Antiastmatiska effekter av Sanglong Pingchuan Decoction genom att inducera ett balanserat Th1/Th2 immunsvar

Abstract

Objektiv. Att undersöka de antiastmatiska effekterna av Sanglong pingchuan decoction (SLPCD) och utforska dess verkningsmekanismer. Metoder. Serum, bronkoalveolär lavagevätska (BALF) och lungvävnad från OVA-inducerade allergiska astmamöss samlades in 24 timmar efter den sista administreringen. Patologiska förändringar i lungorna observerades med H&E-färgning. De inflammatoriska cellerna i BALF räknades med flödescytometri. Nivåerna av totalt IgE i serum och cytokiner i BALF bestämdes med ELISA. Uttrycksnivåerna för cytokinernas mRNA i lungorna undersöktes med qRT-PCR. Resultat. SLPCD hämmade signifikant luftvägsinflammation, minskade inflammatoriska celler i BALF, minskade nivåerna av totalt IgE i serum och Th2-cytokiner (IL-10 och IL-13) i BALF och nedreglerade mRNA-uttrycksnivåerna av Th2-cytokiner (IL-4, IL-5, IL-10 och IL-13) i lungan hos astmatiska möss. SLPCD ökade dock avsevärt nivån av Th1-cytokinen IFN-γ i BALF och uppreglerade mRNA-uttrycksnivåerna för Th1-cytokiner (IL-2 och IFN-γ) i lungorna hos astmatiska möss. Slutsats. SLPCD kunde dämpa luftvägsinflammation och lindra patogenesen hos astmamöss genom att inducera ett balanserat Th1/Th2-svar och kunde fungera som ett effektivt läkemedel för behandling av astma.

1. Introduktion

Astma är en komplex, kronisk luftvägssjukdom som kännetecknas av bronkial hyperreaktivitet, luftvägsinflammation och remodellering, luftflödesobstruktion och infiltration av olika typer av inflammatoriska celler inducerade av cytokiner och andra mediatorer . Astma orsakas av miljöfaktorer som allergener, virus och yrkesmässig exponering hos genetiskt predisponerade individer, men dess definitiva orsak är oklar . Förekomsten av astma har ökat betydligt över hela världen, särskilt hos små barn, och har blivit en av de vanligaste luftvägssjukdomarna . Man uppskattar att 300 miljoner människor i olika länder drabbas av astma.

För närvarande är kortikosteroider de mest effektiva läkemedlen för behandling av astma . Även om dessa läkemedel kan förbättra astmasymtomen botar de inte sjukdomen . Dessa medel har också allvarliga biverkningar, särskilt hos barn, bland annat immunsuppression, sekundära infektioner, muskelatrofi, osteopeni, osteoporos, katarakt och glaukom . Därför är det fortsatta sökandet efter nya, säkra och effektiva läkemedel av yttersta vikt.

Många traditionella kinesiska läkemedel har använts vid behandling av astma i århundraden och används fortfarande i stor utsträckning i asiatiska länder . Nyligen har verkningsmekanismen för många växtbaserade formler som används för behandling av allergisk astma rapporterats . Olika växtbaserade naturprodukter med antiinflammatoriska egenskaper har också undersökts för potentiell tillämpning vid behandling av astma .

Sanglong pingchuan decoction (SLPCD) är ett sjukhuspreparat som ordinerats av professor Qing Chang, en nationell veteranläkare i traditionell kinesisk medicin som ärvde studiens mentor, på Shaoxing Hospital of Traditional Chinese Medicine. SLPCD härrör från Shegan Mahuang Tang genom addition och subtraktion. Shegan Mahuang Tang är en välkänd traditionell kinesisk receptbelagd medicin som först nämns i Jin Kui Yao Lve. Shegan Mahuang Tang är en representativ formulering av förkylning, lindring av yttre syndrom, uppvärmning av lungorna, eliminering av slem och lindring av astma. Shegan Mahuang Tang används i stor utsträckning för behandling av astma, bronkit hos barn, bronkialastma, lunginflammation, äldre människors akuta och kroniska bronkit, emfysem och allergisk rinit. SLPCD-formeln bestod av tretton traditionella kinesiska läkemedel som förtecknas i tabell 1. En randomiserad studie visade att SLPCD är effektivt vid behandling av astma, särskilt när det gäller att minska exacerbationsfrekvensen. SLPCD:s effektivitet har dock inte bevisats genom kontrollerade experiment.

