Aggregation av amfolin på heparin och andra sura polysackarider vid isoelektrisk fokusering

Mekanismen för komplexering av amfolin i pI-intervallet 3,5-5 till heparin vid isoelektrisk fokusering har undersökts med hjälp av färgämnesbindningsteknik vid olika pH-värden i lösning. Det finns ingen signifikant interaktion mellan heparin och ampholin vid pH 6,7. Svag, eller selektiv, bindning förekommer vid pH 5,1 och mycket stark interaktion vid pH 3,5. I det sistnämnda systemet verkar Ampholinkomponenterna uppträda som polykationer på grund av deras ordnade sekvens av positiva laddningar, var och en med två metylengrupper emellan, vilket gynnar en stark bindning till polyanjoner. Dessutom verkar det finnas varierande stökiometri för den starka bindningen mellan heparin och ampholin, beroende på deras relativa mängder. Det föreslås att vid ett lågt förhållande mellan heparin och ampholin (ampholinöverskott) sker aggregeringen vinkelrätt mot heparinkedjan, där varje ampholinmolekyls ammoniumladdning i slutet neutraliserar en negativ laddning längs heparinmolekylen; vid högre förhållanden (heparinöverskott) är det bundna ampholinsegmentet inriktat parallellt med heparinmolekylen, så att en ampholinkomponent i genomsnitt neutraliserar ca tre negativa laddningar. Heparins bandning vid isoelektrisk fokusering i pH-området 3,0-4,5 kan förklaras av aggregering av de olika komponenterna på heparin i mängder som är beroende av nettoladdningen på Ampholin-arten vid det givna pH-värdet, och av de förändrade stökiometrierna som en funktion av variationen i förhållandet mellan heparin och Ampholin längs pH-gradienten. Bindning av ampholin till polygalakturonat påvisades också i överskott av ampholin i ett pH-område som är beroende av graden av protonering av karboxylgrupperna i denna sura polysackarid samt av ampholins positiva nettoladdning. Den aggregering som observerades vid pH 4,2-4,5 ledde till förutsägelsen och den efterföljande demonstrationen att polygalakturonat också skulle uppvisa bindning vid isoelektrisk fokusering. Detta stöder hypotesen att aggregering av ampholin på polyanjoner med tillräcklig laddningstäthet är ett allmänt fenomen som kan leda till falska bandbildningar av vissa polymerer vid lämpliga pH-områden vid isoelektrisk fokusering. På grundval av deras beteende vid isoelektrisk fokusering vid pH 3,0-4,5 verkar aggregationsstyrkan hos de studerade polyanjonerna vara heparin A = heparin B större än polyglutamat större än karboxylreducerat heparin B större än polygalakturonsyra.