AmpR ökar virulensen hos karbapenemresistenta Klebsiella pneumoniae genom att reglera det första steget i kapselsyntesen

Introduktion

Klassisk K. pneumoniae (cKp) och hypervirulent K. pneumoniae (hvKp) är två globala patotyper av K. pneumoniae som för närvarande cirkulerar.1,2 I Nordamerika och Europa orsakas de flesta K. pneumoniae-infektioner av cKp-isolat, som oftast är opportunistiska patogener som orsakar infektioner främst inom hälso- och sjukvården hos immunsupprimerade värdar. Den mest problematiska egenskapen hos denna patotyp är förmågan att förvärva ett ökande antal element som ger antimikrobiell resistens. Karbapenemresistent K. pneumoniae (CRKP) associerad med plasmidkodade karbapenemaser innebär särskilda kliniska utmaningar och ger upphov till invasiva infektioner med hög dödlighet.3,4

Rapporter från Taiwan beskrev ett unikt kliniskt syndrom med samhällsförvärvad, vävnadsinvasiv K. pneumoniae-infektion hos friska individer som ofta uppvisade flera olika ställen eller som senare spreds, bland annat genom pyogena leverabscesser.5,6 hvKp betecknades för att skilja denna patotyp från cKp, och förekomsten av infektioner orsakade av hvKp har ökat stadigt under de senaste tre decennierna i länder i Asien och Stillahavsområdet.7-11 hvKp är vanligtvis mottaglig för antimikrobiella medel, men den har visat sig vara resistent, och till och med ett extensivt läkemedelsresistent (XDR) cKp-isolat som förvärvat en del av en hvKp-virulensplasmid orsakade ett dödligt nosokomialt utbrott har rapporterats.12-15

En egenskap som ursprungligen ansågs vara känslig och specifik för hvKp-isolat var en hypermucovisk fenotyp, som definierades genom ett positivt strängtest.16 Det skapade dock en viss förvirring eftersom alla hvKp-isolat inte bestämdes vara hypermucoviskösa, och vissa cKp-isolat hade denna egenskap.17 Nyligen har flera biomarkörer, inklusive peg-344, iroB, iucA, plasmidkodade rmpA och rmpA2 och kvantitativ sideroforproduktion, visat sig kunna förutsäga hvKp-isolat på ett korrekt sätt; dessa biomarkörer skulle kunna användas för att utveckla ett diagnostiskt test som kan användas av kliniska laboratorier för optimal patientvård och för användning i epidemiologisk övervakning och forskning.18 I den här studien identifierade vi emellertid en ny grupp av icke-hypermucoviskösa CRKP-isolat som saknade de flesta hvKp-specifika generna. En pan genome-wide association study (Pan-GWAS), proteomanalys och virulenstest i en djurmodell visade att AmpR ökar virulensen hos dessa isolat genom att reglera initieringen av kapselsyntesen. Dessutom fann vi också att ampR som bärs av K-locus 47 (KL47) stammar i denna studie inte kunde öka virulensen hos KL1 hypermucoviscous K. pneumoniae.

Material och metoder

Kliniska isolat och datainsamling

Non-repetitiva kliniska K. pneumoniae-isolat samlades in från rutinmässigt upptäckta och lagrade prover från fem sjukhus avdelningar för laboratoriemedicin i provinserna Guangdong och Anhui mellan 2018 och 2019. Alla isolat förvarades vid -80 °C före användning. Klinisk information om patienterna inhämtades. Artbestämning och testning av antimikrobiell känslighet utfördes med VITEK-2 compact-systemet (bioMérieux, Marcy-l’Étoile, Frankrike). Resultaten tolkades i enlighet med de riktlinjer som publicerats av Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI; dokument M100-S26).19 De identifierade arterna hos alla isolat bekräftades med matrixassisterad laserdesorption/joniseringsmasspektrometri (bioMérieux, Marcy-l’Étoile, Frankrike). CRKP definierades som resistent mot imipenem eller meropenem.

