Analytisk känslighet, funktionell känslighet

En av de grundläggande egenskaperna hos alla analysmetoder är den minsta koncentration som kan mätas på ett tillförlitligt sätt. Ett antal termer och begrepp har använts för att beskriva den lägsta koncentration som ett immunoassay kan rapportera, och denna mångfald av termer kan vara verkligt förvirrande. Nedan följer en diskussion om några av dessa termer och hur de relaterar till svaret på den grundläggande frågan: Vad är den lägsta koncentration som jag kan rapportera med denna analys?
Analytisk känslighet
Den formella definitionen av analytisk känslighet är ”den lägsta koncentration som kan särskiljas från bakgrundsbrus”. Denna koncentration kallas korrekt för analysens detektionsgräns, men den kallas oftast för känslighet. Vanligtvis fastställs detta värde genom att analysera replikat av ett prov som man vet inte innehåller någon analyt. Därefter används de uppmätta antalen (CPS) från dessa replikat för att beräkna ett medelvärde och en standardavvikelse (SD). Den analytiska känsligheten bestäms som den koncentration som motsvarar medelantalet från nollprovet plus 2 SD för immunometriska analyser och medelantalet minus 2 SD för kompetitiva analyser. Detta är vad som publiceras i avsnittet ”Analytisk känslighet” i bipacksedlarna för IMMULITE® och IMMULITE® 2000.
I den verkliga världen har analytisk känslighet ett begränsat praktiskt värde. Den verkliga begränsningen är att för alla analyser ökar oprecisionen mycket snabbt när koncentrationen minskar. Detta fenomen är lätt att se när man tittar på analysens precisionsprofil, som är en grafisk representation av hur oprecisionen för en analys förändras med den uppmätta koncentrationen. (Se figurerna 1 och 2 för exempel.)

Figur 1. Representativ DPC-precisionsprofil.

Figur 2. Representativ DPC-precisionsprofil. Observera att funktionskänslighet i området 0,01-0,02 µIU/mL per definition krävs av en TSH-analys av ”tredje generationen”.1,2
Inte bara vid den analytiska känsligheten, utan även vid koncentrationer som ligger betydligt över den, kan oprecisionen vara så stor att resultaten inte reproduceras tillräckligt bra för att vara av verklig klinisk nytta. Följaktligen representerar den analytiska känsligheten vanligtvis inte den lägsta mätbara koncentrationen som är kliniskt användbar.
Denna begränsning av analytisk känslighet har alltid funnits hos oss, för RIA och IMMULITE, och gäller för alla metoder från alla tillverkare. Eftersom patientprover vanligtvis inte körs i replikat, är bristen på reproducerbarhet kanske inte direkt uppenbar vid rutintestning. Resultatens övergripande kvalitet och användbarhet påverkas dock. Detta är anledningen till att den nedre gränsen för rapporteringsområdet i IMMULITE- och IMMULITE 2000-programvaran ofta är inställd på en koncentration som ligger över den analytiska känsligheten. DPC fastställer rapporteringsgränserna för varje analys till vad som enligt en omfattande bedömning är intervallet för effektiv och tillförlitlig prestanda för analysen, i förhållande till dess avsedda kliniska användning.
Begränsningarna av analytisk känslighet för att beskriva den nedre gränsen för kliniskt effektiv testprestanda ledde till utvecklingen av ett annat koncept.
Funktionell känslighet
För ungefär tio år sedan, som en reaktion på den begränsade användbarheten av analytisk känslighet som ett mått på testprestanda, utvecklade en grupp forskare som utvärderade TSH-analyser ett begrepp som de kallade funktionell känslighet.1 De definierade det som ”den lägsta koncentration vid vilken en analys kan rapportera kliniskt användbara resultat”. Kliniskt användbara resultat för TSH ansågs vara god noggrannhet med en daglig CV på högst 20 %. Även om detta val av CV-gräns var något godtyckligt, ansåg forskarna att för TSH var ett CV på 20 % den största oprecision som kunde tolereras för kliniska ändamål.1
Då CV är standardavvikelsen uttryckt i procent av medelvärdet, innebär ett CV på 20 % att SD skulle vara 20 % av medelvärdet. För ett prov med en TSH-koncentration på 0,1 µIU/mL skulle t.ex. intervallet som omfattar 95 % av de förväntade resultaten från upprepad analys vara ±40 % (±2 SD) eller 0,06 µIU/mL till 0,14 µIU/mL.
