ABTS
17.4 Fenoler
Oxidation av det klassiska Lac-substratet ABTS av laccaset från Tetracystis aeria är utbrett i klorofyceana alger. Till exempel utsöndrar arter av Moewusinia, inklusive Chlamydomonas moewusii och T. aeria, förmodade ”äkta” Lacs. Fenoliska substrat oxideras av dessa enzymer optimalt vid neutralt till alkaliskt pH. Tetracystis laccas omvandlar effektivt andra föreningar såsom bisfenol A, 17α-etinylestradiol, nonylfenol och triclosan i närvaro av ABTS som redoxmediator, medan antracen, veratrylalkohol och adlerol förblir oförändrade. Eventuella naturliga funktioner hos enzymerna, t.ex. syntesen av komplexa polymerer eller avgiftningsprocesser, kan bidra till algernas överlevnad i ogynnsamma miljöer. I förorenade ytvatten kan Lac-producerande grönalger bidra till nedbrytningen av fenoliska föroreningar i miljön.
Putativ Lac (CotA) från Bacillus pumilus MK001 klonad och uttryckt i E. coli visade sig vara termostabil och uppvisade en halveringstid på 60 minuter vid 80°C och visade potentiell bindningsaffinitet med ferulasyra, koffeinsyra och vanillin.
Fenoler är kända hämmare för cellulas och fermentativa mikroorganismer i bioraffineringsprocesser. Tillsatsen av Lac avlägsnar fenolföreningarna och minskar därefter den fermentativa mikroorganismens fördröjningsfas. Tillämpningen av Lac minskar dock glukosfrisättningen under den enzymatiska hydrolysen. Andelen lignin och sammansättningen av fenoler är nyckelspelare i inhiberingen av cellulas när den enzymatiska hydrolysen kombineras med Lac-avgiftning .
En intressant tillämpning inom miljöbioteknik är immobilisering av Lac för att eliminera fenoliska föroreningar via oxidation. Nanopartiklar av pyrogen kiseldioxid har en intressant potential som stödmaterial för immobilisering av Lac via sorptionsassisterad immobilisering med tanke på tillämpningar som t.ex. eliminering av mikroföroreningar i vattenfaser. Immobilisering av Lac från ett Leviathan-släkte, Coriolopsis polygonal, Cerrena unicolor, P. ostreatus och T. versicolor på nanopartiklar av fumad kiseldioxid, separat eller i kombination, ger en ökad aktivitet över ett pH-område mellan 3 och 7. De olika Lacs skiljer sig åt när det gäller pH-optimering och substrataffinitet. Genom att utnyttja deras skillnader kunde man formulera en skräddarsydd nanobiokatalysator som kan oxidera ett bredare substratområde än de upplösta eller separat immobiliserade enzymerna. Nanobiokatalysatorn har potential för biokemisk oxidation vid eliminering av flera olika föroreningar. Det har bekräftats att icke-vokala nanobiokatalysatorer som erhållits genom Lac-immobilisering på kiseldioxidnanopartiklar har ett brett substratspektrum när det gäller nedbrytning av svårnedbrytbara föroreningar, t.ex. fenoliska EDC:er (bisfenol A) .Detta understryker potentialen hos kompositer av rökade kiseldioxidnanopartiklar/laccase för avancerad biologisk rening av avloppsvatten.
Lacs kan katalysera enelektronoxidation av fenolföreningar till radikala intermediärer som sedan kan kopplas till varandra via kovalenta bindningar. Dessa reaktioner tros spela en viktig roll i humifieringsprocessen och omvandlingen av föroreningar som innehåller fenoliska funktionaliteter i miljön. En reaktionsmodell utvecklades genom integrering av metall-HA-bindningsjämvikter och kinetiska ekvationer, som förutsäger omvandlingshastigheten för triclosan i närvaro av HA och tvåvärda metalljoner inklusive Ca2+, Mg2+, Cd2+, Co2+, Mn2+, Ba2+ och Zn2+ .
