses som ett resultat av åldrande. I sällsynta fall beror amyloidos på genetiskt nedärvda störningar av felveckning av proteiner . Den kliniska betydelsen av amyloidos sträcker sig från tillfälliga fynd vid obduktioner till livshotande sjukdomar. När patologer undersöker vävnadsprover är det viktigt att hålla sannolikheten för amyloidavlagringar i åtanke, eftersom detta kan vara den första ledtråden till en ännu okänd allvarlig underliggande sjukdom. Även om det finns lovande resultat när det gäller terapier som är inriktade på själva amyloidavlagringarna är behandlingsmetoderna vid amyloidos fortfarande främst inriktade på den underliggande sjukdomen, och i de flesta fall kan och måste detta i sin tur bestämmas på grundval av subtypisering av amyloid.

Den klassiska histokemiska färgningen för amyloid är Kongoröd, som introducerades av Bennhold 1922 ; den typiska ”äppelgröna” dubbelbrytningen med hjälp av polarisation beskrevs för första gången 1927 . För att öka känsligheten och specificiteten hos Kongorödfärgningen har flera metoder använts, bland annat utvärdering av Kongorödfärgade snitt med fluorescerande ljus på grund av de kända fluorescerande egenskaperna hos Kongoröd . Alldeles nyligen har metoder som använder en digitalt förstärkt hematoxylin-eosin-polariseringsteknik föreslagits för amyloiddetektion , vilket är särskilt användbart för att identifiera amyloid i fall där det finns lite vävnad att tillgå.

Guldstandarden för subtypning av amyloid är immunohistokemi, inklusive flera väletablerade protokoll ; det finns dock vissa brister, särskilt med tanke på den sämre specificiteten hos antikroppar mot den amyloidogena lätta kedjan lambda. Ett nytt tillvägagångssätt för subtypning av särskilt sällsynta varianter av amyloidos är masspektrometri, men på grund av kostnads- och tillgänglighetsproblem har denna lovande metod tyvärr inte använts i någon större utsträckning hittills, och en ytterligare brist är dess uppenbara begränsning i fall där det finns lite vävnad tillgänglig eller med en begränsad mängd avlagrad amyloid. En annan nyligen uppnådd framgång är användningen av immunelektronmikroskopi av bukfettaspirat för subtypning av amyloidavlagringar; detta är dock en sofistikerad metod.

Flera tidigare studier har fokuserat på kombinationen av fluorescens och immunohistokemi . Här presenterar vi ytterligare bevis för att ett sådant tillvägagångssätt är praktiskt genomförbart och rapporterar ett protokoll som lätt kan översättas till rutin, vilket gjorde det möjligt för oss att noggrant ta itu med subtypning av amyloid på formalinfixerade och paraffinininbäddade vävnader. Kongoröd/immunohistokemisk dubbelfärgning gör det möjligt att fokusera på de kongoröd-positiva områdena vid utvärdering av immunohistokemi och ökar signal-brusförhållandet för de immunohistokemiskt färgade sektionerna vid konventionell ljusmikroskopisk utvärdering, vilket förbättrar både förfarandets specificitet och känslighet samt minskar den mängd vävnad som behövs för diagnostik.

Material och metoder

Utval av fall

Preparat med en bevisad diagnos av amyloidos från vårt arkiv användes för att etablera den nya tekniken. De listas i tabell 1 inklusive de steg som respektive vävnad användes till.

Kongorödfärgningsmetoder

Kongorödfärgningen utfördes inledningsvis enligt det etablerade protokollet vid vårt institut: Formalinfixerad och paraffininbäddad vävnad skärs till 6 μm tjocka snitt, deparaffiniseras och färgas med Kongorött i 30 minuter – 2.5 g Kongoröd (Merck Millipore, Darmstadt, Tyskland) och 1 g kaliumhydroxid (Merck Millipore) löses upp i 500 ml 80 % etanol; därefter sköljs sektionerna med kranvatten innan de kontrafärgas med hematoxylin (Merck Millipore) i 4 minuter. I nästa steg differentieras sektionerna i 0,5 % HCl/etanollösning och sköljs återigen med kranvatten i 10 minuter innan de dehydreras och monteras.

För vår studie ändrades protokollet med avseende på färgningstiden för Kongoröd för att se vilken inverkan kortare färgningstider skulle kunna ha på den efterföljande immunohistokemiska färgningen. Sektioner med en tjocklek på 2 och 4 μm testades också.