Hypermucovisk fenotypisk karakterisering

För att identifiera den hypermucoviska fenotypen med strängtestet inokulerades isolaten på agarplattor som innehöll 5 % fårblod och inkuberades vid 37 °C över natten. Strängtestet ansågs positivt när en viskös sträng längre än 5 mm kunde genereras genom att röra vid en enskild koloni med en standardinokuleringsslinga och dra kolonin uppåt.2

Helgenomsekvensering (WGS)

En odlingsvolym på 1 ml (optisk densitet vid 600 nm 0,6) användes för extraktion av genomiskt DNA (gDNA) (Sangon, Shanghai, Kina). gDNA sekvenserades på en Illumina HiSeq 2500-sekvensator (Illumina, San Diego, CA, USA) med hjälp av 150-bp-avläsningar med parvisa ändar. Genomsammansättningen utfördes med hjälp av de novo SPAdes Genome Assembler (version 3.12.0).20 Vi utförde kapseltypning på de sammansatta sekvenserna med Kaptive (version 0.5.1).21 Antimikrobiella resistensgener och virulensfaktorer identifierades i isolaten genom att skanna genomets contigs mot ResFinder- och VFDB-databaserna med hjälp av ABRicate (version 0.8.7). Analyser av multilocus sekvenstypning (MLST) och genotypning av core genome MLST (cgMLST) utfördes med Ridom SeqSphere+ (version 5.1.0).22 Komplex typ (CT) definierades genom att följa K. pneumoniae cgMLST-schemat (www.cgmlst.org/ncs/schema/2187931). Konstruktionen av fylogenetiska träd baserat på enskilda nukleotidvarianter (SNV) i kärngenomet utfördes med hjälp av Harvest-sviten (version 1.2) med ett 1000-bootstrap-test.23 Onlineverktyget iTOL användes för att visa, manipulera och kommentera det fylogenetiska trädet.24 Vi annoterade genomsekvenserna med Prokka (version 1.13.3).25

Pan Genome-Wide Association Study (Pan-GWAS) Analysis

Vi använde pan genome pipeline Roary (version 3.12.0) för att lägga in annoterade sammansättningar i GFF3-format (som producerats av Prokka) och beräknade pan genome.26 Vi använde Scoary (version 1.6.16) för att ta filen från ”https://sanger-pathogens.github.io/Roary/”, skapade en egenskapsfil och beräknade associationerna mellan alla gener i det accessoriska genomet och egenskaperna. Vi rapporterade en lista över gener sorterade efter styrkan i associationen med P-värde < 0,01 justerat med Benjamini-Hochbergs metod för korrigering av multipla jämförelser.27

