Anakinra, en rekombinant human interleukin-1-receptorantagonist, hämmar apoptos vid experimentell akut hjärtinfarkt

Akut hjärtinfarkt är en av de främsta orsakerna till sjuklighet och dödlighet i världen. AMI orsakas av plötslig ischemi i myokardiet och efterföljande nekros. Överlevare av AMI löper fortfarande stor risk att dö under åren efter indexhändelsen. Eftersom behandlingen av AMI har förbättrats avsevärt under de senaste åren är det fler patienter som överlever AMI. Den vanligaste komplikationen till AMI är vänsterkammardysfunktion och hjärtsvikt. Den initiala ischemiska skadan på myokardiet aktiverar en kaskad av händelser som så småningom leder till negativ remodellering av hjärtat och hjärtsvikt med påföljande överskott av sjuklighet och dödlighet.1 Den remodelleringsprocess som sker i det ischemiska och icke ischemiska myokardiet medieras av upp- och nedreglering av olika vägar som utlöser kardiomyocythypertrofi och apoptos i en ömtålig balans mellan död och överlevnad.1,2 Interleukin-1 (IL-1) receptorantagonist (IL-1Ra), en medlem av IL-1-familjen, är ett naturligt förekommande antiinflammatoriskt protein som beter sig som en akutfasreaktant.3,4 I likhet med andra akutfasreaktanter ökar IL-1Ra-nivåerna under AMI, och nivåerna korrelerar med prognosen.5,6 Den roll som ökningen av IL-1Ra spelar under AMI är oklar, och det har spekulerats i att dess roll sträcker sig från att bara vara en markör för skador till att vara en modulator av det inflammatoriska svaret till ett potentiellt cytoprotektivt medel.5,8 Nyligen har man visat att tvångsuttryck av IL-1Ra i en djurmodell är kardioprotektivt i form av minskad infarktstorlek och minskad apoptos8 .

I denna studie undersökte vi effekterna av anakinra, ett exogent rekombinant humant IL-1Ra, i två experimentella modeller med hjälp av kirurgisk ligering av vänster kranskärl hos gnagare: En studie av omedelbar administrering av anakinra i musmodellen för att bedöma dess effekter på apoptos, infarktstorlek och remodellering och en studie av fördröjd (24 timmar) administrering av anakinra för att bedöma dess effekter på apoptos oberoende av potentiella infarktsparande effekter och på kardiell remodellering i råttmodellen (för att även bedöma eventuella skillnader mellan arter). Dessutom testades den antiapoptotiska effekten av anakinra in vitro.

Metoder

Kirurgiska förfaranden

Alla djur tillhandahölls av Harlan Sprague Dawley (Indianapolis, Ind). Alla djurförsök utfördes enligt riktlinjerna för human användning och skötsel av försöksdjur för biomedicinsk forskning som publicerats av National Institutes of Health (nr 85-23, reviderad 1996). Vuxna hanar av Outbred Institute of Cancer Research-möss (ålder 10 veckor, vikt 26-38 g) och vuxna Wistar-råttor (ålder 10 veckor, vikt 350-500 g) genomgick koronar ligatur. De kirurgiska ingreppen utfördes dag 1 av två skickliga operatörer (F.N.S. och S.S.) enligt tidigare beskrivning.9,10 Djuren under bedövning (pentobarbital 50-70 mg/kg) intuberades och placerades i höger decubitus och genomgick sedan en kirurgisk öppning av bröstkorgen och ligering av den proximala vänstra kranskärlen. Åtta möss och åtta råttor genomgick en skenoperation som omfattade alla steg utom koronarligationen; hälften behandlades med dagliga injektioner av anakinra (1 mg/kg) och den återstående hälften behandlades med injektioner av saltlösning. Institutional Animal Care and Use Committee vid Virginia Commonwealth University godkände studien. Tio möss och fyra råttor dog under den omedelbara postoperativa perioden och ingick inte i någon av analyserna.

Behandling

Två delstudier genomfördes: omedelbar anakinraadministrering under ischemi hos musen och fördröjd anakinraadministrering 24 timmar efter ischemi hos råttan. I musmodellen gavs anakinra 1 mg/kg (motsvarande den rekommenderade dosen för behandling av reumatoid artrit) intraperitonealt under operationen och sedan dagligen i 6 doser till 20 möss (16 med kranskärlsligatur och 4 skenopererade). I råttmodellen gavs anakinra intraperitonealt på dag 2 och sedan dagligen i 5 doser till 8 råttor (4 med kranskärlsligering och 4 shamopererade). De återstående 24 mössen (20 med kranskärlsligering och 4 shamopererade) och 12 råttor (8 med kranskärlsligering och 4 shamopererade) fick NaCl 0,9 % (koksaltlösning) injicerat. Två olika gnagararter användes för att utvärdera eventuella skillnader mellan arter. Ytterligare 28 möss genomgick en bedömning av infarktstorleken 24 timmar efter operationen: 6 saltvattenbehandlade möss och 22 möss som behandlades med ökande doser av anakinra (1 mg/kg , 10 mg/kg och 100 mg/kg ) för att bedöma de potentiella dosberoende infarktsparande effekterna av anakinra. Slutligen avlivades ytterligare 6 möss (3 behandlade med anakinra och 3 behandlade med saltlösning) 7 dagar efter koronar ligatur för utvärdering av uttrycket av matrismetalloproteinas-9 (MMP-9). Totalt användes 78 möss och 20 råttor i denna studie.