Hydroxylerade polybromerade difenyletrar (OH-PBDE:er) har ofta påträffats i den marina biosfären som nya organiska föroreningar. Produktionen av OH-PBDE:er är sannolikt ett resultat av kopplingen av bromfenoxiradikaler, som genereras från den Lac-katalyserade oxidationen av 2,4-DBP eller 2,4,6-TBP. Lac:s omvandling av bromfenoler är pH-beroende och påverkas också av enzymatisk aktivitet. Med tanke på förekomsten av 2,4-DBP och 2,4,6-TBP och den fylogenetiska fördelningen av Lac i miljön kan Lac-katalyserad omvandling av bromfenoler vara en potentiellt viktig väg för den naturliga biosyntesen av OH-PBDE:er .
Phanerochaete chrysosporium tillhör en grupp ligninnedbrytande svampar som utsöndrar olika oxidoreducerande enzymer, inklusive ligninperoxidas (LiP) och manganperoxidas (MnP). Produktionen av Lacs i denna svamp har dock inte helt påvisats och är fortfarande kontroversiell. Samuttrycket av LacIIIb-genen från T. versicolor och vpl2-genen från Pleurotus eryngii samt de endogena generna mnp1 och lipH8 förbättrade samuttrycket av peroxidaser och laccaser upp till fem gånger jämfört med vildtypsarter. De transformerade stammarna har ett brett spektrum av fenoliska/ickefenoliska biotransformationer och en hög procentsats för avfärgning av syntetiska färgämnen i jämförelse med föräldrastammen och är en enkel och effektiv samexpression av Lacs och peroxidaser i lämpliga basidiomycete-arter .
Nyligen har Lac tillämpats på nanobioteknik, som är ett växande forskningsområde, och katalyserar elektronöverföringsreaktioner utan ytterligare kofaktorer .
Kolnanopartiklar är lovande kandidater för enzymimmobilisering. Jämfört med fria Lac har de immobiliserade enzymerna betydligt minskade reaktionshastigheter. Diffusionsbegränsning som induceras av aggregering av kolnanopartiklar kan inte ignoreras eftersom det kan leda till ökade reaktionstider, låg effektivitet och höga ekonomiska kostnader. Dessutom förvärras detta problem när låga koncentrationer av miljöföroreningar förekommer .
Bisphenol A (BPA) är en hormonstörande kemikalie som är allestädes närvarande i miljön på grund av sin breda industriella användning. Extracellulär Lac av den mest odlade svampen i världen (dvs. vitrötad svamp, P. ostreatus) bryter effektivt ned BPA. Exponering för BPA har inga skadliga effekter på denna ätliga svamp.
Borttagningen av BPA med Lac i en kontinuerlig enzymatisk membranreaktor som utvärderades i syntetiskt och verkligt biologiskt behandlat avloppsvatten i en reaktorkonfiguration baserad på en omrörd tankreaktor kopplad till ett keramiskt membran, visade att BPA avlägsnades nästan fullständigt. Polymerisering och nedbrytning är troliga mekanismer för omvandling av BPA med Lac .
Organismer från fylum Basidiomycota har en enorm biologisk saneringspotential genom sina fenoloxidaser vid nedbrytning av fenoler. Lac och tyrosinas finns huvudsakligen i T. versicolor respektive Agaricus bisporus. Nya lovande vildtypsproducenter av enzymer har dykt upp och ett antal rekombinanta stammar har också konstruerats, huvudsakligen baserade på jäst eller Aspergillusstammar som värdar. Konstruktionerna möjliggör tillämpningar för nedbrytning av fenoler, polyfenoler, kresoler, alkylfenoler, naftoler, bisfenoler och halogenerade (bis)fenoler. Biologiska och fysikalisk-kemiska metoder skulle kunna kombineras för att göra processerna lämpliga för industriell användning.