Immunohistokemisk färgning och blockering av endogent peroxidas

De immunohistokemiska färgningsförhållandena för de olika amyloidsubtyperna anges i tabell 2. Enligt tillverkarens förslag användes två olika kloner för detektion av de amyloidogena lätta kedjorna kappa respektive lambda. Immunohistokemi utfördes efter färgning med Kongoröd. Kort sagt, deparaffinerade och endogent peroxidas blockerade objektglas (se senare) inkuberades i normal häst (för AA-amyloidfärgning) eller normalt getserum (för alla andra färgningar)/Trisbuffrad saltlösning (TBS) (900 μl serum/60 ml TBS) i 30 minuter i rumstemperatur (båda serumen från Vector Lab., Burlingame, Calif., USA) och sedan inkuberas över natten med den primära antikroppen vid 4 °C, sköljs och inkuberas med biotinylerat anti-mus-IgG (för färgning av amyloid AA) eller biotinylerat anti-kanin-IgG (för alla andra färgningsförfaranden) lösning (300 μl IgG/900 μl normalt häst- eller getserum/60 ml TBS; båda IgG från Vector Lab.) i 30 minuter i rumstemperatur. Slutligen sköljdes de och inkuberades med ett avidin-biotin-peroxidas-kit (Vectastain från Vector Lab.) i 30 minuter och visualiserades med hjälp av färdigt 3-amino-9-etylkarbazol (AEC; från Dako, Glostrup, Danmark) som kromogen (10-20 minuter under omedelbar optisk kontroll) och Meyers hematoxylin (från Medite, Dietikon, Schweiz). AEC föredrogs eftersom tidigare experiment visade bättre signal-brus-resultat för AEC-visualisering jämfört med diaminobenzidinvisualisering. Eftersom AEC är vatten- och alkohollösligt täcktes objektglasen med Medi-Mount (från Medite, Burgdorf, Tyskland) i 30 minuter innan de täcktes.

Då den vanliga behandlingen för blockering av endogent peroxidas av vävnader (3 % H2O2-lösning i 70 % etanol) efter att ha avslutat Kongorödfärgningen ledde till att kongofilin försvann, testades ytterligare metoder för blockering av endogent peroxidas, t.ex: Förflyttning av detta steg före Kongorödfärgningen och ersättning av 70 % etanol med destillerat vatten.

Utvärdering

De kongoröda/immunohistokemiska dubbelfärgade sektionerna utvärderades i första hand med hjälp av ett konventionellt ljusmikroskop för att uppskatta om respektive immunohistokemiska kromogenprodukt visualiserades som förväntat, sämre eller bättre jämfört med den diagnostiska rutinfärgningen (utan kongoröd förfärgning). Därefter användes ett fluorescensmikroskop med ett rhodaminfilter (Zeiss Axioskop 40; Zeiss, Göttingen, Tyskland) för att utvärdera fluorescensen hos det kongoröda färgämnet. Områden som visade specifik intensiv fluorescens utvärderades ytterligare med ljusmikroskopi för att se om amyloidavlagringar också kunde detekteras med immunohistokemi i dessa områden.

Resultat

Steg 1: Modifieringar av protokollet för färgning av kongorött färgämne

Det testades flera färgningstider för det kongoröda färgämnet. Detta var nödvändigt eftersom antikropparnas förmåga att binda antigener reducerades av färgningsförfarandet med Kongorött och fullintensivt Kongorött försvårade samtidig utvärdering, eftersom ett rött kromogen (AEC) med en liknande färg som Kongorött användes för immunohistokemi. Genom att tillämpa den ursprungliga färgningstiden på 30 minuter kunde dubbelfränsenhet påvisas för amyloidavlagringar med hjälp av ett polariserat filter på konventionell ljusmikroskopi. När färgningen för Kongoröd endast varade 5, 10 eller 20 s kunde positiva signaler alltid upptäckas när man använde rhodaminfiltret i ett fluorescensmikroskop, medan konventionell mikroskopi endast ibland visade kongofili och dubbelriktning med hjälp av det polariserade filtret (fig. 1). För vidare analys reducerades färgningstiden för Kongoröd helst till 10 s för att undvika överfärgning. 10 s har valts av praktiska skäl (lättare att stadigt följa jämfört med 5 s) i våtlaboratoriet.

Steg 2: Ändringar av de immunohistokemiska protokollen för att kombinera Kongoröd och immunohistokemisk färgning på ett objektglas

I ett första steg utfördes immunohistokemisk färgning på separata sektioner för att bekräfta antigeniciteten hos de vävnader som användes i den här studien, vilket visade tillfredsställande färgningsresultat med hjälp av de etablerade rutinprotokollen som beskrivs i tabell 2.