Proteomanalys

En odlingsvolym på 1 mL (optisk densitet vid 600 nm på 0,6) användes för proteinextraktion. Provet sonicerades tre gånger på is med hjälp av en högintensiv ultraljudsprocessor (Scientz) i lysisbuffert (8 M urea, 1 % proteashämmarecocktail). Det återstående skräpet avlägsnades genom centrifugering vid 12 000 g vid 4 °C i 10 minuter. Slutligen samlades supernatanten upp och proteinkoncentrationen bestämdes med ett BCA-kit enligt tillverkarens anvisningar. För digestion reducerades proteinlösningen med 5 mM dithiothreitol i 30 minuter vid 56 °C och alkylerades med 11 mM iodoacetamid i 15 minuter vid rumstemperatur i mörker. Proteinprovet späddes sedan genom att tillsätta 100 mM TEAB med urea till en koncentration på mindre än 2M. Slutligen tillsattes trypsin i förhållandet 1:50 trypsin till proteinmassa för den första digestionen över natten och 1:100 trypsin till proteinmassa för en andra 4 timmars digestion. De tryptiska peptiderna löstes upp i 0,1 % myrsyra (lösningsmedel A) och laddades direkt på en hemmagjord analytisk kolonn med omvänd fas (15 cm längd, 75 μm i.d.). Gradienten utfördes enligt följande: en ökning från 6 % till 23 % lösningsmedel B (0,1 % myrsyra i 98 % acetonitril) under 26 minuter, en ökning från 23 % till 35 % lösningsmedel B under 8 minuter, en ökning till 80 % lösningsmedel B under 3 minuter och en bibehållande av 80 % lösningsmedel B under de sista 3 minuterna vid en konstant flödeshastighet på 400 nL/min på ett EASY-nLC 1000 UPLC-system. Peptiderna utsattes för NSI-källa följt av tandem-masspektrometri (MS/MS) i Q ExactiveTM Plus (Thermo) som kopplades online till UPLC-systemet. Elektrosprayspänningen var 2,0 kV. M/z-scanningsområdet var 350 till 1800 för full scan, och intakta peptider detekterades i Orbitrap med en upplösning på 70 000. Peptiderna valdes sedan ut för MS/MS med NCE-inställningen 28, och fragmenten detekterades i Orbitrap med en upplösning på 17 500. Det databeroende förfarandet växlade mellan en MS-scanning följt av 20 MS/MS-scanningar med 15,0 s dynamisk uteslutning. Den automatiska förstärkningskontrollen (AGC) var inställd på 5E4. Den fasta första massan sattes till 100 m/z. De resulterande MS/MS-data bearbetades med hjälp av sökmotorn MaxQuant (v.1.5.2.8). Vi använde InterProScan (version 5.37-76.0) för att annotera proteindomäner. Ett korrigerat p-värde < 0,05 och en vikförändring > 1,2 betraktades som signifikant.

Konstruktion av ampR-komplementmutanten

K. pneumonia ampR (Supplementary Materials) syntetiserades och flankerades med 5ʹXbaI- och 3ʹHindIII-begränsningsställen. Detta fragment restriktionsdigiterades och klonades i pUC57. Rekombinant DNA återfanns i Escherichia coli DH5α med ampicillinselektion. Efter restriktionssmältning ligerades ampR-fragmentet till expressionsvektorn pBAD33 (Invitrogen) enligt tillverkarens anvisningar. pBAD33-ampR användes för transformation med hjälp av elektroporation som standard för laboratorieisolerad E. coli. AmpR-komplementstammarna bekräftades genom polymeraskedjereaktion (PCR) (tabell S1). Uttrycket av ampR inducerades genom att tillsätta 100 μg/mL arabinos.

Mus lunginfektionsmodeller

En lunginflammationsmodell av K. pneumoniae hos möss användes för att testa isolatens virulens. Sex till åtta veckor gamla kvinnliga BALB/c-möss av specifik patogenfri kvalitet köptes från Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd. Mössen sövdes intraperitonealt med pentobarbitalnatrium (75 mg/kg) och inokulerades med 1,0 × 107 kolonibildande enheter (CFU) av K. pneumoniae genom icke-invasiv intratrakeal instillation under direkt insyn. Mössens överlevnad observerades under 7 dagar efter infektionen. För att bedöma bakteriebördan i lungan homogeniserades organen från infekterade möss och löstes upp i 1 ml fosfatbuffertlösning (PBS). 50 μL inokulerades på agarplattor med flytande buljong (LB) och CFU-räkning utfördes. För histopatologisk analys fixerades segment av lungorna med 10 % neutral formalin, bäddades in i paraffin och färgades med hematoxylin och eosin för visualisering med ljusmikroskopi. Bakteriebörda och histopatologisk analys utfördes efter 24 timmars infektion.

Extraktion och kvantifiering av kapselpolysackarid

Kapselpolysackarider extraherades med tvättmedel Zwittergent 3-14. Mängden uronsyra mättes sedan enligt den metod som beskrivits tidigare.28 Parallellt utplantades serieutspädningar av bakteriekulturen för att bestämma antalet CFU, och koncentrationen av kapselpolysackarid uttrycktes enligt mängden glukuronsyra (μg) för 109 CFU/mL av provet. Varje experiment utfördes i tre exemplar.