Bedömning av infarktstorlek

Tjugofyra timmar efter avslutat infarktprotokoll avlägsnades hjärtat snabbt och monterades på en Langendorff-apparat. Kranskärlen perfunderades med 0,9 % NaCl innehållande 2,5 mmol/L CaCl2. Efter att blodet tvättats ur injicerades ≈2 ml 10 % Evansblått färgämne som en bolus i aorta tills större delen av hjärtat blev blått. Hjärtat perfunderades med saltlösning för att tvätta bort överskottet av Evansblått. Slutligen avlägsnades hjärtat, frystes och skars upp i 8-10 tvärgående skivor från topp till bas av samma tjocklek (≈1 mm). Skivorna inkuberades sedan i en 10 % trifenyltetrazoliumkloridlösning i en isotonisk fosfatbuffert (pH 7,4) i rumstemperatur i 30 minuter. Områdena med infarktvävnad, riskzonen och hela vänster kammare bestämdes genom datormorfometri med BIOQUANT imaging software (BIOQUANT Image Analysis Corp, Nashville, Tenn). Infarktstorleken uttrycktes i procent av det ischemiska riskområdet, som bestämdes i procent av vänster kammare.

Echokardiografi

Transthorakal ekokardiografi under lätt bedövning (pentobarbital 30 till 50 mg/kg) utfördes strax före operationen och 7 dagar efter operationen strax före döden. Dopplerekokardiografi utfördes med bildsystem Vevo770 (VisualSonics Inc, Toronto, Ontario, Kanada) och en 30 MHz-sond hos musen; ett ekokardiografisystem utrustat med en 15 MHz fasarray transducer (Hewlett-Packard, Palo Alto, Calif) användes hos råttan. Transducern placerades på den vänstra främre sidan av bröstkorgen. Hjärtat avbildades först i tvådimensionellt läge i den korta axelvyn av vänster kammare. M-mode-markören placerades vinkelrätt mot den främre och bakre väggen för att mäta vänster kammares (LV) änddiastoliska och änd-systoliska diametrar (LVEDD respektive LVESD). I enlighet med rekommendationerna från American Society of Echocardiography11 togs sedan M-modebilder i nivå med papillarmusklerna under mitralisklaffens spets. Hos musen togs även apikala 4- och 5-kammarbilder för att mäta transmittralflödet, vänster kammares utflöde och transaortiska flödeshastigheter. LV:s fraktionella förkortning (FS) beräknades enligt följande: FS=(LVEDD-LVESD)/LVEDD×100. Ejektionsfraktionen beräknades med Teichholz-formeln. Transmittrala och vänster kammares utflödeskanal pulserade dopplerflödesspektrum erhölls från den apikala vyn. Mätning av flödet i utflödesbanan utfördes. Isovolumetriska kontraktions- (ICT) och relaxationstider (IRT) samt ejektionstid (ET) mättes. Även flödeshastighet-tids-integral (AoVTI) i LV-utflödesbanan (LVOT) mättes. Dessa data användes för att beräkna Tei-index (Tei-index=ICT+ IRT/ET)12 och hjärtminutvolym (CO=AoVTI×π×(LVOT-diameter/2)2×hjärtfrekvens, där LVOT mättes som tvärsnittsarean i den parasternala långaxliga vyn). Hos människor är ett högre Tei-index förknippat med både systolisk och diastolisk dysfunktion och sämre resultat12 . Tilldelningen till olika behandlingar var slumpmässig, och den undersökare som utförde och läste ekokardiogrammet var blindad för behandlingen.

Patologi

Dag 7, efter ekokardiografi och under anestesi, kanaliserades bukaorta med en polyetenkateter, thorax öppnades, aorta fylldes med fosfatbuffert (0,2 mol/L, pH 7,4) och heparin (100 IE) och höger förmak skars upp för att möjliggöra dränering. I snabb följd stoppades hjärtat i diastole och perfusion med fosfatbuffratformalin påbörjades. Endast hos råttorna togs 1 till 2 ml helblod från hjärtat för bestämning av cytokinplasma. Den vänstra ventrikelkammaren fylldes med fixeringsmedel för 10 minuters fixering. I slutet av förfarandet togs tvärsnitt av den mediana tredjedelen av vänster kammare och förvarades i formalin i minst 48 timmar. Apoptos definierades genom färgning för terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling (TUNEL; DNA-fragmentering, Oncor, Gaithersburg, Md). Det detaljerade protokollet har publicerats på annat håll.13 Peri-infarktområdet definierades som den zon som gränsar till infarkten där det förekom livskraftigt myokardium.13 Apoptosfrekvensen uttrycktes som antalet apoptotiska kardiomyocyter på alla kardiomyocyter per fält. Kostnadsfärgning för TUNEL och muskelaktin (förspädd antikropp mot α-sarkomeriskt aktin från mus, Invitrogen, San Francisco, Kalifornien) utfördes för att dokumentera celltypen. Vi betraktade främst apoptos i kardiomyocyter men mätte även apoptos i granulationsvävnad (aktin-negativa mononukleära celler) i infarktområdena.

Antalet leukocyter i myokardiet mättes som antalet CD45+-celler per 1 mm2 (med hjälp av en anti-mus-CD45-antikropp, spädning 1:100, Southern Biotech, Birmingham, Ala) och jämfördes mellan anakinra- och salinbehandlade AMI-möss. Apoptosfrekvensen i de peri-infarkta regionerna beräknades i 10 slumpmässiga fält, som täcker nästan hela det peri-infarkta området. Utredarna som utförde cellräkningen var omedvetna om behandlingsallokeringen.

