Adenylylcyklas

• 1 Funktion
• 2 Introduktion
  • 2.1 Cykliskt adenosinmonofosfat
  • 2.2 Pyrofosfat
• 3 Adenylylcyklas från däggdjur
  • 3.1 Typ II
    • 3.1.1 Struktur
    • 3.1.2 Störningar i överuttryck
• 4 Rv1264 Adenylylcyklas
  • 4.1 Struktur
    • 4.1.1 C-Terminal katalytisk domän
      • 4.1.1.1.1 α1-switch
    • 4.1.2 N-Terminal reglerande domän
      • 4.1.2.1 αN10-switch
  • 4.2 Reglering av pH
  • 4.3 Biologisk roll
• 5 3D-strukturer av adenylylcyklas

Funktion

Adenylylcyklas (ADCY, EC-nummer 4.6.1.1), även känt som adenylatcyklas, är ett enzym som katalyserar cykliseringen av till . Den sker i ett enda, samordnat steg, där syret på ATP:s 3′ hydroxylgrupp nukleofilt angriper alfafosfatet och bildar en fosfodiesterbindning och klyver en pyrofosfatgrupp. I de flesta aktiva platser finns det en sur rest nära 3’OH som fungerar vid deprotoneringen, och basiska rester vid β-fosforen för att sänka gruppens energi för klyvning. Reaktanten i den reaktion som katalyseras av adenylylcyklas är ATP; ATP är den mest förekommande nukleotidtrifosfatet i de flesta celler med typiska koncentrationer som varierar från 1 till 10 mM. Denna höga intracellulära koncentration gör det möjligt för cAMP-koncentrationerna att snabbt stiga som svar på en specifik signal, vilket är viktigt i många signaltransduktions- och metaboliska vägar. Huvudprodukten av denna reaktion är cAMP, med en sidoprodukt i form av PPi. ADCY:s cytoplasmatiska regioner består av dess N-terminal, C1a, C1b, C2a och C2b. C1a och C2a utgör den katalytiska domänen. Den här sidan betonar den mikrobiella adenylylcyklasen Rv1264, men även däggdjurs adenylylcyklaser behandlas mindre ingående.

Adenylylcyklasassocierat protein (CAP) reglerar aktincytoskelettet och celladhesion i alla eukaryoter.

För calmodulin-känsligt adenylatcyklas se Anthrax edema factor.

Introduktion

Det finns tio isozymer av adenylylcyklaser hos däggdjur, adenylylcyklas typ I-X, (ADCY I-X), och många fler hos andra organismer. Alla däggdjurs- och de flesta andra adenylylcyklaser tillhör klass III. De flesta är integrerade membranproteiner och alla producerar cAMP, vars förmåga kan aktiveras eller inaktiveras som svar på vissa förhållanden eller ligander. Alla membranbundna adenylylcyklaser från däggdjur aktiveras av alfaunderenheter av G-proteiner, men reagerar på olika sätt på ligander, t.ex. magnesiumjoner, kalciumjoner och beta- och gammaunderenheter av G-proteiner. En av däggdjurens isozymer och vissa prokaryota former av adenylylcyklas reagerar på miljöförhållanden, främst pH.

Cykliskt adenosinmonofosfat

I däggdjur fungerar cAMP som en sekundär budbärare, en av dess funktioner är att styra aktiviteten hos proteinkinas A (PKA). PKA har i sin tur ganska olika roller i cellerna, medan de flesta av dem är förknippade med ämnesomsättningen spelar PKA också viktiga roller i transkription, cellcykeln och apoptos. Det slutliga ödet för cAMP är dess omvandling till AMP genom klyvning av fosfodiesterbindningen av 3′, 5′-cykliskt adenosinmonofosfatfosfatfosfodiesteras.

Pyrofosfat

Klyvning av biprodukten av denna reaktion, PPi, av pyrofosfatas ger två molekyler oorganiskt fosfat (Pi). ATP-syntas kan återinkorporera detta oorganiska fosfat till adenindifosfat (ADP) för att göra ATP med hjälp av energi i protonernas drivkraft.

Adenylylcyklas från däggdjur

Det finns tio isozymer av adenylylcyklaser hos däggdjur, adenylylcyklas typ I-X, (ADCY I-X). Hos däggdjur spelar adenylylcyklas en viktig roll i signaltransduktionsvägar där cAMP är en sekundär budbärare.