Statistisk analys

Statistisk analys utfördes med hjälp av programvaran GraphPad Prism version 8 (La Jolla, Kalifornien).

Resultat

Isolatkaraktäristik

Non-repetitiva CRKP-isolat (n=135) användes i denna studie. Alla isolat var av sekvenstyp 11 (ST11) och uttryckte K. pneumoniae karbapenemas (KPC-2), och ett isolat bar på både OXA-23 och KPC-2 (figur S1). Isolaten tilldelades 16 CTs med hjälp av cgMLST-schemat. De vanligaste CT:erna var CT1313 (n = 35), CT1291 (n = 20), CT3176 (n = 14), CT1814 (n = 13) och CT2410 (n = 11), följt av 11 andra CT:er som identifierades i mindre än 10 isolat vardera (figur 1). Alla isolat hänfördes till två KL-typer, KL64 (n = 86) och KL47 (n = 49) (figur S2). Inga hypermucoviskösa isolat hittades. Virulensgenanalysen visade att inga isolat som bar alla biomarkörer för differentiering av hvKp- och cKp-isolat hade rapporterats tidigare (figur 1, figur S2).18

Figur 1 Fylogenetisk analys av 135 isolat i denna studie. Grenarna för olika isolat av CT-typ visas i färg. Motsvarande isolat för varje CT-typ är CT1291 (P1291-1 till P1291-20), CT1313 (P1313-1 till P1313-33, AH1313-1 till AH1313-2), CT1689 (AH1689-1 till AH1689-8), CT1772 (AH1772-1 till AH1772-4), CT1814 (AH1814-1 till AH1814-13), CT1819 (AH1819), CT2405 (P2405-1 till P2405-9), CT2410 (P2410-1 till P2410-11), CT2418 (P2418-1 till P2418-4), CT2444 (P2444), CT2445 (P2445-1 till P2445-6), CT3175 (AH3175-1 till AH3175-2), CT3176 (AH3176-1 till AH3176-14), CT3178 (AH3178-1 till AH3178-4), CT3179 (AH3179-1 till AH3179-2) och CT3195 (AH3195). rmpA, rmpA2, magA iroB, peg-344 och iucA identifierades för differentiering av hypervirulent K. pneumoniae från klassisk K. pneumoniae i en tidigare studie18 .

Klinisk dataanalys

Det fanns inga signifikanta skillnader mellan CT:erna när det gällde demografi, infektionstyper, huvudsakliga komorbiditeter, invasiva operationer, Charlson comorbidity index och Pitt bacteraemia score, med undantag för central venkateter, och alla orsaker till dödlighet på sjukhus (P = 0,035 och P = 0,001, Fisher’s exact test). Patienter infekterade med CT3176 hade signifikant högre dödlighet (78,6 % vs 37,1 %, P = 0,012; 78,6 % vs 20,0 %, P = 0,001; 78,6 % vs 7,7 %, P = 0,0003; 78,6 % vs 31,0 %, P = 0,004; Fishers exakta test) jämfört med CT1313-, CT1291-, CT1814- och övriga CT-grupper, respektive. Användningen av centrala venkatetrar i CT1814 var signifikant högre än i CT1313 och CT1291 (84,6 % vs 51,4 %, P = 0,049; 84,6 % vs 35,0 %, P = 0,011, Fishers exakta test) (tabell 1).

Tabell 1 Demografiska uppgifter, komorbiditeter, Invasiva procedurer och dödlighet hos patienter med karbapenemresistenta Klebsiella pneumoniae-infektioner

Pan-GWAS-analys

För att identifiera den genetiska grunden för CT3176 utförde vi en Pan-GWAS-analys mellan CT3176- och icke-CT3176-gruppen. Vi identifierade 39 gener med kända funktioner som är associerade med CT3176 (P < 0,01 justerat med Benjamini-Hochbergs metod) (figur 2), inklusive virulensfaktorer, kapselsyntesgener, antimikrobiell resistensgener och multidrug efflux transportörer. Bland dem hade ampR det största sambandet med CT3176. Vi noterade dock att andra CT, såsom CT3178 och vissa CT1689-isolat (AH1689-2 och AH1689-6), också bar på ampR-genen (figur 1). Alla isolat som bär på ampR-genen tillhör KL47.