Vi mätte myokardfibros 7 dagar efter AMI hos musen för att ta reda på om omedelbar användning av anakinra var förknippad med försämrad infarktläkning. Hjärtsektioner färgades med Massons trichromfärgningar (Sigma-Aldrich, St Louis, Mo). I korthet betades sektionerna i Bouins lösning över natten och tvättades i rinnande kranvatten för att avlägsna det gula. Sektionerna färgades med Mayers hematoxylin, Biebrich scarlet-acid fuchsin, fungerande fosfotungstic/fosfomolybdiksyra-lösning och anilinblått i 5 minuter vardera och placerades sedan i 1 % ättiksyra i 2 minuter. Sektionerna sköljdes, dehydratiserades i alkohol, klarades i xylen och monterades. Cytoplasma och muskelfibrer är röda, kollagen och kärnor är blå. Fibrosområdet och hela vänster kammare bestämdes genom datormorfometri med hjälp av en BIOQUANT-bildbehandlingsprogramvara, och förhållandet användes för att beräkna ärrområdet uttryckt i procent av vänster kammare. Förhållandet mellan fibros och livskraftigt myokard i det peri-infarkta området (interstitiell fibros) bestämdes genom datormorfometri med hjälp av en ×20 förstoring och uttrycktes som en procentandel av ytan. Von Kossa-färgning (Diagnostic Biosystem, Pleasanton, Calif) användes för att upptäcka (pre)nekrotiska myokardiska kalkavlagringar.

Cytokinnivåer

Helblod togs ut i natriumcitratrör hos 9 råttor (4 som behandlades med anakinra och 5 som behandlades med normal koksaltlösning) vid dödsögonblicket och centrifugerades omedelbart a 1000 g vid 4 °C i 10 minuter. Supernatanten samlades upp och filtrerades genom ett 0,22-μm-filter. Proverna förvarades därefter vid -20 °C och analyserades därefter. Ett multiplex cytokinbead array-system (Bio-Plex Cytokine Assay, Bio-Rad, Hercules, Calif) användes enligt tillverkarens anvisningar för att bestämma cirkulerande nivåer av IL-1β, tumörnekrosfaktor-α, IL-6 och interferon-γ. Reaktionsblandningen avlästes med Bio-Plex protein array reader och data analyserades med mjukvaruprogrammet Bio-Plex Manager.

MMP-syntes

MMP-9, eller gelatinas B, valdes ut som prototypiskt metalloproteinas uppreglerat efter AMI och associerat med ogynnsam remodellering.14,15 Totalt lösligt protein extraherades från infarkt och peri-infarkt myokardiet 7 dagar efter koronar ligatur hos 6 möss (3 behandlade med anakinra och 3 med koksaltlösning) med en buffert av 20 mmol/L Tris, 150 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA och 1 mmol/L EGTA. Homogenatet centrifugerades vid 14 000 g i 10 minuter vid 4 °C och supernatanten återfanns. Därefter separerades 50 μg protein från varje prov genom 7,5 % akrylamidgeler, överfördes till ett nitrocellulosamembran och blockerades sedan med 5 % fettfri torrmjölk i Trisbuffrad saltlösning Tween-20 (10 mmol/L Tris-HCl, pH 7,4, 100 mmol/L NaCl och 0,1 % Tween 20) i 1 timme. Membranet inkuberades sedan med getpolyklonala primära antikroppar i en spädning på 1:1000 för MMP-9 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Calif) i 16 timmar vid 4 °C innan det tvättades och inkuberades med anti-rabbit-porseradiskt peroxidas-konjugerad sekundär antikropp (1:2000; Amersham Biosciences, Inc, Piscataway, NJ) i 1 timme. Blotsen utvecklades med ett kemiluminiscent system. Två band var synliga, motsvarande pro-MMP-9 och aktivt MMP-9. Endast det aktiva bandet (105 kDa) av MMP-9 valdes ut för mätning. Den optiska densiteten för varje band skannades och kvantifierades med densitometri och uttrycktes som förhållandet mellan aktivt MMP-9 och β-actin.

Antiapoptotiska effekter av Anakinra in vitro

De ventrikulära kardiomyocyterna isolerades från råttan med en enzymatisk teknik som modifierats enligt tidigare beskrivning.16 Kortfattat sövdes råttan med pentobarbitalnatrium (100 mg/kg IP), och hjärtat avlägsnades snabbt från bröstet. Inom tre minuter kanaliserades aortaöppningen till ett Langendorff-perfusionssystem och hjärtat perfunderades retrograd. Den enzymatiska digestionen påbörjades genom att tillsätta kollagenas typ II (0,5 mg/ml vardera; Worthington Biochemical Corp, Lakewood, NJ) och proteas typ XIV (0,02 mg/ml) till perfusionsbufferten och fortsatte i ≈15 minuter. Därefter tillsattes 50 μmol/L Ca2+ till enzymlösningen för att perfusionera hjärtat i ytterligare 10 till 15 minuter. Den uppslitna ventrikelvävnaden skars i bitar och sögs försiktigt upp med en överföringspipett för att underlätta celldissocieringen. Cellpelletsen resuspenderades för en Ca2+-återställningsprocedur i tre steg (dvs. 125, 250 och 500 μmol/L Ca2+). De nyligen isolerade kardiomyocyterna suspenderades sedan i minimalt essentiellt medium (katalognummer M1018, pH 7,35-7,45, Sigma). Cellerna pläterades sedan på 35 mm cellodlingsskålar som förbelagts med 20 μg/mL muslaminin i fosfatbuffrad saltlösning med 1 % penicillin-streptomycin i 1 timme. Kardiomyocyterna odlades i närvaro av 5 % CO2 i 1 timme i en fuktig inkubator vid 37 °C, vilket gjorde det möjligt för kardiomyocyterna att fästa på tallriksytan före experimentprotokollet. Kardiomyocyterna utsattes sedan för simulerad ischemi i 40 minuter genom att cellmediet ersattes med en ”ischemi-buffert” som innehöll 118 mmol/L NaCl, 24 mmol/L NaHCO3, 1,0 mmol/L NaH2PO4, 2,5 mmol/L CaCl2-2H2O, 1,2 mmol/L MgCl2, 20 mmol/L natriumlaktat, 16 mmol/L KCl och 10 mmol/L 2-deoxyglukos (pH justerat till 6,2). Dessutom inkuberades cellerna under hypoxiska förhållanden vid 37 °C under hela den simulerade ischemi-perioden genom att tri-gasinkubatorn justerades till 1 % till 2 % O2 och 5 % CO2. Efter 40 minuter simulerades reperfusion genom att ischemibuffern ersattes med normalt medium under normoxiska förhållanden. Samtidigt tillsattes anakinra till plattan i ökande (×100) koncentrationer från en koncentration på 25×10-16g/mL till en koncentration på 25×10-6g/mL (n=3 per grupp). En motsvarande volym normalt medium tillsattes till 3 plattor för att fungera som kontroller. Plattorna inkuberades i 18 timmar. Kardiomyocyternas apoptos analyserades genom TUNEL-färgning med ett kit köpt från BD Biosciences (San Jose, Kalifornien) som upptäcker kärn-DNA-fragmentering via en fluorescensanalys. Kort sagt, efter 40 minuters simulerad ischemi och 18 timmars reperfusion fixerades cellerna i tvåkammarglas med 4 % formaldehyd/fosfatbuffrad koksaltlösning vid 4 °C i 25 minuter och utsattes för TUNEL-analys enligt tillverkarens protokoll. Objektglasen kontrafärgades sedan med Vectashield mounting medium med 4,6-diamidino-2-phenylindol (ett DNA-interkalerande färgämne för visualisering av kärnor i fixerade celler; katalognummer H-1200, Vector Laboratories, Burlingame, Kalifornien). De färgade cellerna undersöktes i ett Olympus IX70 fluorescensmikroskop (Olympus Inc, Center Valley, Pa).