I den aktuella studien, för att tillhandahålla experimentell grund för den kliniska tillämpningen av SLPCD vid behandling av astma och för att utforska dess verkningsmekanismer, användes OVA-inducerad allergisk astmamusmodell, SLPCD:s antiinflammatoriska effekter undersöktes genom histologisk undersökning, räkning av immunceller i bronkoalveolär lavagevätska (BALF), kvantifiering av totalt IgE i serum, cytokin i BALF och mRNA-uttryck av cytokin i lungvävnader.

2. Material och metoder

2.1. Växtmaterial och reagenser

Cortex Mori (batchnummer: 140901), Pheretima Aspergillum (batchnummer: 150406), honungsbehandlad Herba Ephedrae (batchnummer: 150302), Rhizoma Belamcandae (batchnummer: 141213), Semen Armeniacae Amarum (partiets nummer: 150312), Fructus Perillae (partiets nummer: 150115), Scorpio (partiets nummer: 150126), Semen Descurainiae (partiets nummer: 150312), rårörda Fructus Perillae (partiets nummer: 150115), Scorpio (partiets nummer: 150126), Semen Descurainiae (partiets nummer: 150208), honungsstekta Flos Farfarae (parti nr 150301), Herba Houttyniae (parti nr 150327), Rhizoma Fagopyri Dibotrydis (parti nr 150308), Radix Angelicae Sinensis (parti nr: 150213) och Radix et Rhizoma Glycyrrhizae (batchnummer: 140917) köptes från Shaoxing Hospital of Chinese Medicine och äktades av professor Yonghai Jiang från Shaoxing Institute for Food and Drug Control, Zhejiang, Kina. Standarderna för klorogensyra och rutin köptes från Zhejiang Institute for Food and Drug Control, Hangzhou, Kina, och renheten av båda föreningarna var mer än 98 %.

Ovalbumin (OVA) köptes från Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO, USA; ELISA-kits för detektering av IL-10, IL-13 och IFN-γ hos möss köptes från Wuhan Boster Biological Technology Co. Ltd, Hubei, Kina; ELISA-kit för IgE från mus var från RayBiotech Inc, Norcross, GA, USA; fetalt kalvserum (FCS) var från Gibco, Grand Island, NY, USA. De renade anti-mus CD16/CD32 (Fc-receptorblock), Ly-6G-FITC (klon RB6-8C5), F4/80-antigen PE-Cy5 (klon BM8), Ly-6C-APC (klon HK1.4), Fc epsilon Receptor 1 alfa (FceR1)-APC (klon: MAR-1), CD117 (c-Kit)-PE-Cy5 (c-Kit, klon: 2B8) och siglec-F-PE (klon: E50-2440) antikroppar köptes från eBioscience, Inc, San Diego, CA, USA. Trizolreagens köptes från Invitrogen, Carlsbad, CA, USA; revert Aid™ M-MLV reverse transkriptas kom från Fermentas, Amherst, NY, USA; ribonukleashämmare och oligo(dT)18 kom från Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd., Kina; FastStart Universal SYBR Green Master (ROX) kom från Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA. Aluminiumhydroxidgel (Alum) köptes från China Animal Husbandry Industry Co., Ltd., Beijing, Kina; dexametason (Dex) kom från Hubei Tianyao Pharmaceutical Co., Ltd., Xiangyang, Kina.

2.2. Beredning av SLPCD

Läkemedel på recept av SLPCD (440 g) macererades i 8 alikvots destillerat vatten i 30 min och kokade sedan vatten i 1 h. Efter det första avkoket kokades drank i 6 alikvots destillerat vatten i ytterligare 30 min. Den supernatant som erhållits från det dubbla avkoket filtrerades genom en steril gasväv och koncentrerades med en rotavapor (Buchi, Schweiz) under reducerat tryck vid 65 °C till en slutkoncentration på 1,1 g rått läkemedel/ml. Det koncentrerade avkoket förvarades vid -20 °C och späddes därefter med destillerat vatten till flera olika koncentrationer före användning.