Figur 2 Pan-GWAS-analys mellan grupperna CT3176 och icke-CT3176. Pangenom och associationer beräknades med Roary och Scoary. En plot map genererades med ggplot2.

Proteomanalys

Tre ampR+ (AH3176-1, AH3178-1 och AH1689-2) och tre ampR- (AH1689-3, AH1689-4 och AH1689-5) isolat valdes ut för proteomanalys. Totalt 3093 proteiner identifierades i båda grupperna baserat på 36 727 unika peptider. Slutligen identifierade vi 24 differentiellt uttryckta proteiner (DEP). Bland dem var 15 uppreglerade och 9 nedreglerade i ampR+-isolat jämfört med ampR-isolat (figur 3A-C, tabell S2). WcaJ hade den högsta vikförändringen och lyftes därför fram.

Figur 3 Proteomanalys och kapselfärgning. (A) Volcano plot som visar jämförelsen av kvantitativt proteinuttryck mellan ampR+ (AH1689-2, AH3176-1 och AH3178-1) och ampR- (AH1689-3, AH1689-4 och AH1689-5) Klebsiella pneumoniae isolat. (B, C) Differentiellt uttryckta proteiner med en vikförändring över 1,2 är markerade i färg.

Virulens i djurmodeller och kvantifiering av kapslar

För att identifiera ampR:s roll i virulensen hos icke-hypermucoviskösa CRKP-isolat valde vi ut tre isolat (AH3176-1, AH1689-2 och AH1689-3) och testade virulensen i en musmodell. AH3176-1 och AH1689-2 var två ampR+-isolat, medan AH1689-3 var ampR-isolat (figur 1). Dessutom valde vi också ut två hypermucoviskösa stammar GM2 och GM6 från vår samling för att testa virulensen. Både GM2 och GM6 tillhör KL1, varav GM6 bär ampR-genen medan GM2 inte gör det. AmpR-sekvensen hos den icke hypermucoviskösa KL47-stammen skiljer sig dock från sekvensen hos den hypermucoviskösa KL1-stammen, så de benämns ampRKL1 respektive ampRKL47 i den här studien.

Som framgår av figur 4A hade AH3176-1 och AH1689-3:ampRKL47 plus arabinos en överlevnad på 0 % med ett inokulum på 1 × 107 kolonibildande enheter (CFU) vid 4 dagar efter infektion, medan 20 % överlevnad med AH1689-2, 40 % överlevnad med AH1689-3:ampRKL47 utan arabinos, 60 % överlevnad med AH1689-3:pBAD33 och ATCC70721, och 80 % överlevnad med AH1698-3 observerades vid 7 dagar efter infektion. Överlevnaden minskade signifikant efter komplementering med ampRKL47-genen i AH1689-3 (n = 10; P = 0,033, log-rank Mantel-Cox-test), vilket tyder på ampR:s viktiga roll för virulens. Infektion av möss med AH3176-1 resulterade i cirka 10-100 gånger högre CFU i lungorna jämfört med andra isolat (figur 4B). Patologin i lungorna visade olika grader av förtjockning av alveolväggarna, lymfocytinfiltration och intravaskulär blödning i infektionsgruppen. Bland dem var de lungpatologiska förändringar som orsakades av AH3176-1 de allvarligaste och presenterade sig som omfattande lungkonsolidering och intraalveolär blödning (figur 4D-F).