Anakinra upptag in vitro

HL-1-celler, en cellinje av hjärtmuskelceller från mus som behåller fenotypiska egenskaper hos vuxna kardiomyocyter, odlades till konfluens i Claycomb-medium (Sigma Chemical Co) kompletterat med 10 % FCS (JHR Bioscience, Ltd, Andover, Hampshire, UK) och noradrenalin 0.1 mmol/L (Sigma Chemical Co) på gelatin/fibronectinbelagda 22 mm glaslock som placeras på botten av 35 mm Petriskålar.17 FITC-konjugerad anakinra (10 μg/mL) tillsattes sedan till cellerna och cellerna inkuberades vid 37 °C i antingen normoxiska eller hypoxiska (2 % syre) förhållanden i en Micro galaxy, RS Biotech inkubator i 5 timmar. Cellerna tvättades sedan två gånger med Hanks saltlösning innehållande 10 % FCS. Kärnorna kontrafärgades med Hoechst och observationerna utfördes med ett Leica DM 2000 fluorescensmikroskop (Meyer Instruments Inc, Houston, Tex).

Caspase-1- och -9-aktivitetsanalyser

Hämning av anakinra av caspase-1- och -9-aktiviteterna analyserades med hjälp av kommersiella testkit (QuantiZyme assay system, Plymouth, Pa) med användning av rekombinant humant caspas-1 och YVAD-AMC, en variation av sekvensen YVHD som finns vid pro-Il-1β-klyvningsstället, som fluorogent substrat för caspas-1 och Ac-LEHD-AMC för caspas-9. Experimentet utfördes vid 22 °C med en fluorometrisk plattläsare (SLT, Fluostar, Tecan US, Research Triangle Park, NC) i kinetiskt läge med excitations- och emissionsvåglängder på 390 respektive 460 nm. En startkoncentration på 11,5 μmol/L (motsvarande Km för caspas-1) användes för substratet och ökades sedan till 37,5 μmol/L för att testa för kompetitiv och icke-kompetitiv hämning.18 För anakinra valdes en startdos på 100 nmol/L i närvaro eller frånvaro av 10 μg/mL polyklonal anti-IL-1Ra-blockerande antikropp (R&D Systems, Minneapolis, Minn) och ökades sedan till 300 och 900 nmol/L för att utvärdera om det fanns en dosresponskurva. Korrigeringar från tomgång utförs och kurvorna anpassas till ett 0,0-intercept eftersom aktiviteten antas vara 0 vid tidpunkt 0. Regressionssluttningar (r>0,95) erhålls för varje försök vid varje dos, och koefficienterna jämförs mellan de tre grupperna (anakinra, kontroll, anakinra plus blockerande antikropp). Experimenten utfördes i tre exemplar för varje grupp och kurvorna kördes minst 5 gånger för varje prov. Sannolikhetsvärdet återspeglar 1-vägs ANOVA mellan grupper med 2-sidigt post-hoc Dunnetts test där varje grupp jämförs med anakinra.

Fysisk interaktion och bindning mellan anakinra och caspase-1 och -9 testades med hjälp av coimmunoprecipitation. Anakinra (1 μg) inkuberades med kommersiellt tillgänglig rekombinant humant caspase-1 och -9 (1 μg, BIOMOL International, Plymouth Meeting, Pa) i 1 timme vid 4 °C. Blandningen fälldes sedan ut genom att tillsättas till två olika uppsättningar Sepharosepärlor kopplade med anti-IL-1Ra (Santa Cruz) eller anti-caspase-1-antikropp (Santa Cruz). Sefarosbundna fraktioner kokades i SDS-buffert och separerades i SDS-PAGE. De samfällda proteinerna i varje inställning immunoblotterades sedan och analyserades med Western blot. Anti-IL-1Ra och anti-caspase-1 eller -9-antikroppar användes för att detektera immunoreaktivitet av anakinra respektive caspase-1 i samfällningen. Om inget samprecipitat hade uppstått förväntades ett enda band under Western blot som motsvarade den lösliga antikroppen av samma typ som den antikropp som var bunden till sefarospärlorna (dvs. immunfärgning för IL-1Ra i utfällningsanalysen av IL-1Ra-bundna sefarospärlor). Om samutfällning hade skett skulle vi förvänta oss ett dubbelt band för båda de lösliga antikropparna i båda utfällningsanalyserna (totalt 4 band). Anakinra och caspase-1 eller -9 kördes i Western blot i ytterligare linjer och användes som positiva kontroller.