2.3. HPLC-analys (High Performance Liquid Chromatography) av SLPCD

HPLC-analysen utfördes med hjälp av en Diamon C18-kolonn (250 mm × 5 mm, 5 μm) och Waters 2996 PDA-detektor på Water 600E HPLC-instrumentet. Den rörliga fasen var en blandning av acetonitril (A) och 0,1 % fosforsyra (B). En linjär gradienteluering genomfördes enligt följande: 0-8 min vid 2 % A, 8-35 min vid 6 % A, 35-40 min vid 8 % A, 40-45 min vid 13 % A, 45-70 min vid 14 % A, 70-80 min vid 17 % A och 80-90 min vid 17-2 % A. Flödeshastigheten var 1 ml/min och injektionsvolymen var 10 μl. Kolonntemperaturen hölls konstant på 30 °C. HPLC-analysen av standarder (klorogensyra och rutin) och proverna utfördes under de etablerade experimentella förhållandena enligt ovan.

2.4. Försöksdjur

Femliga BALB/c-möss i fem veckors ålder köptes från Shanghai Experimental Animal Center of Chinese Academy of Sciences, Shanghai, Kina (certifikat nr SCXK 2007-0005). Mössen acklimatiserades i en vecka före användning. Möjlighet att äta laboratoriekost för gnagare och kranvatten tillhandahölls ad libitum och hölls under kontrollerade förhållanden med en temperatur på 24 ± 1 °C, en luftfuktighet på 50 ± 10 % och en ljus-/mörkercykel på 12/12 timmar. Alla förfaranden var i strikt överensstämmelse med den kinesiska lagstiftningen om användning och skötsel av försöksdjur och med de riktlinjer som fastställts av Institutet för försöksdjur vid Zhejiang University och godkändes av universitetets kommitté för djurförsök.

2.5. Sensibilisering, utmaning och behandling av möss

Kvinnliga BALB/c-möss delades in i sex grupper: normal kontrollgrupp (NC), modellkontrollgrupp (MC), positiv kontrollgrupp (behandlad med Dex, 2 mg/kg) och SLPCD-grupper (5,5, 11 och 22 g/kg). Varje grupp bestod av tio möss. Musens luftvägsinflammation inducerades av OVA. Djuren immuniserades genom intraperitoneal injektion av en lösning innehållande 50 μg OVA och 200 μg aluminiumhydroxid i tre dagar. En boostande sensibilisering gavs på dag 14. En vecka efter den sista sensibiliseringen exponerades mössen för aerosoliserad 2 % OVA med hjälp av PARI TurboBOY N (1205) nebulisator (PARI GmbH, Tyskland) under 1 timme per dag i 8 dagar. Fyra dagar innan de sensibiliserade mössen utsattes för en utmaning administrerades de oralt med SLPCD i doserna 5,5, 11 och 22 g/kg eller injicerades intraperitonealt med 2 mg/kg dexametason (Dex) varje dag i 12 dagar. Modellkontrollgrupperna fick samma volym saltlösning. Dosvolymen var 0,2 ml/10 g kroppsvikt. Tio möss som normal kontrollgrupp var endast sensibiliserade och utmanades med saltlösning. De förfaranden som användes för OVA-sensibilisering och utmaningar samt behandling med SLPCD visas i figur 1.

Figur 1

Experimentellt protokoll för OVA-inducerad astmamodell och behandlingsprocesser.

2.6. Histopatologi i lungorna

Lungvävnaderna samlades in 24 timmar efter den sista administreringen och fixerades sedan med 4 % paraformaldehyd, bäddades in i paraffin och sektionerades i 5 μm tjocklek. En serie mikrosektioner färgades med hematoxylin och eosin (H&E) för histologisk bedömning.

2.7. Insamling av bronkoalveolär lavagevätska (BALF) och flödescytometri

BALF samlades in genom lavage av lungan med fosfatbuffrad lösning (PBS) som tillfördes genom en endotrakealkateter 24 timmar efter den sista administreringen. BALF centrifugerades i 5 minuter och cellerna tvättades med iskall PBS innehållande 2 % FCS. Cellerna blockerades med 0,5 μg renad antikropp mot mus CD16/CD32 (FcR-block) i 10 minuter på is för att hämma ospecifik färgning och färgades sedan med kombinationen av antikroppar mot mus Ly-6G-FITC, F4/80-antigen-PE-Cy5 och Ly-6C-APC, eller FceR1-APC, CD117-FITC och Siglec-F-PE-antikroppar i rumstemperatur i 30 minuter i mörker. De färgade cellerna tvättades med iskall PBS och återuppsattes i PBS. Hundratusen livskraftiga celler per behandling analyserades med en BD FACScan flödescytometer med hjälp av programvaran CellQuest.