Figur 4 Virulenspotential hos icke-hypermucoviscösa Klebsiella pneumoniae-isolat i en modell för infektion av lungor hos mus. (A) Effekten av 1 × 107 kolonibildande enheter (CFU) av AH3176-1, AH1689-2, AH1689-3 och AH1689-3 ampRKL47 komplementmutant på överlevnad bedömdes. (B) Vid 24 timmar efter infektion (hpi) skördades lungorna från infekterade möss och bakteriebördan bestämdes genom CFU-räkning (n = 10; *P < 0,05, **P < 0,01, envägs ANOVA). Data är representativa för tre oberoende experiment. (C) Uronsyraproduktion av olika stammar. Ett oparat tvåsidigt Student’s t-test utfördes. Varje datapunkt upprepades tre gånger (n = 3). Data presenteras som medelvärde ± s.e.m. *P < 0,05, ns = ingen signifikans. Lungorna från möss utan infektion (D) eller infekterade med ATCC700721 (E) och AH3176-1 (F) samlades in och färgades med hematoxylin och eosin. Alla bilder är vid ×40 förstoring. Skalstreck: 250 μM.

Som framgår av figur 5A var överlevnaden hos möss som infekterats med GM6 betydligt lägre än hos GM2 och ATCC700721. En minskning av överlevnaden observerades efter komplettering av ampRKL1 i GM2. Dessutom var bakteriebelastningen i lungorna hos möss som infekterats med GM6 betydligt högre än hos GM2 och ATCC700721 (figur 5B). HE-färgning visade att GM6-infektion orsakade omfattande konsolidering av lungorna och intraalveolär blödning (figur 5E-G). Överlevnaden påverkades dock inte om ampRKL47 infördes i GM2 (figur 5C).

Figur 5 Virulenspotential hos hypermucoviskösa Klebsiella pneumoniae-isolat i en modell för lunginfektion hos mus. (A) Effekten av 1 × 106 kolonibildande enheter (CFU) av GM2, GM6 och GM2 ampRKL1 komplementmutant på överlevnad bedömdes (n = 10; *P < 0,05, **P < 0,01, log-rank Mantel-Cox test),). (B) 24 timmar efter infektionen (hpi) skördades lungorna från infekterade möss och bakteriebördan bestämdes genom CFU-räkning (n = 10; **P < 0,01, envägs ANOVA). Data är representativa för tre oberoende experiment. (C) Effekten av 1 × 106 CFU av GM2 och GM2 ampRKL47 komplementmutant på överlevnad bedömdes. (D) Uronsyraproduktion av olika stammar. Ett oparat tvåsidigt Student’s t-test utfördes. Varje datapunkt upprepades tre gånger (n = 3). Data presenteras som medelvärde ± s.e.m. *P < 0,05, ns = ingen signifikans. Lungorna från möss utan infektion (E) eller infekterade med GM2 (F) och GM6 (G) samlades in och färgades med hematoxylin och eosin. Alla bilder är vid ×40 förstoring. Skalstreck: 250 μM.

Med tanke på att kapseln är den viktigaste virulensfaktorn hos K. pneumonia och att WcaJ, som lyftes fram enligt resultatet av proteomanalysen, reglerar det inledande steget i kapselsyntesen, undersökte vi mängderna av kapselpolysackaridproduktionen. Resultatet visade att de ampR-komplementära stammarna AH1689-3:ampRKL47 och GM2:ampRKL1 plus arabinos producerade betydligt mer kapselpolysackarid (uronsyra) än AH1689-3 respektive GM2 (figur 4C, figur 5D).

Diskussion

MLST har varit den vanligaste tekniken för att definiera populationer av K. pneumoniae. Med snabb och prisvärd WGS är det möjligt att jämföra hela genomer för isolattypning snarare än bara några få loci, som i traditionell MLST. Vid genotypning med cgMLST används tusentals alleler i hela genomet, vilket ger en högre grad av isolatdiskriminering. I den här studien använde vi cgMLST för att klassificera 135 kliniska CRKP-isolat och fann skillnader mellan CT-typer baserade på klinisk information. På grund av det begränsade antalet fall kunde vi inte få fram ett samband mellan CT-typer och kliniskt utfall. Skillnaderna i dödlighet gjorde det dock möjligt för oss att ytterligare undersöka de isolat som tillhör CT3176. GWAS-analysen visade att ampR-genen var signifikant associerad med CT3176-isolaten.