ADCY I-IX har alla en allmän struktur. De består av två transmembranregioner (M1, M2) som består av sex membranöverskridande spiraler och har till uppgift att hålla enzymet förankrat i membranet, och två cytoplasmatiska regioner (C1, C2) som kan delas upp ytterligare (C1a, C1b, C2a, C2b) och som ansvarar för all katalytisk aktivitet och reglering genom G-proteiner och forskolin. I lösning kan C1a- och C2a-domänerna bilda heterodimerer med varandra, antingen i samma eller olika enzymer, eller så kan de bilda homodimerer med sina identiska enheter i olika enzymer. C1b-domänen är mycket stor (≈15 kDa) med många regleringsställen och har en varierande struktur i olika isozymer, medan C2b-domänen nästan inte existerar i många isozymer och ännu inte har förknippats med en särskild funktion.

Typ II

Struktur

En monomer av C2-domänen av har en inre, hydrofob, antiparallel omgiven av flera, amfipatiska , med undantag för ett område som behövde bilda en homodimer med en annan C2-domän. Två monomerer av C2-domäner av typ II adenylylcyklas binder samman i lösning för att bilda en , som är nödvändig för katalytisk omvandling av ATP till cAMP och PPi. När de är bundna skapar de en djup spricka som sträcker sig över mitten av bindningsstället; denna spricka är lämplig för att binda två molekyler i sina ändar. Starka vätebindningar skapas mellan forskolins syreatomer och den omgivande peptidryggraden, och resten av interaktionerna är mycket hydrofoba, eftersom forskolinets bindningsställe innehåller tio alifatiska och aromatiska rester. Denna bindning av forskolin skapar en hydrofob länk mellan monomererna, som var och en har två olika hydrofoba ytor som binder till forskolin; och det är denna interaktion som gör homodimern stabil. Forskolinet interagerar också med och placerar Asn 1025 korrekt, vilket är viktigt för den katalytiska aktiviteten, och det kan till och med interagera direkt med ATP. Detta homodimer-forskolinkomplex kan aktiveras ytterligare som svar på en signal genom bindning till ett G-proteins βγ-subenhet . Denna βγ-underenhet binder till som utgör en del av en α-helix på komplexets yttersta lager.

Den av denna homodimer är belägen inom sprickan och kännetecknas av två mycket konserverade uppsättningar av polära rester (Arg 997 (grön), Asn 1025 (röd), Ser1028(rosa), Arg 1029(orange), Asp 1031(gul) och Ser 1032(lila)). En av dessa uppsättningar finns på varje monomerisk underenhet, på homodimern ordnar de sig på ett antiparallellt sätt, där de pekar mot varandra.

Överuttryck Störningar

I däggdjurshjärnan utförs utförandet av minnesbaserade funktioner av den prefrontala cortexen (PFC). Hyperpolarisationsaktiverade cykliska nukleotid-gaterade (HCN) kanaler på neuroner stängs för att elektrokemiska signaler ska kunna flöda nerför axonet och in i en synaps; när HCN-kanalerna är öppna kan den elektropotentiella signalen inte överföras genom cellen. Exponering av dessa kanaler för cAMP gör att de öppnas, vilket stoppar överföringen av signaler och därmed försämrar högre kognitiva tankar. Hos patienter med schizofreni är en cAMP-regulatorisk molekyl, Disrupted-in-Schizophrenia 1 (DISC1), muterad och kan inte reglera cAMP-nivåerna; förhöjda cAMP-nivåer kan således orsaka schizofreni. Stängningen av HCN-kanaler tros spela en roll vid andra sjukdomar, t.ex. ADHD och bipolär sjukdom. Därför är det rimligt att reglering av cAMP-produktionen genom att rikta in sig på typ II adenylylcyklas, eftersom det finns i hjärnan, kan fungera som en behandling av dessa störningar.

Rv1264 Adenylylcyklas

Och även om adenylylcyklas finns överallt i organismer på en universell nivå, så har avlägset besläktade organismer olika modifieringar av enzymet, var och en är specialiserad för en viss uppgift i en viss miljö. Som tidigare nämnts har människor 10 kända isozymer av adenylylcyklas; medan Escherichia coli endast har en isoenzym och Mycobacterium tuberculosis har 15. Ett särskilt intressant adenylylcyklas hos M. tuberculosis, Rv1264, har en N-terminal som på sätt och vis fungerar som en pH-sensor, eftersom den reglerar enzymets aktivitet utifrån pH-värdet i den omgivande lösningen. Detta adenylylcyklas tillhör liksom de flesta andra klass III, adenylylcyklaser i denna klass har flera domäner, minst en för katalys och en annan för reglering.

