Alpha-2 adrenerga receptor agonister blockerar stressinducerad återinsjuknande i kokainsökande

Experiment 1: Effekter av klonidin, lofexidin och guanabenz på fotchocksinducerad NE-frisättning

Försökspersoner

Försökspersonerna var hanar av typen Long-Evans-råttor (Charles River, Quebec) som vägde 300-350 g i början av försöket. Under hela försöket hölls djuren i ett fukt- och temperaturkontrollerat kolonirum med ett omvänt ljus-mörkerschema (ljuset på 1730-0530 timmar) och fick fri tillgång till standardmat för laboratorieråttor och vatten. De experimentella förfarandena följde CCAC:s riktlinjer och godkändes av djurvårdskommittén vid Concordia University.

Kirurgi

Inför operationen sövdes råttorna med natriumpentobarbital (65 mg/kg, i.p.) och injicerades med atropinsulfat (0,6 mg/ml; 0,2 ml/råtta, SC) och antibiotika (Penlong, Rogar/STB Inc.; 0,1 ml/råtta, i.m.). Guidningskanyler (20 gauge; Plastics One) implanterades för efterföljande insättning av dialyssonder; en placerades i PFC och en i AMG i motsatta hemisfärer. De djur som användes för att studera effekterna av guanabenz fick en enda styrkanyl riktad mot PFC. Den hemisfär i vilken de respektive styrkanylerna implanterades var motbalanserad mellan olika behandlingar. De stereotaxiska koordinater som användes (i förhållande till bregma och skallytan) var följande: AMG, AP -3,0 mm, ML ± 4,5 mm, DV -6,7 mm; PFC, AP + 3,2 mm, ML ± 0,5 mm, DV -1,5 mm (Paxinos och Watson 1997). När dialyssonden sattes in sträckte sig dialyssondens skaft 1 mm från styrkanylerna. De implanterade styrkanylerna fästes i skallen med rostfria stålskruvar och tandcement. Guidekanylerna stängdes med skruvade obduratorer. Alla djur återfördes till kolonirummet för en återhämtningsperiod på minst en vecka före testningen.

Mikrodialys

Mikrodialys genomfördes i fyra sexkantiga testkammare (42 × 39 × 33,5 cm) byggda av plexiglas med trätak och golv av stänger av rostfritt stål. Mörka gardiner drogs runt varje kammare och belysningen gavs i en omvänd cykel av glödlampor (15 W). Dialyssonden bestod av en 1,8 mm (AMG) eller 3,5 mm (PFC) lång bit semipermeabelt dialysmembran (Spectra/Por; 240 μm o.d., 13000 M.W. cutoff), som stängdes i ena änden och fästes i den andra till en 19 mm lång 26 gauge slang av rostfritt stål. En 40-50 cm lång PE-20-slang anslöt den andra änden av det rostfria stålskaftet till en infusionssvivel som var placerad ovanför testkammaren och som i sin tur var ansluten via PE-20-slangen till en infusionspump med variabel hastighet. En slang av smält kiseldioxid med liten diameter sträckte sig internt genom sonden, där den ena änden vilade 0,5 mm från sondens spets och den andra änden gick ut ur PE-slangen 35 cm nedanför infusionskopplingen. Den yttre längden av PE-20-slangen skyddades från skador av fjäderhöljen av stål. Sondorna var utformade så att hela längden av det halvpermeabla membranet sträckte sig under ledningskanylens spets.

Separata grupper av djur användes för att undersöka effekterna av vart och ett av de testade läkemedlen. Inom varje grupp tilldelades varje djur slumpmässigt behandlingsvillkoret. Djur som fick injektioner med vehikel kördes i varje grupp, men kombinerades till en enda grupp för den statistiska analysen. De slutliga gruppstorlekarna (PFC/ AMG) var följande: fordon (n = 15/17), klonidin 20 μg/kg (n = 7/6), klonidin 40 μg/kg (n = 9/5), lofexidin 75 μg/kg (n = 6/6), lofexidin 150 μg/kg (n = 5/6), guanabenz 640μg/kg (n = 4, PFC). Med undantag för de djur som fick guanabenz dialyserades alla försökspersoner två gånger, en gång i PFC och en gång i AMG med ett intervall på 3-4 veckor mellan testerna.