Statistisk analys

Statistisk analys utfördes med SPSS 11.0-paketet för Windows (SPSS Inc, Chicago, Ill). Kontinuerliga variabler uttrycks som medelvärde och SE. Envägs ANOVA användes för att jämföra medelvärden mellan flera (>2) grupper med post hoc 2-sidigt Dunnett-test för att specifikt jämföra effekter mellan försökspersoner med kontroller i varje grupp. T-testet för oparade data användes endast för att jämföra medelvärden mellan två grupper. ANOVA med slumpmässiga effekter för upprepade åtgärder användes för att jämföra ekkokardiografiska parametrar före och efter ingreppet mellan de fyra olika grupperna med ett post hoc-test av Dunnett med två sidor för att särskilt jämföra effekterna mellan ämnena (anakinra- och salin-AMI-grupperna). Korrelationer mellan två kontinuerliga variabler bedömdes med Pearsons test. Kaplan-Meier-överlevnadskurvor konstruerades och log-rank-testet användes för att utvärdera om det fanns signifikanta skillnader mellan grupperna. Överlevnadssiffrorna jämfördes också med hjälp av Fishers exakta test. Ojusterade 2-svansade sannolikhetsvärden rapporteras genomgående, med statistisk signifikans satt på 0,05-nivån.

Författarna hade full tillgång till och tar fullt ansvar för dataintegriteten. Alla författare har läst och godkänner manuskriptet som det är skrivet.

Resultat

Studien omfattade bedömningen av effekterna av anakinra in vivo (i kranskärlsligeringsmodellen för mus och råtta) och in vitro (i primära kardiomyocytkulturer från råttor, HL-1-kardiomyocytkulturer och isolerad caspase-1).

In vivo administrering av Anakinra

överlevnad

Tjugoåtta möss avlivades efter 24 timmar för att bedöma infarktstorleken. Sex möss avlivades vid 7 dagar för analys av MMP-9-uttryck; dessa möss ingick inte i överlevnadsanalysen. Vid 7 dagar efter kranskärlsligering levde 15 av de 16 möss (94 %) som behandlades med anakinra jämfört med 11 av de 20 möss (55 %) som behandlades med koksaltlösning (P = 0,013, Kaplan-Meier log-rank-test; P = 0,021, Fisher’s exact-test). På samma sätt levde 4 av de 4 råttor (100 %) som behandlades med anakinra, medan endast 5 av de 8 råttor (62 %) som behandlades med saltlösning levde. Alla skenopererade möss (n=8) och råttor (n=8) levde efter 7 dagar.

Infarktstorlek

Ingen signifikanta skillnader i riskområde och infarktområde (uttryckt som infarktområde per riskområde) hittades mellan saltvattenbehandlade möss och möss som behandlades med anakinra i doser på 1 och 10 mg/kg. Anakinra 100 mg/kg var dock förknippat med en blygsam men ändå signifikant (13 %) minskning av infarktstorleken (P = 0,015 jämfört med saltvatten; figur 1).

Apoptos

Anakinraanvändning förknippades med en signifikant minskning av kardiomyocytapoptos i det peri-infarkta myokardiet i både den omedelbara och den fördröjda behandlingsgruppen (3,1±0,2 % jämfört med 0,5±0,3 %, P<0,001, respektive 4,2±0,4 % jämfört med 1,1±0,2 %, P<0,001; figur 2). Apoptosfrekvensen i det peri-infarkta myokardiet var direkt korrelerad med tecken på ogynnsam remodellering såsom LVEDD (r=0,65, P=0,001), LVESD (r=0,66, P<0,001), FS (r=-0,62, P=0,001), diastolisk tjocklek på främre väggen (r=-0,50, P=0,012) och systolisk tjocklek på främre väggen (r=-0,50, P=0,012). Apoptosfrekvensen i det avlägsna myokardiet var antingen odetekterbar eller mycket låg utan signifikanta skillnader mellan djur med AMI (0,03±0,03 %) och shamopererade djur (0,01±0,01 %) och mellan anakinrabehandlade (0,02±0,02 %) och salinbehandlade (0,03±0,03 %) djur (P>0,05 för alla analyser).

Myokardfibros och kalciumavlagringar

Ingen skillnad i myokardfibros (ärrbildning, uttryckt i procent av vänster kammare) hittades mellan anakinra- och saltlösningsbehandlade möss (31±2 % jämfört med 33±2 %; P=0,81; figur 1). Interstitiell fibros i det peri-infarkta området var minimal hos shamopererade möss (<0,1 %) men mer utbredd hos anakinra- och saltlösningsbehandlade möss utan några signifikanta skillnader mellan grupperna (13±2 % jämfört med 15±3 %; P=0,58; figur 1). Vi fann minimala mängder myokardiella kalkavlagringar med hjälp av von Kossa-färgning 1 vecka efter AMI (<0,1 %) utan några skillnader mellan anakinra- och salinbehandlade möss.