Och även om det ursprungligen bara utvecklades för TSH-analyser, har begreppet funktionell känslighet och användningen av ett CV på 20 % som gräns för klinisk användbarhet tillämpats i stor utsträckning på andra immunoanalyser. Konceptet har fått acceptans eftersom det ger laboratoriet en objektiv och kliniskt meningsfull indikation på den praktiska nedre gränsen för en analys.
När DPC utvecklar ett nytt test använder DPC i stort sett samma tillvägagångssätt och utvärderar både precision och noggrannhet för att fastställa de koncentrationer vid vilka gränsen för klinisk användbarhet sannolikt kommer att uppnås. Mjukvarans rapporteringsintervall baseras på denna utvärdering. Särskilt för konkurrerande analyser finns det vanligtvis en betydande skillnad mellan den analytiska känsligheten och den nedre rapporteringsgränsen. Rapporteringsintervallet, som det är fastställt i IMMULITE- och IMMULITE 2000-programvaran, representerar DPC:s rekommendation för CLIA’88* ”rapporteringsintervallet” – vilket är det koncentrationsintervall inom vilket testresultatet dokumenteras som giltigt.
Verifiering av testprestanda
För laboratorier som använder automatiserade immunoassaysystem i USA är den enda känslighetsrelaterade prestandakaraktär som enligt CLIA’88 skall verifieras av laboratoriet den nedre gränsen för det rapporteringsbara intervallet. Vissa laboratorier kan också välja att uppskatta den funktionella känsligheten för en ny analys, och historiskt sett har vissa laboratorier velat verifiera den analytiska känsligheten. Var och en av dessa bedömningar är ett annorlunda experiment med olika protokoll och krav. Det första steget är därför att bestämma vad som ska verifieras och sedan använda ett lämpligt protokoll och utvärdera uppgifterna i enlighet med detta.
Om ett laboratorium väljer att utvärdera analytisk känslighet är målet vanligtvis att verifiera det värde som anges för det prestationsmåttet i bipacksedeln. Det är viktigt att det prov som används för en undersökning av analytisk känslighet är ett verkligt nollkoncentrationsprov med en lämplig provmatris. Alla andra typer av prov kan förvränga resultaten. Det vanliga protokollet innebär att man analyserar 20 replikat av nollprovet och sedan beräknar medelvärdet och SD för CPS. Den analytiska känsligheten uppskattas som den koncentration som är lika med medelantalet i nollprovet plus 2 SD för immunometriska (”sandwich”) analyser som TSH, eller minus 2 SD för kompetitiva analyser som T4. Tekniska tjänsten kan hjälpa till att beräkna denna koncentration. Detta protokoll ger en första uppskattning som vanligtvis är tillräcklig för jämförelse med den analytiska känslighet som anges i bipacksedeln. Flera experiment som omfattar flera kitpartier är dock nödvändiga för att få en robust och korrekt bedömning.
Vid bedömningen av den funktionella känsligheten är målet att fastställa den lägsta koncentrationen som motsvarar ett laboratoriespecificerat mål för dag till dag- (interassay) oprecision som representerar gränsen för den kliniska användbarheten för en viss analys. Vanligtvis har ett CV på 20 % använts som mål, baserat på den ursprungliga tillämpningen av konceptet på TSH. Detta CV är dock inte alltid den lämpligaste gränsen. För vissa analyser kan ett CV på mer än 20 % vara förenligt med kliniskt tillförlitliga och informativa resultat, medan ett CV på mindre än 20 % för andra analyser kan utgöra gränsen för klinisk användbarhet. Prestationsmålet måste fastställas för varje test, baserat på dess avsedda kliniska tillämpning.