När man kombinerade Kongorödfärgning (Kongorödfärgningstid på 10 s) med immunohistokemisk färgning på samma sektioner noterades att kongofili försvann efter att de immunohistokemiska förfarandena avslutats med hjälp av den vanliga behandlingen för blockering av endogent peroxidas i vävnader (3 % H2O2-lösning i 70 % etanol), eftersom det kongoröda färgämnet har sköljts ut. I ett tredje steg ändrades därför behandlingen för blockering av endogent peroxidas. Blockering av endogent peroxidas med hjälp av den konventionella metoden, men med användning av den före färgningen med Kongorött, samt ersättning av 70 % etanol med destillerat vatten vid blockering av endogent peroxidas efter färgning med Kongorött, gav tillfredsställande resultat, både för utvärdering av färgning med Kongorött och för immunohistokemisk färgning. För att i så stor utsträckning som möjligt hålla sig till det vanliga arbetsflödet i våtlaboratorier tillämpades metoden att ersätta etanol med destillerat vatten. Försök att utelämna blockering av endogena peroxidaser minskade måttligt signal-brus-resultaten för AEC-visualisering (om man antar att de oblockade endogena enzymerna utnyttjade AEC och å ena sidan färgade något i bakgrunden och å andra sidan berövade ABC-peroxidaskomplexet kromogen för en korrekt visualisering) och utnyttjades därför inte ytterligare. Kvaliteten på den immunohistokemiska färgningen efter förfärgning med Kongoröd var densamma som vid immunohistokemisk färgning utan föregående färgning med Kongoröd; vi drog därför slutsatsen att utförandet av immunohistokemi på sektioner som förfärgats med Kongoröd i 10 s inte leder till förlust av antigenicitet eller till ospecifika färgningsresultat.

Steg 3: Ändringar av sektionstjocklekar

Slutligt undersökte vi betydelsen av olika sektionstjocklekar (2 och 4 μm). Generellt sett var den immunohistokemiska färgningens specificitet och utvärderingsbarhet (signal-brusförhållande) bättre på de tunnare sektionerna; dessutom fanns det färre artefakter när det gäller att vävnad lossnade från objektglasen under färgningsförfarandet. Alla fall visade samma resultat som vid den inledande diagnostiska subtypningen av amyloidavlagringar.

Exempel på implementering av den beskrivna metoden i rutinmässiga diagnostiska förfaranden

Figurerna 2 och 3 illustrerar två rutinfall, där subtypning av amyloid kunde uppnås med hjälp av den nya algoritm som föreslagits i den här studien; genom att endast tillämpa den konventionella tekniken har man inte erhållit några tolkningsbara resultat.

Diskussion

Här presenterar och validerar vi ett kombinerat förfarande för dubbel färgning med Kongoröd/immunohistokemi, som gör det möjligt att fokusera på de Kongoröd-positiva områdena vid utvärdering av immunohistokemi, vilket förbättrar specificiteten för in situ-baserad subtypisering av amyloid. Det bidrar också till att spara vävnad, vilket är ett problem eftersom biopsimaterialet blir alltmer begränsat på grund av förändrade diagnostiska tillvägagångssätt med användning av fina nålkärnor och biopsiforskar.

I motsats till andra föreslagna nya utvärderingstekniker som fokuserar på sofistikerad digitaliserad bildutvärdering , kan vårt tillvägagångssätt enkelt införlivas i rutindiagnostik. Förutsättningar omfattar endast modifierande etablerad Kongorödfärgning, tillgänglig amyloid immunohistokemi samt ett fluorescensmikroskop med ett rhodaminfilter. Helst bör man använda mikroskop som är utrustade för både fluorescensmikroskopi och konventionell ljusmikroskopi, eftersom detta förenklar verifieringen av samma (fluorescerande) områden av intresse för amyloidavlagring när man utvärderar immunohistokemi genom ett enkelt byte av ljuskälla och filter. Två olika mikroskop kan dock också användas, men i svåra fall kan det föreslås att man tar ett foto av respektive område i fluorescens- och ljusmikroskopi för att underlätta utvärderingen.

I överensstämmelse med tidigare studier kunde vi visa att Kongorött inte stör eller stör immunohistokemi . Jämfört med sektionstjocklekar på 4-6 μm som använts i de flesta studier hittills kunde vi dessutom visa att användning av tunnare sektioner på 2 μm, som är fördelaktiga för immunohistokemi (bättre signal-brusförhållande, färre avskiljningsartefakter), också kan leda till tillfredsställande resultat när det gäller kongorödfärgning, om den avläses med ett fluorescensmikroskop.