Premiärstudier har visat att AmpC-β-laktamasregulatorn AmpR, en medlem av LysR-familjen av transkriptionsfaktorer, också kontrollerar flera virulensmekanismer hos Pseudomonas aeruginosa.29,30 Hittills har endast en artikel rapporterat AmpR:s roll i regleringen av virulensen hos K. pneumoniae. Ett klonalt isolat av K. pneumoniae visade att få kända virulensgener var ansvariga för allvarliga infektioner. AmpR i dessa isolat var involverad i uppregleringen av kapselsyntesen, modulerade biofilmsbildningen och genuttrycket av typ 3 fimbrialgenerna samt koloniseringen av murins mag-tarmkanal.31 Virulensnivån hos dessa isolat förblir dock oklar på grund av bristen på data om dödliga infektionsmodeller. I den här studien använde vi en lunginflammationsmodell för att bekräfta den ökade virulensen hos dessa ampR-bärande isolat. Detta skulle förklara varför patienter som infekterats med dessa isolat hade en hög dödlighet.

Tidigare var det vanligt att K. pneumoniae av ST11-typ var resistent mot karbapenemer men inte hypervirulent. År 2017 rapporterades dock ett utbrott av sjukhusinfektioner orsakade av ST11 karbapenemresistenta hypervirulenta K. pneumoniae-isolat. Den hypervirulenta fenotypen hos dessa isolat berodde på förvärvet av en cirka 170 kbp pLVPK-liknande virulensplasmid av klassiska CRKP-isolat som tillhör ST11 och serotyp K47.15 I motsats till ovanstående rapport hittades inga virulensplasmider i ST11 CRKP-isolat med ökad virulens i den här studien, vilket tyder på att virulensförstärkningen inte berodde på den klassiska mekanismen.32 Till skillnad från virulensplasmidet som innehåller flera virulensfaktorer, kan AmpR öka virulensen oberoende av varandra. Detta bekräftades genom virulensprov av ampR-komplementstammen.

WcaJ är det enzym som inleder kolansyrasyntesen och laddar det första sockret (glukos-1-P) på lipidbäraren undecaprenylfosfat. WcaJ:s potentiella roll i K. pneumoniaes virulens definierades nyligen.33 Resultaten av proteomanalysen tyder på att AmpR ökar virulensen hos K. pneumoniae genom att reglera det inledande steget i kapselsyntesen. Som regulator måste AmpR binda till genpromotorn för att utöva sin reglerande roll. Hittills har många kapseltyper identifierats i K. pneumoniae,34 och avsaknaden av AmpR-bindningsställen i vissa kapseltyper kan förklara varför virulensen hos KL1-isolat inte kan förstärkas av den AmpR som finns i KL47-isolat.

Nya bevis har föreslagit att hypermucoviskositet och hypervirulens är olika fenotyper som inte bör användas synonymt. Dessutom är det viktigt att fastställa att ett negativt strängtest är otillräckligt för att avgöra om ett isolat är hypervirulent.35 Ett viktigt resultat av vårt arbete var att vi identifierade en icke-hypermukoviskös ST11 CRKP-subklon med ökad virulens.

Den största begränsningen i denna studie är att det bara finns ett litet antal fall, därför kan vi inte studera förhållandet mellan de kliniska resultaten och icke-hypermukoviskös hypervirulent CRKP-infektion. Vi kunde inte heller konstruera ampR-knockoutstam, och detta kan förklaras av att genomisk analys visade att ampR förmodligen var lokaliserad på plasmid (figur S3). Eftersom stammar med den icke-hypermucoviskösa fenotypen knappast särskiljs i kliniken, behövs fortsatt övervakning och undersökning av dessa nya stammar snarast.