2.8. Mätning av den totala IgE-antikroppen i serum

Serumet samlades in 24 timmar efter den sista administreringen. Den totala IgE-antikroppen påvisades i enskilda serumprover med RayBio® mouse IgE ELISA-kit. Serumproverna utspädda 1:1250 eller IgE-standard tillsattes till 96-hålsplattor belagda med specifik anti-mus IgE-antikropp mot mus. Plattorna inkuberades i 2,5 timmar i rumstemperatur och tvättades sedan fyra gånger. Den detekterande antikroppen tillsattes i varje brunn. Plattorna inkuberades i rumstemperatur i 1 timme före tillsats av pepparrotsperoxidas-konjugerat ABC. Efter inkubation i 45 minuter tvättades plattorna och utvecklades med TMB i 30 minuter i rumstemperatur. Reaktionen stoppades genom tillsats av 20 μl stopplösning. Absorptionen mättes på en ELISA-läsare (BIO-RAD 680) vid 450 nm.

2.9. Mätning av cytokiner i BALF

Koncentrationerna av Th2- (IL-4, IL-5, IL-10 och IL-13) och Th1-cytokiner (IFN-γ och IL-2) i BALF påvisades med hjälp av kommersiella ELISA-kit enligt tidigare .

2.10. Kvantitativ realtids-PCR (qRT-PCR)

MRNA-uttrycksnivåerna för Th2- (IL-4, IL-5, IL-10 och IL-13) och Th1-cytokiner (IFN-γ och IL-2) i lungvävnader bestämdes med qRT-PCR. Det totala RNA isolerades från homogeniserade lungvävnader med hjälp av Trizol-reagenset enligt tillverkarens protokoll, och omvänd transkription utfördes som tidigare . Därefter utfördes amplifiering i 20 μl reaktion med FastStart Universal SYBR Green Master. PCR i realtid utfördes med hjälp av ett ABI 7400 Real-Time PCR-system. Primerna för qRT-PCR syntetiserades av Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. (Kina), och sekvenserna anges i tabell 2. qPCR-cyklingarna utfördes enligt följande: inledande denaturering vid 95 °C i 10 minuter följt av 40 cykler med denaturering vid 95 °C i 10 s, glödgning vid 60 °C i 1 minut. GAPDH användes som endogen kontroll. Primeramplifieringseffektivitet och specificitet kontrollerades för varje uppsättning primers. Uttrycksnivåerna för de testade generna i förhållande till GAPDH bestämdes med hjälp av metoden och som viktad induktion .

Gen Primersekvens Produktstorlek (bp) GAPDH 5′-AGCCTCGTCCCCGTAGACAA-3′ 104 5′-AATCTCCACTCTTTGCCACTGC-3′ IL-2 5′-CCCAAGCAGGCCACACAGAATTGAAA-3′ 81 5′-AGTCAAATCCAGAACATGCCGCAG-3′ IFN-γ 5′- TCTTGAAAGACACAATCAGGCCATCA -3′ 233 5′- GAATCAGCAGCGACTCCTTTTCC -3′ IL-4 5′-CAAACGTCCTCACAGCAACG-3′ 203 5′-CTTGGACTCATTCATGGTGC-3′ IL-5 5′- GCTGGCCTCAAACTGGATATGTA -3′ 100 5′- GGCAATGGTGCATGTCTGTAACCTC -3′ IL-10 5′- GCTCTTACTGACTGGCATGAG -3′ 105 5′- CGCAGCTCTAGGAGCATGTG -3′ IL-13 5′- GCTTGCCTCTTGGTGGTCTCGCC -3′ 175 5′- GGGCTACACAGAACCCGCCA -3′

Tabell 2

Primersekvenser som använts för qRT-PCR.

2.11. Statistisk analys

Data uttrycktes som medelvärde ± standardavvikelse (SD) och undersöktes för statistisk signifikans av skillnader med ANOVA och ett Tukey post hoc-test. -värden på mindre än 0,05 ansågs vara statistiskt signifikanta.

3. Resultat

3.1. HPLC-profil av SLPCD

Innehållet av klorogensyra och rutin i SLPCD analyserades med hjälp av HPLC. Jämfört med standardreferensföreningar identifierades och bestämdes klorogensyra och rutin (figur 2). Regressionsekvationerna från kalibreringskurvan för standarderna var A = 3719,7C – 102166 (R2=0,9999) och A = 9137,3C – 408038 (R2=0,9996) för klorogensyra respektive rutin. Koncentrationerna av klorogensyra och rutin i SLPCD var 1,4 mg/g respektive 0,15 mg/g.

