ADAR

C Enzyme-Substrate Recognition

Det är lite känt om hur ADARs interagerar med sina specifika substrat och hur RNA-bindningsdomänerna och den katalytiska domänen arbetar tillsammans under redigeringsreaktionen. I motsats till C-to-U RNA-redigeringsmaskineriet som använder ett primärt sekvensmotiv nära redigeringsstället som kritisk bestämningsfaktor för substratigenkänning (Niswender, 1998) saknar ADAR-enzymerna någon uppenbar inneboende sekvensspecificitet. Faktum är att när ADAR1 och ADAR2 presenteras för helt dubbelsträngade RNA-molekyler kommer de att deaminera nästan promiskuöst upp till 50-60 % av alla adenosiner i sekvensen (Nishikura, 2010). Närvaron av slingor, missmatchningar och utbuktningar i en RNA-substratstruktur ökar dock platsselektiviteten och, som man sett för vissa fysiologiska ADAR-måltavlor, tycks den intrikata RNA-veckningen av ett sådant substrat begränsa åtkomsten för bindning på RNA:t och den produktiva katalysen ofta till ett enda adenosin (Nishikura, 2010). Därför kan större delen av målspecificiteten för A-to-I-redigering ligga i substratets tredimensionella veck. Nya NMR-baserade strukturstudier av ADAR-proteinets RNA-bindningsdomäner i komplex med minimala RNA-substrat tyder dock på att enskilda dsRNA-bindningsdomäner också kan vara involverade i sekvensspecifika kontakter som kan bidra till selektivitet för vissa RNA-mål framför andra (Stefl et al, 2006, 2011).

En annan egenskap hos ADARs som kan ha betydelse för substratigenkänning och interaktion är insikten om att ADAR-proteinerna för produktiv och högaktiv deaminering bildar en dimer på substratet (Jaikaran et al., 2002; Cho et al., 2003; Gallo et al., 2003; Poulsen et al., 2006). Potentiellt kan homo- såväl som heterodimerer mellan ADAR-proteiner bildas (Chilibeck et al., 2006) och representerar därför ytterligare ett lager av reglering som påverkar det substratspecifika erkännandet såväl som RNA-redigeringsaktiviteten. Eftersom det hittills inte finns något känt redigeringsmål för ADAR3 och detta protein inte uppvisar någon enzymatisk aktivitet i standarddeaminasanalyser (Melcher et al., 1996a; Chen et al., 2000), har dess roll föreslagits vara av reglerande karaktär genom heterodimerisering med de andra ADAR:erna.

Relaterat till bildandet av ADAR-dimerer för allmän redigeringsaktivitet är observationen att vissa RNA-redigeringsevenemang som sker inom samma substrat uppvisar positiv eller negativ koppling. Till exempel uppvisar adenosiner som ligger direkt intill varandra eller de som ligger på samma sida av RNA-duplexstrukturen (ca 11 nt avstånd inom A-formigt RNA) ofta koppling vid redigering av ADARs, troligen på grund av deras närhet till enzymets katalytiska plats i rymden (Koeris et al., 2005; Enstero et al., 2009).

Trots dessa insikter är det för närvarande fortfarande inte möjligt att förutsäga en RNA-redigeringsställe utifrån RNA:s primärsekvens. Detta beror främst på den komplexa karaktären hos RNA:s tertiärstrukturer och deras dynamiska beteende. Även om man beaktar att dsRNA-bindningsdomäner kanske kan diskriminera vissa primära sekvensmotiv framför andra, kan små förändringar i den omgivande primära sekvensen eller den sekundära och tertiära strukturen modulera eller till och med åsidosätta de sekvensspecifika kontakterna. Försök att utforma sökalgoritmer som kombinerar flera av de molekylära egenskaper (inklusive sannolikhet för basparning, sekvensmiljö, sekvensbevarande) som är kända för att påverka redigeringssannolikheten eller -aktiviteten för att förutsäga potentiella redigeringsställen har därför resulterat i långa listor över kandidatpositioner i mRNA, men få nya, platsselektiva modifieringsställen på hög nivå har validerats som bona fide in vivo-mål (Clutterbuck et al., 2005; Levanon et al., 2005; Gommans et al., 2008; Sie och Maas, 2009). Dikotomin mellan upptäckten av tusentals sannolika redigeringsställen baserat på molekylära egenskaper i pre-mRNA och bristen på omkodningsställen på hög nivå tyder på att antingen lider förutsägelsealgoritmerna av en hög falsk positivfrekvens och att de flesta av dessa kandidatpositioner inte redigeras av ADAR, eller att den experimentella upptäckten av RNA-redigering är problemet och att för många verkliga redigeringsställen testas fel vävnader (celltypsspecifik redigering) eller att de testas vid fel tidpunkt (reglerad redigering). Alternativt är redigeringsnivåerna in vivo för de flesta av platserna så små att nuvarande detektionsmetoder inte är tillräckligt känsliga för att bevisa eller motbevisa redigering.