Struktur

Adenylylcyklaset är ett 363 restar långt protein som består av en katalytisk och en regulatorisk som innehåller en flexibel som kopplar samman de två. Den aktiva strukturen är en homodimer som liknar däggdjurens typ II homodimer, där en α-helix av en monomer (kedja A) är placerad genom den centrala spiralen av en annan (kedja B). Denna dimerisering placerar den regulatoriska domänen i kedja A i nära anslutning till den katalytiska domänen i kedja B och vice versa. Två switchelement finns i proteinet, ett i den C-terminala domänen (α1-switch) och ett annat i länkregionen (αN10-switch), dessa gör det möjligt för stora konformationsförändringar att äga rum i enzymet som svar på relativt små miljöförändringar.

C-Terminal katalytisk domän

Den katalytiska aktiviteten i Rv1264:s utförs av resterna: Asp 222 (röd), Lys 261 (blå), Asp 265 (orange), Arg 298 (rosa), Asp 312 (gul), Asn 319 (lila), Arg 323 (grön). Alla dessa rester skapar en mycket polär miljö som är komplementär i laddning och polaritet till reaktionens intermediär. Rester som styr ATP:s fosfater, arginin 298 och 323, binder en i den aktiva platsen. Denna sulfatjon är placerad i den position som kommer att upptas av ATP:s β-fosfat under katalysen. Under katalysen klyvs β-fosfatet från α-fosfatet; denna reaktion kan göras mer gynnsam genom att sänka energin genom komplementära laddningsassociationer mellan β-fosfatet och argininerna 298 och 323. En annan rest, , binder en molekyl genom elektrostatiska interaktioner. Den specifika funktionen av denna association är okänd, men på grund av dess närhet till den aktiva platsen kan den spela en roll i katalysen.

Aminosyrasekvensering har visat att sekvensen mellan Rv1264 adenylylcyklasets katalytiska domän och däggdjurs adenylylcyklasets katalytiska domän inte är välkonserverad, med endast ca 25 % överensstämmelse med däggdjurs adenylylcyklas av typ II som diskuterats ovan. De två olika isozymerna liknar dock fortfarande varandra genom att överlagring av den ena över den andra har en betydande överlappning, med en kvadratisk medelavvikelse (rmsd) på mindre än 1,76 Å mellan 79 % av alla . En anmärkningsvärd skillnad mellan Rv1264 och typ II adenylylcyklasets katalytiska domäner är deras relativa storlekar; Rv1264 har ingen dimeriseringsarm och flera av dess slingor har förkortats. Detta resulterar i att Rv1264 adenylylcyklasets katalytiska domän associerar som en dimer med ett mindre gränssnittsområde än däggdjurens typ II, med gränssnittsområden på 1900Å2 respektive 3800Å2. De aktiva platserna Rv1264 och däggdjurens typ II adenylylcykler är ännu mer konserverade; de i den aktiva platsen har en rmsd på endast 0,69Å och i den aktiva platsen har en rmsd på 1,17Å.

Alla ovanstående strukturella uppgifter för den C-terminala katalytiska domänen gäller endast när enzymet befinner sig i sitt aktiva tillstånd. I enzymets inaktiva tillstånd har enzymet en demonterad aktiv plats och därmed ingen katalytisk aktivitet. I förhållande till de fasta N-terminala domänerna kan var och en av de C-terminala monomera domänerna transponera upp till 6 Å och rotera 55o. Denna massiva förändring av den tertiära strukturen i de C-terminala domänerna gör att den aktiva platsen sönderdelas och att de katalytiska resterna flyttas upp till 25 Å från sin katalytiskt aktiva position. Det är inte bara den aktiva platsen som är sönderslagen i den C-terminala domänen, utan gränssnittsområdet mellan de två monomererna minskar i storlek från 1900Å2 till 930Å2.

α1-switch

Den är belägen inom den C-terminala katalytiska domänen och existerar som en kompakt α-helix när enzymet är i sitt aktiva tillstånd,. Vid inaktivering blir α1-switchens α-helikala konformation instabil och den omvandlas till en slumpmässig spole. Eftersom denna switch befinner sig i nära anslutning till den aktiva platsen, stör en större förändring i strukturen i hög grad den aktiva platsen och ger enzymet inaktivitet.