LV-remodellering och funktion

Vidare av LVEDD och LVESD före ingreppet var likadana i alla mus- och råttgrupper. Signifikanta ökningar av LVEDD och LVESD och minskningar av främre väggens diastoliska tjocklek, främre väggens systoliska tjocklek och FS hos saltlösningbehandlade möss (jämfört med baslinjen och sham ) observerades på dag 7 (figur 3). Jämfört med salinbehandlade möss hade anakinrabehandlade AMI-möss betydligt mindre ökningar av LVEDD och LVESD och minskningar av FS på dag 7 jämfört med baslinjen. Minskningen av främre väggens systoliska tjocklek tenderade också att vara mindre hos anakinrabehandlade möss (jämfört med salinbehandlade djur), vilket visar på en skyddande effekt i peri-infarktregionen, medan vi inte fann några signifikanta skillnader i bakre väggens diastoliska tjocklek (0,96±0,08 jämfört med 0,78±0,11, respektive; P=0,86) och bakre väggens systoliska tjocklek (1,32±0,08 jämfört med 1,14±0,12, respektive; P=0,44). Anakinra-behandlade möss hade också kortare värden för isovolumetrisk kontraktionstid (6±4 jämfört med 16±5 ms; P=0,022) och isovolumetrisk relaxationstid (12±5 jämfört med 29±8 ms; P=0,042) och följaktligen ett lägre Tei-index (som avspeglar myokardins prestanda) (0,28±0,03 jämfört med 0,66±0,07; P=0,044; Figur 3). FS/Tei-indexet, som korrelerar ännu närmare med invasiva mätningar av dP/dt,19 var också signifikant högre hos anakinrabehandlade (0,74±0,06 jämfört med salinbehandlade 0,17±0,02; P=0,008) AMI-möss. Inga skillnader hittades mellan salin- och anakinrabehandlade skenopererade möss (figur 3).

En liknande effekt på LVEDD och LVESD sågs i råttmodellen (figur 4). Den genomsnittliga procentuella ökningen av LVEDD och LVESD var signifikant större hos möss än hos råttor oberoende av behandlingsarm (P<0,001). Den absoluta minskningen av LVEDD- och LVESD-förändringar med anakinra var signifikant större hos möss än hos råttor (P<0,001); de procentuella minskningarna av LVEDD- och LVESD-förändringar var dock likartade hos möss (56±6 % respektive 53±5 %) och råttor (68±7 % respektive 47±4 %; P=0,66 respektive P=0,32), vilket visar på likartade effekter av omedelbar och fördröjd anakinraadministrering.

Leukocytinfiltration

Ingen skillnader hittades i antalet leukocyter per 1 mm2 myokard i infarktområdet hos anakinra- och saltlösningsbehandlade AMI-djur (figur 4). Apoptosfrekvensen i granulationsvävnaden 1 vecka efter AMI var likartad hos anakinra- och salinbehandlade möss (figur 4). Leukocyter saknades praktiskt taget i avlägsna myokardregioner och hos skenopererade djur.

Cytokinnivåer

Ingen signifikanta skillnader hittades i IL-1β-, IL-6-, tumörnekrosfaktor-α- och interferon-γ-plasmanivåer (figur 4).

MMP-aktivitet

Aktivt MMP-9 var praktiskt taget odetekterbart hos shamopererade djur, medan det konsekvent påvisades hos möss med AMI 7 dagar efter operationen. Ingen skillnad i aktiva MMP-9-nivåer hittades mellan saltlösning och anakinrabehandlade AMI-möss (figur 4).

In vitro-administrering av anakinra

Apoptos

Inkubation av kardiomyocyter med anakinra (2.5×10-12 g/mL) vid tidpunkten för ”simulerad reperfusion” (efter 40 minuters ”simulerad ischemi”) var förknippat med en signifikant 36 % minskning av apoptos (11,2±0,5 % jämfört med 17,5±0,1 % i kontrollen). Ökande (×100) koncentrationer av anakinra upp till 25×10-6 g/mL visade ingen ytterligare minskning av apoptos, medan koncentrationer under 25×10-12 g/mL inte hade någon effekt på apoptos (figur 5).

Ökat cellulärt upptag av anakinra under hypoxi

Jämfört med normoxi var upptaget av anakinra under hypoxi signifikant ökat och var tydligt i ≈95 % av cellerna under hypoxi (jämfört med 35 % under normoxi; P = 0,048; figur 6).

Hämning av Caspase-1- och -9-aktiviteter

In vitro hämmade anakinra (100 till 900 nmol/L) signifikant caspase-1- och -9-aktiviteterna med ≈50 % (P<0,001 för alla koncentrationsvärden jämfört med kontroll), utan att det fanns några skillnader mellan olika koncentrationer. Anakinra uppträdde som en blandad kompetitiv och icke-kompetitiv enzymhämmare för caspas-1 (Ki, 0,201 μmol/L; Kic, 0,239 μmol/L; Kuc, 0,231 μmol/L) och för caspas-9 (Ki, 0,31 μmol/L; Kic, 0,34 μmol/L; och Kuc, 0,28 μmol/L). Tillägg av IL-1Ra-blockerande antikroppar upphävde caspase-1- och -9-hämningen av anakinra (figur 7). Koprecipitationsanalysen bekräftade en fysisk interaktion och bindning mellan anakinra och caspase-1 och -9 (figur 7).

Diskussion

Denna studie visar för första gången att det exogena rekombinanta humana IL-1Ra anakinra som ges inom de första 24 timmarna efter AMI signifikant förbättrar kardiell remodellering genom att minska kardiomyocytapoptos i 2 olika djurmodeller av permanent infarktrelaterad artärocklusion och att anakinra har en direkt antiapoptotisk effekt på kardiomyocyter in vitro.