När man har fastställt det dagliga CV som representerar den kliniskt användbara gränsen för reproducerbarhet är nästa steg att uppskatta den koncentration vid vilken CV kan nå denna gräns. På grundval av tidigare studier, uppgifter i bipacksedeln och uppskattningar från analysens precisionsprofil kan den tekniska tjänsten vanligtvis hjälpa till att identifiera ett ”målintervall” av koncentrationer som ligger inom ramen för den förutbestämda CV-gränsen.
Denna studie bör helst utföras med hjälp av flera outspädda patientprover, eller pooler av patientprover, med koncentrationer som sträcker sig över målintervallet. Dessa prover kan dock vara svåra att få tag på. Rimliga alternativ är patientprover som spätts ut till koncentrationer som sträcker sig över målområdet, eller kontrollmaterial i eller nära detta område. Om det finns ett behov av att späda ut någon typ av prov för undersökningen är det avgörande vilket spädningsmedel som används. Rutinprovspädningsmedlen är endast avsedda för spädning av prover med mycket hög koncentration; för vissa analyser kan de ha en mätbar, om än mycket låg, skenbar koncentration. Användning av dessa utspädningsmedel kan förvränga studiens resultat.
Proverna bör analyseras upprepade gånger under ett antal olika körningar, helst under en period av dagar eller veckor, för att bedöma precisionen från dag till dag. (En enda körning med 20 replikat ger inte en giltig bedömning av den funktionella känsligheten). Efter att ha samlat in data, beräkna CV för varje prov som testats. Den funktionella känsligheten är den koncentration vid vilken CV når den förutbestämda gränsen. Denna koncentration kan uppskattas från undersökningsresultaten genom interpolation, om den inte råkar sammanfalla med en av de testade nivåerna.
Verifiering av den nedre gränsen för det rapporteringsbara intervallet är en del av processen för att verifiera hela det rapporteringsbara intervallet. Detta görs vanligtvis genom att utföra replikatanalyser på en serie av tre till fem prover med kända koncentrationer som sträcker sig över det rapporteringsbara området. Dessa prover kan erhållas med hjälp av ett enda prov med en koncentration nära den övre gränsen för intervallet, som sedan späds ut för att ge ytterligare prover som spänner över hela det rapporteringsbara intervallet. De erhållna resultaten utvärderas med avseende på både reproducerbarhet och återvinning av förväntade värden för att fastställa att testets prestanda uppfyller kraven på klinisk användbarhet inom hela det rapporteringsbara intervallet.
Slutsats
Så, varför är den nedre gränsen för mjukvarans rapporteringsområde 1,0 µg/dL (13 nmol/L) när det i bipacksedeln står att känsligheten är 0,3 µg/dL (3,9 nmol/L)? I det här exemplet är analysen en kompetitiv analys, och dess oprecision överskrider kliniskt användbara gränser vid en koncentration som ligger långt över den analytiska känsligheten.
Om oprecisionen är sådan att man inte med säkerhet kan säga att resultat på till exempel 0,4 µg/dL (5 nmol/L) och 0,7 µg/dL (9 nmol/L) i själva verket skiljer sig åt, kan det då inte vara bättre att rapportera båda som ”
I slutändan är det vanligen inte testets detektionsgräns (analytisk känslighet), utan snarare resultatens reproducerbarhet, som bestämmer den nedre gränsen för kliniskt tillförlitlig testprestanda i rutinmässig praxis.

1. Spencer CA. Sköldkörtelprofilering på 1990-talet: uppskattning av fritt T4 eller känslig TSH-mätning. J Clin Immunoassay 1989; 12:82-9.
2. Spencer CA, et al. Skillnader mellan laboratorier och metoder när det gäller funktionskänslighet hos immunometriska analyser av tyrotropin (TSH) och inverkan på tillförlitligheten vid mätning av subnormala TSH-koncentrationer. Clin Chem 1995;41:367-74. Reprint (katalognummer ZD060) kan erhållas från DPC på begäran.
*CLIA’88: den amerikanska lagen om förbättring av kliniska laboratorier.