Plantperoxidaser har en stark potentiell användbarhet för sanering av fenolförorenat avloppsvatten. Storskalig användning av dessa enzymer för rening av fenol kräver billigt, rikligt förekommande och lättillgängligt peroxidasinnehållande material. Potatismassa, en avfallsprodukt från stärkelseindustrin, innehåller stora mängder aktiva peroxidaser, och enzymerna i potatismassa bibehåller sin aktivitet vid pH 4-8 och är stabila inom ett brett temperaturområde. Fenolavskiljningseffektiviteten i potatismassa är över 95 % .
Immobiliserad Lac på nanoporösa kiseldioxidpärlor bryter ner mer än 90 % av 2,4-dinitrofenol på kort tid (12 timmar). Immobiliseringsprocessen förbättrar Lac:s aktivitet och hållbarhet för nedbrytning av föroreningen. Temperaturer över 50 °C minskar enzymaktiviteten till cirka 60 %. pH och mediatorkoncentrationen kunde dock inte påverka enzymaktiviteten. Nedbrytningskinetiken överensstämmer med en Michaelis-Menten ekvation .
Vattenexudat från rajgräs (Lolium perenne) kan bryta ned BPA både i frånvaro och närvaro av naturligt organiskt material (NOM). I exudat med tillsats av NOM är nedbrytningsprocessen längre än utan NOM. Peroxidas- och Lac-aktiviteterna i exudaten tyder på att dessa enzymer har en betydande roll i nedbrytningen av BPA.
Organofluorföreningar har blivit viktiga byggstenar för ett brett spektrum av avancerade material, polymerer, jordbrukskemikalier och läkemedel. Konceptet för införande av trifluormetylgruppen i oskyddade fenoler genom att använda en biokatalysator (Lac), tBuOOH och antingen Langlois-reagens eller Barans zinksulfinat uppnåddes. Metoden bygger på rekombination av två radikala arter, nämligen den fenolradikalkation som genereras direkt av Lac och CF3-radikalen. Den Lac-katalyserade trifluormetyleringen sker under milda förhållanden och bryter ned trifluormetylsubstituerade fenoler som inte var tillgängliga med klassiska metoder .
Lac-producerande sötvattensascomycet Phoma sp. stam UHH 5-1-03 har potential för praktisk avskiljning av mikroföroreningar. Bisfenol A (BPA), karbamazepin (CBZ), 17α-etinylestradiol (EE2), diklofenak (DF), sulfametoxazol (SMX), teknisk nonylfenol (t-NP) och triclosan (TCS) är substrat med rangordning: EE2≫BPA>TCS>t-NP>DF>SMX>CBZ. De erhållna metaboliterna indikerar hydroxylerings-, cykliserings- och dekarboxyleringsreaktioner samt oxidativ koppling som är typisk för Lac-reaktioner. Observationerna tyder starkt på att den extracellulära Lac från Phoma sp. till stor del bidrar till svampens biotransformation .
En ökad uppmärksamhet har ägnats åt nanobiokatalys. Lac som reversibelt immobiliserats på Cu(ΙΙ)- och Mn(ΙΙ)-chelaterade magnetiska mikrosfärer lyckades avlägsna BPA från vatten. I jämförelse med fritt Lac är den termiska stabiliteten och lagringsstabiliteten hos immobiliserat Lac avsevärt förbättrad. Mer än 85 % av BPA avlägsnades under optimala förhållanden.
Det finns dock begränsningar med att använda enzymer i lösning för vattenrening, nämligen att de inte kan återanvändas, att deras livslängd är kort och att kostnaden för engångsanvändning är hög. Chen et al. utvecklade en ny typ av biokatalysator genom att immobilisera svamp-Lac på ytan av jästceller med hjälp av tekniker för syntetisk biologi. Biokatalysatorn kallas Surface Display Lac (SDL) och kan återanvändas med hög stabilitet eftersom den behöll 74 % av den ursprungliga aktiviteten efter åtta upprepade batchreaktioner. SDL:s effektivitet och konceptbevis för behandling av föroreningar som ger upphov till nya problem visades med bisfenol A och sulfametoxazol.