(a)

(b)

.
(a)
(b)

Figur 2

HPLC-kromatogram för SLPCD. Representativa kromatogram av standardreferensföreningar (a) och SLPCD (b) visas. ① Klorogensyra och ② rutin.

3.2. SLPCD dämpade luftvägsinflammation hos astmatiska möss

SlampCD:s effekt på lunginflammation hos OVA-inducerade astmatiska möss observerades via H&E-färgning, och resultaten visas i figur 3. Astmamodellmössen uppvisade allvarligare interstitiell, peribronchiolär och perivaskulär inflammatorisk cellinfiltration i lungan jämfört med normala kontrollmöss. Som en positiv kontroll lindrade Dex signifikant infiltrationen av interstitiella, peribronchiolära och perivaskulära inflammatoriska celler i lungan hos astmamöss. De inflammatoriska infiltraten i lungorna hos OVA-challengagerade möss lindrades också betydligt av SLPCD jämfört med modellkontrollen.

(a)

(b)

(c)

(c)

.

(d)

(e)

(f)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)

Figur 3

Effekter av SLPCD-behandling på histopatologiska förändringar i lungorna. Lungsektionerna färgades med hematoxylin och eosin. De ljusfotomikrografer som visas var representativa för lungsektioner från tio möss per grupp. (a) Normal kontroll (NC), (b) modellkontroll (MC), (c) dexametason (Dex, positiv kontroll), (d) SLPCD (5,5 g/kg), (e) SLPCD (11 g/kg) och (f) SLPCD (11 g/kg).

3.3. SLPCD minskade antalet inflammatoriska celler i BALF hos astmatiska möss

För att fastställa effekterna av SLPCD på infiltrationen av inflammatoriska celler i lungan hos OVA-inducerade astmatiska möss, räknades antalet inflammatoriska celler inklusive eosinofiler (Sigilec F+), basofiler (CD117+), neutrofiler (Ly-6C+y-6), makrofager (F4/), monocyter (Ly6G-Ly6C+) och mastceller (FcER1+) i BALF med flödescytometri. Som framgår av figur 4 var antalet eosinofiler (1756 gånger), makrofager (114 gånger), neutrofiler (110 gånger), basofiler (91,7 gånger), monocyter (45,8 gånger) och mastceller (6,9 gånger) i BALF från astmatiska möss markant förhöjt jämfört med normala kontrollmöss. Dex minskade signifikant antalet olika inflammatoriska celler som testades i BALF från astmatiska möss (), nästan nära nivåerna hos normala möss. Antalet av dessa inflammatoriska celler i BALF från astmatiska möss reducerades signifikant dosberoende av SLPCD jämfört med modellkontrollgruppen (, , eller ).

Figur 4

Effekt av SLPCD på rekryteringen av inflammatoriska celler i BALF hos OVA-inducerade astmamöss. BALF samlades upp 24 timmar efter den sista administreringen och cellsammansättningen analyserades med FACS som beskrivs i texten. Värdena presenteras som medelvärden ± SD (). Signifikanta skillnader jämfört med astmamodellens kontrollgrupp (MC) betecknas som , , och . Dex: dexametason (positiv kontroll), NC: normal kontrollgrupp.

3.4. SLPCD minskade de totala IgE-nivåerna i serum hos astmatiska möss

Slpcd:s effekter på de totala IgE-nivåerna i serum hos astmatiska möss visas i figur 5. De totala IgE-antikroppsnivåerna i serum hos astmatiska möss var betydligt högre än hos normala kontrollmöss (). Som ett positivt läkemedel minskade Dex signifikant de totala IgE-antikroppsnivåerna i serum hos OVA-inducerade astmatiska möss (). De totala IgE-antikroppsnivåerna i serum hos de astmatiska mössen minskade signifikant dosberoende av SLPCD jämfört med modellkontrollgruppen ().

Figur 5

Effekter av SLPCD på nivåerna av totalt IgE i serum hos OVA-inducerade astmamöss. Serum samlades upp 24 timmar efter den sista administreringen och nivåerna av totalt IgE mättes med hjälp av ELISA-kit som beskrivs i texten. Värdena presenteras som medelvärden ± SD (). Signifikanta skillnader jämfört med astmamodellens kontrollgrupp (MC) betecknas som . Dex: dexametason (positiv kontroll) och NC: normal kontrollgrupp.