Biologi för IL-1Ra

IL-1Ra anses vara en akutfasreaktant.3,4 För närvarande är den endogena IL-1Ras roll i inflammation oklar. IL-1Ra binder till IL-1-receptorn och är därför en kompetitiv hämmare av IL-1-aktiviteten, vilket potentiellt kan uppträda som ett antiinflammatoriskt medel.3 Eftersom IL-1 binder till sin receptor med högre affinitet och det finns ett överskott av receptorer (spare receptor-effekt) tycks den endogena agonistens roll vara begränsad.3 IL-1Ra genen är välbevarad i biologin, och skillnader mellan arter har inte rapporterats. I den här studien testade vi de två vanligaste gnagararterna och rapporterade liknande effekter.

IL-1Ra vid AMI

IL-1Ra nivåerna ökar signifikant efter ischemi-reperfusion i myokardiet.7 Nivåerna är förhöjda tidigt hos patienter som presenterar sig med ST-segmenthöjning vid AMI,5 och ju större område av myokardiet som är i riskzonen, desto större är ökningen av IL-1Ra nivåerna.6 I observationsstudier var dessutom högre IL-1Ra-nivåer hos patienter med akut kranskärlssyndrom förknippade med ett ogynnsamt utfall.20,21 Huruvida IL-1Ra utgjorde en skademarkering, ett försök till kardioprotektion med hjälp av antiinflammatorisk aktivitet eller en mediator för skador förblev oklart. Övexpression av IL-1Ra i en råttmodell med global ischemi-reperfusion visade för första gången en kardioprotektiv effekt av IL-1Ra, vilket resulterade i en ungefär 50-procentig minskning av kardiomyocytapoptos8 .

Exogent IL-1Ra

En rekombinant human IL-1Ra (anakinra) finns kommersiellt tillgänglig (producerad av Amgen), är godkänd av Food and Drug Administration och används hos ett stort antal patienter för behandling av reumatoid artrit.22-24 IL-1:s roll i patogenesen för reumatoid artrit är central. Systemisk administrering av anakinra har visat sig vara säker och effektiv hos patienter med reumatoid artrit, vilket leder till modifiering av sjukdomsaktiviteten. En klinisk prövning av anakinra hos patienter med akut kranskärlssyndrom pågår, men resultaten är ännu inte tillgängliga.25 I en nyligen publicerad fas II-studie behandlades 17 patienter med ischemisk stroke med anakinra som gavs som en 100 mg bolus följt av en 72-timmars infusion; de övriga 17 patienterna fick matchande placebo.26 Anakinra visade sig inte ha några läkemedelsrelaterade biverkningar och i en sekundär analys konstaterades att anakinra var förknippat med ett större antal patienter med minimalt eller inget stroke-relaterat funktionshinder. I experimentella djurmodeller för stroke förknippades anakinra med minskad apoptos, minskad inflammation och förbättrat beteendeutfall.27,28

Aktionsmekanism

Den exakta mekanismen genom vilken anakinra utövar sina gynnsamma effekter är inte helt klarlagd. Den vedertagna uppfattningen är att anakinra administrerat i höga doser konkurrerar med IL-1 och minskar IL-1-aktiviteten. Anakinra binder IL-1-receptorn av typ I men förhindrar transduktion av den intracellulära signalen genom att förhindra interaktionen mellan IL-1-receptorn och IL-1-accessoriproteinet. IL-1Ra har visat sig minska den IL-1-beroende prostaglandin-E2-sekretionen, som kan vara direkt ansvarig för celltoxicitet och apoptos.3,29 Huruvida anakinra interfererar med IL-1 som huvudsakligen härrör från inflammatoriska celler eller med IL-1 som frisätts lokalt på ett parakrint eller autokrint sätt och om det har en direkt effekt på cellen oberoende av dess interaktion med IL-1-receptorn är fortfarande oklart. Den intracellulära verkan av IL-1Ra är oberoende av den intracellulära IL-1-signalvägen,30 och transmembranaktiv transport av IL-1Ra genom den purinerga kanalreceptorn P2X7 har beskrivits.31 De effekter som observerats in vitro där endast kardiomyocyter odlas tyder på att effekterna av anakinra på myokardiet åtminstone delvis är oberoende av närvaron av ett inflammatoriskt infiltrat. Följaktligen fann vi inga effekter av anakinra på cirkulerande cytokinnivåer, myokardialt leukocytinfiltrat eller MMP-9-aktivitet i denna experimentella modell. De antiapoptotiska effekterna av IL-1Ra har redan rapporterats i neuroner och epitelceller.32,33 Dessa effekter är uppenbara in vivo och in vitro, vilket tyder på en parakrin eller autokrin effekt av IL-1Ra.32,33 Här rapporterar vi cellulärt upptag av anakinra under ischemi, bindning mellan anakinra och caspase-1 och -9, och signifikant hämning av caspase-1- och -9-aktiviteterna av anakinra. De data som erhållits in vitro, även om de endast är hypotesgenererande när det gäller händelserna in vivo på grund av modellernas inneboende begränsningar, tyder på en ökande tröskel för hypoxiinducerad apoptos med anakinra.

Vi visar att tidig (omedelbar) eller fördröjd (24 timmar senare) administrering av anakinra minskar apoptos och förhindrar hjärtats dilatation efter AMI. Vid den dos som visades hämma apoptos och förhindra dilatation (1 mg/kg) hade anakinra ingen effekt på infarktstorlek när det gavs tidigt, och liknande fördelar i remodellering ses med anakinra administrerat 24 timmar efter AMI, i enlighet med en effekt på hjärtats remodellering som är oberoende av infarktsparande. Noterbart är att de gynnsamma effekterna av IL-1Ra i djurmodeller för stroke också, åtminstone delvis, är tidsoberoende.34 Som redan noterats i litteraturen om stroke observerades dock en infarktsparande effekt med en 100 gånger högre dos av anakinra. Huruvida den lilla men signifikanta minskningen av infarktstorleken med högre doser skulle översättas till en kliniskt relevant fördel när det gäller hjärtsvikt eller överlevnad är okänt och kräver ytterligare tester.