Sonderna sattes in dagen innan mikrodialysundersökningen inleddes. För att förhindra ocklusion perfuserades artificiell CSF (145 mM Na+, 2,7 mM K+, 1,22 mM Ca2+, 1,0 mM Mg2+, 150 mM Cl-, 0,2 mM askorbat, 2 mM Na2HPO4, pH 7,4 ± 0,1) över natten med en hastighet på 0,06 μl/min. Dialysatprovtagning och aktivitetsövervakning påbörjades nästa morgon. Flödeshastigheten för dialysatet ökades till 0,6 μl/min, och dialysatprover för baslinjen (∼12 μl/prov) samlades in var 20:e minut. Proverna samlades in tills en stabil baslinje, definierad som minst tre på varandra följande prover där dialysatets NE-nivåer varierade med ±10 %, uppnåddes. Efter det att stabila basnivåerna av NE hade uppnåtts fick alla djur en i.p.-injektion (1 ml/kg) av lämpligt läkemedel eller vehikel som gavs 40 minuter före en 10 minuter lång period av fotchocker. Stötarna gavs enligt ett varierande tidsschema med ett genomsnittligt intervall på 40 sekunder (intervallet 10-70 sekunder); varje stöt (0,6 mA) varade 0,5 sekunder. Prover samlades in under ytterligare 120 minuter (6 prover). Proverna analyserades omedelbart med hjälp av ett av två liknande högpresterande vätskekromatografisystem med elektrokemisk detektion (HPLC-EC). Proverna (10 μl) laddades på kolonner i omvänd fas (15 × 0,46 cm; HAISIL C18, 5 μm; Sci. Products & Equipment, Concord, Ontario) genom manuella injektionsportar (Reodyne 7125; 20 μl-slinga). Reduktions- och oxidationsströmmar för NE, dihydroxifenylättiksyra (DOPAC), 5-hydoxyindoleättiksyra (5-HIAA) och homovanillinsyra (HVA) mättes med ESA-koulometriska detektorer med dubbla kanaler (Coulochem 5100, med en konditioneringscell av modell 5021 och en analytisk cell av modell 5011, Sci. Products & Equipment). Strömmarna för NE mättes oberoende av strömmarna för DOPAC och HVA med hjälp av separata kanaler i Coulochem-detektorerna. De rörliga faserna (natriumacetat 36 mM, SOS 3,1 mM, EDTA 100 μM, 5 % acetonitril, justerat till pH 3,7 med hjälp av isättika) cirkulerade genom varje slutet system med en flödeshastighet på 1,4 ml/min med Waters 510 HPLC-pumpar. De toppar som erhölls för NE, DOPAC och HVA integrerades och kvantifierades med EZChrom Chromatography Data System (Sci. Products & Equipment). Dialysatprover från enskilda råttor analyserades alltid med samma HPLC-EC-system, och tilldelningen av djur till varje system var balanserad i alla behandlingsgrupper. Maten avlägsnades från kamrarna före provtagningen, men ett dricksrör för vatten fanns tillgängligt. Efter avslutad testning fastställdes bekräftelse av korrekt sondplacering genom undersökning av 30 μm sektioner skurna genom platserna för sondplacering färgade med kresylviolett.

Experiment 2: Effekter av klonidin på fotchock- och kokaininducerad reinstatement

Försökspersoner

Försökspersonerna var 25 hanar av typen Long-Evans-råttor (Charles River, Quebec) med en vikt på 350-425 g i början av försöket. Djuren hölls som beskrivet i experiment 1.

Kirurgi

Djuren förbereddes för kirurgi som beskrivet i experiment 1. En intravenös kateter (Dow Corning) implanterades i den högra jugularvenen. En 3 cm lång silastikslang fördes in i venen (innerdiameter 0,30 mm, ytterdiameter 0,64 mm) och kopplades med värmekrympslang till en 9 cm lång silastikslang (innerdiameter 0,51 mm, ytterdiameter 0,94 mm) som fördes subkutant till toppen av skallen. Katetern fästes i venen med silkessömmar och gick ut i en kontakt (en modifierad 22 gauge-kanyl; Plastics One, Roanoke, VA) som monterades på skallen med juvelerskruvar och tandcement; ett plastlock placerades över kanylens öppning. Djuren fick 1-2 veckor på sig att återhämta sig från operationen.