3,5. SLPCD modulerade nivåerna av cytokiner i BALF hos astmatiska möss

Nivåerna av Th2- (IL-4, IL-5, IL-10 och IL-13) och Th1-cytokiner (IFN-γ och IL-2) i BALF mättes med ELISA. Som framgår av figur 6 ledde OVA-utmaning till en signifikant ökning av nivåerna av IL-10 och IL-13 och en minskning av IFN-γ i BALF hos de astmatiska mössen jämfört med den normala kontrollgruppen ( eller ). Halterna av IL-4, IL-5 och IL-2 i BALF hos modellkontrollmöss visade sig dock vara mycket låga och nära detektionsgränsen. Administrering av SLPCD i tre doser och Dex minskade signifikant halterna av IL-13 och IL-10, samt höjde anmärkningsvärt halterna av IFN-γ i BALF hos OVA-inducerade astmatiska möss jämfört med modellkontrollmöss ( eller ) (figur 6).

Figur 6

Effekter av SLPCD på nivåerna av cytokiner i BALF hos OVA-inducerade astmamöss. BALF samlades in 24 timmar efter den sista administreringen. Nivåerna av Th1- (IL-10 och IL-13) och Th1-cytokiner (IFN-γ) i BALF mättes med hjälp av ELISA-kit som beskrivs i texten. Värdena presenteras som medelvärden ± SD (). Signifikanta skillnader jämfört med astmamodellens kontrollgrupp (MC) betecknas som och . Dex: dexametason (positiv kontroll) och NC: normal kontrollgrupp.

3.6. SLPCD reglerade mRNA-uttrycksnivåerna av cytokiner i lungvävnad hos astmatiska möss

SlampCD:s effekter på mRNA-uttrycket av cytokiner av Th1- och Th2-typ i lungvävnad hos OVA-inducerade astmatiska möss detekterades med hjälp av qRT-PCR, och resultaten visas i tabell 3. Jämfört med de normala kontrollmössen var uttrycksnivåerna för Th2-cytokin-mRNA (IL-4, IL-5, IL-10 och IL-13) tydligt uppreglerade och uttrycksnivåerna för Th1-cytokin-mRNA (IL-2 och IFN-γ) var signifikant nedreglerade i lungvävnader från astmatiska möss (P < 0,001). Administrering av SLPCD i tre doser och Dex resulterade i signifikant nedreglering av mRNA-uttrycksnivåerna för Th2-cytokinerna IL-4, IL-5, IL-10 och IL-13 och uppreglering av dem för Th1-cytokinerna IL-2 och IFN-γ i lungvävnader från astmatiska möss jämfört med de astmatiska modellgrupperna (P < 0,05, P < 0,01 eller P < 0,001).

Grupp Dos IL-4 IL-5 IL-10 IL-13 IL-2 IFN-γ NC – 1.00±0.14 1.00±0.23 1.00±0.19 1.00±0.31 1.00±0.19 1.00±0.13 MC – 38.91±2.96 5.22±0.64 7.49±0.23 142.3±14.6 0.73±0.13 0.59±0.15 CTX (mg/kg) 50 19.08±2.62 2.56±0.42 5.07±0.67 44.00±7.74 1.20±0.20 2.14±0.34 SLPCD (g/kg) 5.5 21.70±4.64 4.06±0.38 6.68±0.68 71.26±10.62 1.28±0.20 1.12±0.20 11 21.30±3.71 3.74±0.37 6.21±0.44 65.4±11.99 1.33±0.26 1.53±0.21 22 23.09±3.27 3.07±0.34 6.03±0.65 61.51±8.77 1.49±0.34 1.71±0,23

Lungvävnaderna samlades in 24 timmar efter den sista administreringen och mRNA-uttrycksnivåerna av GAPDH och cytokiner detekterades med qRT-PCR med hjälp av specifika primers. Den hushållande genen GAPDH användes som endogen kontroll. Värdena presenteras som medelvärden ± SD (). Signifikanta skillnader jämfört med astmamodellens kontrollgrupp (MC) betecknas som , , och . Dex: dexametason (positiv kontroll) och NC: normal kontrollgrupp.