Det har funnits flera nyligen publicerade artiklar som propagerar användningen av fluorescens för att utvärdera amyloidavlagringar och som visar dess överlägsenhet i förhållande till polariserat ljusmikroskopi genom att den är både mer specifik och mer känslig . I den här studien har vi förfinat och optimerat detta tillvägagångssätt på flera sätt genom att arbeta med ett anpassat protokoll avseende färgningstid, färgningsprocedurer samt snitttjocklek. Dessa förändringar gjorde det slutligen möjligt att utföra en dubbel färgning in situ för både känslig och specifik detektion av amyloidavlagringar och för subtypisering av dessa avlagringar, vilket är avgörande för att särskilja den underliggande sjukdomen som leder till amyloidavlagringar. Vår metod för dubbelfärgning gör det inte bara möjligt att på ett känsligt sätt upptäcka amyloid genom fluorescens och samtidigt specifikt kategorisera exakt dessa avlagringar, utan också att spara material genom att undvika seriella sektioner, där de ibland mycket små amyloidavlagringarna redan kan ha skurits bort. Sedan denna dubbla färgning infördes har vi redan använt detta tillvägagångssätt i flera fall där en slutgiltig diagnos inte kunde ställas med andra metoder. Figurerna 2 och 3 illustrerar två av dessa fall.

Det kan dock fortfarande finnas utrymme för ytterligare perfektion. Eftersom immunoalkalin-fosfatas-baserade detektionssystem som inte behöver blockering av endogent peroxidas för närvarande inte används i vårt immunohistokemiska arbetsflöde, kan ersättning av immunoperoxidas-baserade detektionssystem med de förstnämnda ytterligare förbättra resultaten och göra arbetsflödet i laboratoriet smidigare.

För att sammanfatta presenterar vi ett optimerat och förfinat tillvägagångssätt för dubbelfärgning av kongoröd/immunohistokemisk färgning. Detta tillvägagångssätt är fördelaktigt när det gäller specificitet, kostnader och mängden vävnad som behövs. Dess krav är minimala och bör möjliggöra en utbredd användning.

Acknowledgements

Thomas Menter stöds av Nuovo-Soldati Cancer Research Foundation, Vaduz, Liechtenstein.

Statement of Ethics

Studien omfattar endast arkivmaterial av mänskligt material från Institute of Pathology Basel och godkändes av etikkommittén för Nordvästra och Centrala Schweiz (EKNZ 2014-252). Inga djur har deltagit.

Oppenbarhetsförklaring

Författarna förklarar att de inte har några intressekonflikter.

Författarkontakter

Artikel/Publikationsdetaljer

Upphovsrätt / Läkemedelsdosering / Ansvarsfriskrivning

Upphovsrätt: Alla rättigheter förbehållna. Ingen del av denna publikation får översättas till andra språk, reproduceras eller utnyttjas i någon form eller på något sätt, elektroniskt eller mekaniskt, inklusive fotokopiering, inspelning, mikrokopiering eller genom något informationslagrings- och informationssökningssystem, utan skriftligt tillstånd från utgivaren.
Läkemedelsdosering: Författarna och förlaget har gjort sitt yttersta för att se till att det val av läkemedel och den dosering som anges i denna text överensstämmer med aktuella rekommendationer och praxis vid tidpunkten för publiceringen. Med tanke på pågående forskning, förändringar i statliga bestämmelser och det ständiga flödet av information om läkemedelsbehandling och läkemedelsreaktioner uppmanas läsaren dock att kontrollera bipacksedeln för varje läkemedel för eventuella förändringar i indikationer och dosering och för tillagda varningar och försiktighetsåtgärder. Detta är särskilt viktigt när det rekommenderade medlet är ett nytt och/eller sällan använt läkemedel.
Disclaimer: Uttalandena, åsikterna och uppgifterna i denna publikation är enbart de enskilda författarnas och bidragsgivarnas och inte utgivarnas och redaktörernas. Förekomsten av annonser eller/och produktreferenser i publikationen är inte en garanti, ett stöd eller ett godkännande av de produkter eller tjänster som annonseras eller av deras effektivitet, kvalitet eller säkerhet. Utgivaren och redaktören/redaktörerna frånsäger sig ansvar för eventuella skador på personer eller egendom till följd av idéer, metoder, instruktioner eller produkter som det hänvisas till i innehållet eller annonser.