Apparatur

De kamrar för självadministrering som användes i experimenten var utrustade med en utdragbar spak (Med Associates, St Albans, VT) och en icke utdragbar ”dummy”-spak. Båda spakarna var placerade 9 cm över golvet. En infusionspump (Razel Scientific Instruments, Stamford, CT) aktiverades genom svar på den infällbara, eller ”aktiva”, spaken. Svaren på den oäkta spaken registrerades men ledde inte till att pumpen aktiverades. Läkemedelslösningen gavs under en 10-s period i en volym på 65 μl. Under hela infusionsperioden tändes en vit stimulanslampa strax ovanför den aktiva spaken och ytterligare reaktioner under denna tid registrerades, men ledde inte till att pumpen aktiverades på nytt. Varje självadministrerande kammare var utrustad för att ge en konstant ström, intermittent, oundviklig, elektrisk fotchock genom en förvrängare till rutengolvet (Grason-Stadler Generator #E1064GS eller Med Associates). Fotchocken gavs under 15 minuter enligt ett variabelt tidsschema med ett genomsnittligt intervall på 40 sekunder (intervallet 10-70 sekunder). Varje stöt (0,6 mA) varade 0,5 sekunder. Denna intensitet på fotstötarna har med hjälp av vår apparat visat sig vara den minsta intensitet som krävs för att framkalla tillförlitlig reinstatement.

Läkemedel

Kokain HCl erhölls från BDH Chemicals (Toronto, Kanada) och löstes upp i fysiologisk koksaltlösning. Clonidin HCl köptes från Sigma (St Louis, MO) och löstes upp i fysiologisk saltlösning och injicerades i.p. (0, 20 och 40 μg/kg).

Förfarande

Fas 1: Träning. Råttor tränades att självadministrera kokain HCl (0,5 mg/kg/infusion, i.v.) enligt ett förstärkningsschema med fast förhållande-1 under en daglig självadministreringssession på 3 timmar. Varje dag fördes hälften av djuren till operantkamrarna för sin självadministreringssession på morgonen, ungefär tre timmar efter det att ljuset släckts, och hälften av djuren fördes till kamrarna på eftermiddagen, ungefär sju timmar efter det att ljuset släckts. Den grupp djur som tilldelades morgon- och eftermiddagssessionerna alternerade dagligen så att alla djur i slutet av träningen hade fått lika många självadministreringstillfällen vid båda tidpunkterna. Det var viktigt att alla djur hade samma erfarenhet av självadministrering tidigt och sent på dagen eftersom alla djur under fas 2 fick extinktionstillfällen på morgonen följt av ett testtillfälle som vanligtvis ägde rum på eftermiddagen. I början av varje session tändes ett rött husljus i 10 sekunder innan den infällbara spaken fördes in i buren. Ljuset strax ovanför den aktiva spaken tändes under de första 30 sekunderna efter det att spaken presenterades. Husljuset förblev tänt under hela sessionen. Som tidigare nämnts ledde svar på den aktiva spaken till att infusionspumpen aktiverades och att ljuset ovanför spaken tändes under de 10 sekunder som läkemedelstillförseln pågick. Ytterligare tryck på spaken under läkemedelsleveransperioden registrerades men ledde inte till att pumpen aktiverades på nytt. Träningsförhållandena pågick i 10-12 dagar. I slutet av träningen lämnades djuren ostörda i kolonirummet i 7-13 dagar. Därefter skedde avstängning och testning. I detta försök och i försök 3B tilldelades grupper av djur olika doser av testläkemedlen. Alla djur i varje grupp utsattes sedan för tre testförhållanden; saltlösning, kokain och fotchock.

Fas 2: Extinktion och testning. Under extinktion och testning, som skedde under fyra på varandra följande dagar, var djuren inhysta 24 timmar om dygnet i självadministrationskamrarna. Mat och vatten var fritt tillgängliga för djuren, utom under dagliga extinktions- och testtillfällen. Djuren fördes till kamrarna på kvällen före den första dagen av extinktion och testning. Eftersom två separata grupper av råttor kördes varje dag under träningsfasen testades en grupp djur under de första fyra dagarna av fas 2 och den andra gruppen djur testades under de följande fyra dagarna. Under utrotning och testning bibehölls alla förhållanden som rådde under träningen utom att tryck på spaken inte resulterade i kokaininfusioner.