Den optimala varaktigheten av IL-1Ra-behandling efter AMI är okänd. I en modell av kärlväggens respons på skada var IL-1Ra som gavs i 28 dagar förknippat med en större effekt jämfört med IL-1Ra som gavs i 14 dagar.35 Noterbart är att inga rebound-effekter hittades efter att IL-1Ra-behandlingen avbrutits.35

Kaspasernas roll vid ischemi och hjärtsvikt

Kaspaserna är proteaser som är involverade i den apoptotiska och inflammatoriska kaskaden.36-40 Caspase-3 är en central mediator i den apoptotiska kaskaden, vilket leder till nedströmsaktivering av sekundära effektorer som är ansvariga för DNA-fragmentering och klyvning av strukturproteiner i cytoskelettet. Caspase-1, även känt som interleukin-1-konverterande enzym, anses vara ett proinflammatoriskt caspas eftersom det bland annat omvandlar pro-IL-1β till IL-1β. Caspas-1 är dock också ett av de enzymer som klyver pro-caspas-3, vilket leder till dess aktivering.36-40 I själva verket aktiveras caspas-3 i allmänhet från klyvning av andra caspaser, t.ex. caspas-9, som spelar en central roll i den mitokondriella vägen, caspas-8, som främst är involverad i receptormedierad apoptos, och caspas-1. Experimentella studier har visat att hämning av caspase-1-aktiviteten är förknippad med minskad apoptos och gynnsammare remodellering efter AMI oberoende av IL-1-nivåerna.38,39 Med tanke på att IL-1 är substratet för caspase-1 testade vi om IL-1Ra skulle kunna utöva sina gynnsamma effekter genom direkt intracellulär hämning av caspase-1.40 I enlighet med detta beskriver vi, för första gången, att anakinra binder till caspase-1 in vitro och hämmar dess aktivitet signifikant. Direkt hämning av caspase-1 av anakinra kan vara ansvarig, åtminstone delvis, för dess antiinflammatoriska och antiapoptotiska effekter. Anakinra kan dock ha antiapoptotiska effekter som beror på en indirekt effekt på caspase-1-aktiviteten genom att förhindra translokation av caspase-1 till kärnan och därmed hämma apoptos41 eller genom hämning av caspase-9. Caspase-9 är den viktigaste mediatorn för den mitokondriella vägen som leder till aktivering av apoptos under hypoxi/ischemia.37 Huruvida hämning av caspase-1 eller -9 spelar en större roll för den fördel som observerats med anakinra återstår att klarlägga. Vid den dos som testades i den här studien hade anakinra sannolikt liknande hämmande effekter på båda caspaserna, och krosstalk mellan olika caspaser i den apoptotiska kaskaden har rapporterats.36-41

Anakinras farmakokinetik och dos-effektrespons

I en fas I-studie på 25 friska frivilliga var en engångsdos av anakinra i en dos som liknade den som användes i den här studien (1 mg/kg) administrerad intravenöst förknippad med en plasmanivå på 3,1 μg/mL och en halveringstid på 2,64 timmar.42 In vivo fann vi inga signifikanta effekter på infarktstorleken vid användning av anakinra i en dos som var upp till 10 gånger högre än den rekommenderade dosen, men vi fann en liten men signifikant minskning av infarktstorleken vid användning av en 100 gånger högre dos. Huruvida denna infarktbesparande effekt i samband med en så hög dos skulle översättas till ett gynnsamt resultat på lång sikt är osäkert och kräver ytterligare studier. In vivo var en koncentration >106 lägre än den högsta plasmanivå som observerats hos människor förknippad med en betydande minskning av apoptos. Lägre doser var inte effektiva, medan högre doser inte visade några additiva effekter. Dessa data stämmer överens med den kliniska profilen för anakinra där en standarddos på 1 mg/kg i allmänhet används och större doser är förknippade med mer lokala biverkningar utan betydande ytterligare klinisk nytta.22-24 I en nyligen genomförd studie43 användes anakinra som gavs i en dos på 100 mg (grovt räknat motsvarande 1 mg/kg) för att hämma apoptos av β-celler i bukspottkörteln och visade sig vara väl tolererad och förknippad med index för bättre β-cellsfunktion jämfört med placebo utan att påverka insulinkänsligheten.

Ischemi, apoptos och hjärtsvikt efter AMI

Fyndet av ett samband mellan apoptos och remodellering stödjer konceptet om apoptos som en central mediator för hjärtats remodellering oavsett infarktstorlek1,37,44. Avsaknaden av skillnader i dess effekter på apoptos eller remodellering mellan den omedelbara och fördröjda behandlingsstrategin och avsaknaden av effekter på infarktstorlek med dosen 1 mg/kg tyder på att anakinra specifikt påverkar subakut postinfarktremodellering, där apoptos är känd för att spela en viktig roll,1,36,43 utan att påverka infarktläkning, matrisnedbrytning och fibros eller främja väggruptur.

Slutsatser

Administrering av anakinra inom 24 timmar efter AMI förbättrar postinfarktremodellering samtidigt som apoptos hämmas. Trots begränsningarna i den aktuella studien (såsom en relativt liten urvalsstorlek begränsad till manligt kön, en enda tidsbestämning av utfall av intresse och användningen av ekokardiografi, som förblir en suboptimal och operatörsberoende metod för att bedöma LV-remodellering och funktion), kan fynden av en gynnsam effekt av exogent IL-1Ra (anakinra) som ges inom 24 timmar efter AMI öppna ett nytt terapeutiskt fönster för behandling av ischemisk skada och remodellering för förebyggande och behandling av ischemisk hjärtsvikt.

Fotnoter