Denna struktur är bevarad i däggdjurs adenylylcyklaser, där den fungerar som en bidragande faktor för bindningsstället för βγ-fosfaterna i ATP-substratet. Den fungerar också i regleringen av däggdjurs adenylylcyklasser, tillsammans med en annan α-helix bildar den bindningsstället för Gsα och Giα G-proteinunderenheterna som reglerar adenylylcyklasernas aktivitet.

N-terminal regulatorisk domän

Den N-terminala domänen fungerar i regleringen; den har en unik mekanism som bestämmer om enzymet kommer att vara aktivt eller inte baserat på pH i den omgivande lösningen. Varje monomer i den katalytiskt aktiva dimeren har tio , när de dimeriseras bildar de en skivliknande struktur. En enda molekyl av binder sig i en hydrofob ficka. Funktionen för denna polyetylenglykol tycks vara strukturell, men dess specifika placering och rörelse mellan aktiva och inaktiva former av enzymet tyder på att den också kan fungera för att upptäcka hydrofoba förändringar i miljön.

αN10-switch

Den är belägen inom länkregionen och dess konformationsförändring har en mer drastisk effekt på det totala enzymet än vad α1-switchen har. När enzymet är aktivt består αN10-switchen av en slumpmässig spole med en kort α-helix; denna konformation tillåter endast en svag interaktion mellan den N-terminala regulatoriska domänen och den C-terminala katalytiska domänen, vilket gör att enzymet kan uppvisa katalytisk aktivitet. Denna helix kan sträcka sig upp till 24Å, vilket separerar de monomera C-terminala katalytiska domänerna i dimern. Denna separation av domänerna sänker deras gränssnittsområde och transponerar rester; som diskuterats ovan resulterar dessa förändringar i en inaktivering av enzymet, och därmed är ett viktigt kännetecken för enzymets inaktiva tillstånd en förlängd αN10-switch. När αN10-switchen förlängs rör sig αN10-switchen utåt och pentaetylenglykolet rör sig in i en nybildad kavitet av αN10-helixen. Detta stöder ytterligare tanken att pentaetylenglykolliganden inte bara fungerar för strukturen utan även för regleringen.

Reglering av pH

I början av länkregionen finns en rest, , som har ett betydande inflytande på regleringen av pH. Vid ett basiskt pH har resterna ingen laddning och minimala interaktioner med de två katalytiskt viktiga resterna, som ligger 14 Å och 21 Å från deras katalytiskt aktiva positioner. Enzymet är inaktivt i detta tillstånd, inte bara på grund av Lys 261- och Asp 312-resterna, utan också på grund av att andra viktiga strukturella komponenter i den katalytiska platsen är nedmonterade. Vid ett surt pH blir Rv1264 aktiv (optimalt pH~5,8)och har en upp till 40-faldig ökning av aktiviteten. Vid detta sura pH blir His 192 protonerad och positivt laddad; vilket skapar stora strukturella förändringar i hela proteinet, inklusive kompaktering av både αN10-switchen och α1-switchen, sammandragning av α4-helixen som i sin tur orsakar en translokation av paraetylenglykolliganden. Den positivt laddade His 192 stöter elektrostatiskt bort Lys 261- och Asp 312-resterna vilket tillsammans med andra strukturella förändringar förflyttar dem 14 Å respektive 21 Å till sina katalytiskt aktiva positioner.

, en rest som genom vätebindningar organiserar många rester som är viktiga i C-terminal – N-terminal interaktionen, är också viktig för regleringen. När denna rest muteras går regleringen baserad på pH förlorad och enzymet är konstant aktivt.

Många andra rester bidrar också till regleringen av pH; det är de elektrostatiska interaktionerna och vätebindningarna i gränssnittet C-terminal – N-terminal domän som gör att Rv1264 adenylylcyklas är känsligt för pH.

Biologisk roll

M. tuberculosis är en sjukdomsframkallande bakterie, och den möter därför en rad olika immunsvar från värdens immunförsvar för att försöka göra sig av med den. En av värdens försvarsmekanismer som M. tuberculosis möter är försurning som möts i fagolysosomer. Förmågan att kunna upptäcka denna sura miljö och ha ett lämpligt svar på den kan i hög grad hjälpa M. tuberculosis att infektera en värd. När cAMP-nivåerna ökar fördröjs försurningen av andra strukturer och förhöjda cAMP-nivåer aktiverar cAMP-receptorproteiner som i sin tur reglerar transkriptionen.

3D-strukturer av adenylylcyklas

3D Adenylylcyklas 3D-strukturer

.