I detta och alla efterföljande återinförandeexperiment fick djuren flera dagliga utrotningssessioner på 1 timme, åtskilda av mellanliggande perioder då spaken drogs tillbaka. Dag 1 fick djuren fyra extinctionssessioner; dag 2-4 fick djuren två till tre extinctionssessioner som var tillräckliga för att etablera en baslinjenivå av svar på 15 eller färre svar på en timme, följt av en 180 minuter lång testsession. Längden på de mellanliggande perioderna hölls konstant för varje försök och motsvarade den fördröjning som krävdes för läkemedelsabsorption mellan förbehandlingsinjektionerna och starten av testet. I det aktuella försöket var längden på de mellanliggande perioderna 40 min.

Vid testet förbehandlades separata grupper av djur med antingen 0, 20 eller 40 μg/kg, i.p., klonidin före vart och ett av de tre testerna för återinförande (saltlösning, kokain och fotchock), som gavs på på varandra följande dagar och i en motbalanserad ordning. Clonidin injicerades 40 minuter innan hävstången sattes in. För salin- och kokaintestet fick djuren en icke-kontingent, i.p., injektion av salin eller kokain (20 mg/kg) 5 minuter innan hävstången sattes in. För fotchockstesterna utsattes djuren för 15 minuters kort intermittent fotchockstress omedelbart innan hävstången sattes in. Testomgångarna varade i 3 timmar. Kokaindosen och fotchocksparametrarna valdes på grundval av tidigare arbete från detta laboratorium (Erb et al. 1996; Erb et al. 1998; Shaham et al. 1998). Doserna av klonidin valdes på grundval av reinstatementsexperiment som vi har genomfört med herointränade råttor (Shaham et al. 2000).

Experiment 3A: Effekter av lofexidin på höga svarsfrekvenser för sackaros

Då den farmakologiska profilen för lofexidin inte har karakteriserats lika väl som för klonidin, genomfördes ett experiment för att fastställa om, och vid vilka doser, lofexidin inducerar prestationsunderskott. Doserna i testerna för återinsjuknande valdes på grundval av de resultat som erhölls i detta experiment.

Försökspersoner

Försökspersonerna var 8 hanar av typen Long-Evans-råttor (Charles River, Quebec) som vägde 400-550 g i början av experimentet. Råttorna har tidigare använts i ett experiment som syftade till att studera fotchocksinducerad återupprättelse av sökandet efter sackaros (Buczek et al. 1999). Djuren hölls under liknande förhållanden som de som beskrivs i experiment 1.

Apparatur

Varje självadministrationskammare var utrustad med två stationära spakar, symmetriskt centrerade på en sidopanel, 5 cm över golvet. Svar på den ena spaken, den ”aktiva” spaken, aktiverade en pump (Razel Sci. Stamford, CT). Svaren på den andra spaken, ”dummy”-spaken, registrerades men var utan konsekvens. Aktiveringen av pumpen resulterade i en 20 sekunder lång leverans av 0,18 ml sackaroslösning till en behållare för flytande droppar som var placerad mellan de två spakarna. Under hela tiden som sackaros levererades tändes en vit stimulanslampa strax ovanför den aktiva spaken och ytterligare reaktioner under denna tid registrerades, men resulterade inte i att pumpen återaktiverades.

Läkemedel

Lofexidine HCl tillhandahölls generöst av Keith Davies, Britannia Pharmaceuticals Ltd., Storbritannien. Läkemedlet löstes upp i fysiologisk koksaltlösning och injicerades i.p. (0, 80, 120, 160 eller 200 μg/kg).

Förfarande

Djur som tidigare hade lärt sig att självadministrera sackaros i en annan studie (Buczek m.fl. 1999) fick därefter fem sessioner under fem på varandra följande dagar där de självadministrerade en 30 % sackaroslösning enligt ett FR-1-schema. Under efterföljande dagliga sessioner injicerades djuren med antingen vehikel (0 μg/kg) eller lofexidin (80, 120, 160 eller 200 μg/kg, i.p.) 60 minuter före starten av självadministreringsessionen. Alla djur fick alla doser lofexidin i en balanserad ordning; den högsta dosen lofexidin testades två gånger. Varje session där djuren behandlades med lofexidin följdes av en förbehandlingsrunda med saltlösning för att minimera risken för överföringseffekter av läkemedlet.

Experiment 3B: Effekter av lofexidin på fotstöt- och kokaininducerad reinstatement

Försökspersoner

Försökspersonerna var 49 manliga Long-Evans-råttor (34 från Charles River, Quebec; 15 från Harlan Sprague Dawley, USA) med en vikt på 350-400 g i början av experimentet. Djuren hölls enligt beskrivningen i experiment 1. Det fanns inga uppenbara skillnader i respons mellan djur från de två leverantörerna i någon fas av experimentet.

Förfarande

Fas 1: Träning. Djuren tränades att självadministrera kokain under de förhållanden som beskrivs i försök 2.

Fas 2: Extinktion och testning. I detta försök var de mellanliggande perioderna, som beskrivs ovan, 60 minuter långa. Vid testet förbehandlades separata grupper av djur med antingen 0, 50, 100, 150 eller 200 μg/kg, i.p., lofexidin före vart och ett av de tre testerna för återinsjuknande (saltlösning, kokain och fotchockstress), som gavs på på varandra följande dagar och i en balanserad ordning (se experiment 2). Lofexidin injicerades 60 minuter innan hävstången sattes in. Testomgångarna varade i tre timmar. Doserna av lofexidin valdes på grundval av de resultat som erhölls i experiment 3A.

Experiment 4: Effekter av guanabenz på fotchock- och kokaininducerad reinstatement

Försökspersoner

Försökspersonerna var 18 hanar av typen Long-Evans-råttor (Charles River, Quebec) med en vikt på 350-400 g i början av experimentet. Djuren hölls som beskrivet i experiment 1.

Läkemedel

Guanabenz köptes från Sigma (St Louis, MO) och löstes upp i fysiologisk koksaltlösning och injicerades i.p. (0, och 640 μg/kg).

Förfarande

Fas 1: Träning. Djuren tränades att självadministrera kokain under de förhållanden som beskrivs i försök 2.

Fas 2: Extinktion och testning. I detta försök var de mellanliggande perioderna, som beskrivs ovan, 60 minuter långa. Vid testet förbehandlades djuren med 0 eller 640 μg/kg guanabenz, i.p., före vart och ett av två test för återinsjuknande (ingen fotchock, fotchock eller saltlösning, kokain), som gavs på på varandra följande dagar (se experiment 2). Guanabenz injicerades 60 minuter innan hävstången sattes in. Testomgångarna varade i 3 timmar. Guanabenzdosen valdes på grundval av dess utbytbarhet mot 40 μg/kg klonidin i ett förfarande för narkotikadiskriminering (Bennett och Lal 1982).

Statistiska analyser

Mikrodialysdata analyserades med hjälp av en ANOVA med blandad faktor för koncentrationen av extracellulärt NE i 20 minuters dialysatprover; mellanfaktorn var dosen av klonidin (0, 20, 40 μg/kg), lofexidin (0, 75 eller 150 μg/kg) eller guanabenz (0 eller 640 μg/kg) och det upprepade måttet var tid. Signifikanta interaktioner mellan tid och dos utsattes för envägsanalyser (ANOVA) för faktorn dos vid specifika tidpunkter. Vid behov genomfördes post hoc-tester (Fisher’s LSD, p < .05) för att jämföra fordonet (0 μg/kg) med läkemedelsförhållandena.

De två beroende måtten i testerna för återinförande var antal svar på den aktiva spaken (infusioner + time out-svar) och antal svar på den inaktiva spaken på tre timmar. Alla beteendedata presenteras som medelvärden ± SEM. På grund av den avsevärda variationen i antalet svar som gavs i de olika testerna för återinförande användes icke-parametrisk statistik för relaterade (Friedman och Wilcoxon) och orelaterade (Kruskal-Wallis och Mann-Whiney) prover där så var lämpligt.

För sackarosstudien (försök 3A) var de beroende måtten antalet svar på de aktiva (förstärkta + timeout-svar) och inaktiva spakarna och antalet förstärkningar som erhållits. ANOVA:er med upprepade åtgärder genomfördes med dosen som inom-subjekt-faktor. Vid behov genomfördes post hoc-tester (Fisher’s LSD, p < .05) för att jämföra fordonet (0 μg/kg) med läkemedelsförhållandena.