Tabell 3

Effekt av SLPCD på mRNA-uttrycksnivåerna för cytokiner i lungvävnader hos OVA-inducerade astmatiska möss.

4. Diskussion

Astma har blivit ett folkhälsoproblem över hela världen, särskilt i utvecklade länder . Glukokortikoider är förstahandsbehandling för behandling och kontroll av astma. Även om dessa läkemedel kunde förbättra astmasymtomen var de strikt kontrollerade för långvarig användning på grund av deras allvarliga biverkningar . Det behövs därför nya terapeutiska metoder för astma. Många traditionella kinesiska läkemedel uppvisar olika biologiska aktiviteter, inklusive antibakteriella, svampdödande, antiinflammatoriska, antianafylaktiska och immunmodulerande effekter, som har potential för astmabehandling. Olika modeller av allergisk bronkopulmonell inflammation hos experimentella möss har beskrivits. Den OVA-inducerade musmodellen för allergisk astma replikerar många av de egenskaper som kännetecknar astma hos människor, och den har fått stor acceptans. Därför undersökte vi SLPCD:s antiastmatiska effekter och utforskade dess molekylära mekanismer med hjälp av denna modell.

SLPCD består av 13 traditionella kinesiska läkemedel. Cortex Mori, Pheretima Aspergillum och Herba Ephedrae är den primära komponenten som sprider lungan och lindrar astma. Semen Armeniacae Amarum, röra-bakad Fructus Perillae, Semen Descurainiae och honungsbakad Flos Farfarae är kompletterande komponenter som minskar slem, lindrar hosta och astma. De adjuvanta komponenterna omfattar Rhizoma Belamcandae, Herba Houttyniae och Rhizoma Fagopyri Dibotrydis som rensar bort hetta ondska och driver ut ytliga onda ting, samt Scorpio och Radix Angelicae Sinensis som skingrar blodstasier, muddrar kollaterala, spasmolariserar och stoppar astma. Radix et Rhizoma Glycyrrhizae harmoniserar alla läkemedel. Sammantaget kompletterar alla komponenter varandra för att uppnå resultaten att sprida lungan, sänka Qi och lindra hosta och astma. Kvalitetskontrollen av SLPCD som användes i denna studie genomfördes med hjälp av HPLC, och två referenskemikalier (klorogensyra och rutin) identifierades som viktiga indexkomponenter (figur 2).

Allergisk astma definieras som en akut kronisk inflammatorisk sjukdom i luftvägarna med karakteristisk eosinofil rekrytering, hyperplasi av gobletceller, slemhinnehypersekretion, kollagenavlagring, hypertrofi av glattmuskelceller och subepitelial fibros . I den här studien bedömdes effekterna av SLPCD-behandling på lunginflammation hos OVA-challengagerade astmatiska möss via H&E-färgning. Den typiska allergiska ackumulationen och infiltrationen av inflammatoriska celler observerades i lungvävnaden hos astmatiska modellmöss. Behandlingen av SLPCD minskade de inflammatoriska infiltraten i lungvävnaden hos astmatiska möss (figur 3), vilket tyder på att SLPCD tydligt lindrade luftvägsinflammation.

De inflammatoriska immuncellerna spelar en nyckelroll i patogenesen och svårighetsgraden av astma . De inflammatoriska celler som rekryteras från regionala lymfkörtlar till luftvägarna kan utsöndra cytokiner och kemokiner, vilket leder till hyperreaktivitet i luftvägarna . Att minska de inflammatoriska cellerna i luftvägarna är ett effektivt sätt att behandla astma . För att bekräfta att SLPCD kan hämma infiltrationen av inflammatoriska celler räknade vi ytterligare eosinofiler, makrofager, neutrofiler, basofiler, monocyter och mastceller i BALF. OVA-inhalation ledde till betydande ökningar av antalet av dessa sex sorters inflammatoriska celler i BALF (figur 4). Ökningen var 1756, 114, 110, 91,7, 45,8 och 6,9 gånger för eosinofiler, makrofager, neutrofiler, basofiler, monocyter och mastceller, vilket tyder på en tillfredsställande etablering av en modell för förvärrad astma i denna studie. Behandling med SLPCD minskade signifikant och dosberoende antalet av dessa inflammatoriska celler, särskilt eosinofiler, i BALF i jämförelse med astmatiska möss (figur 4). Dessa resultat tyder på att SLPCD minskade infiltrationen av inflammatoriska celler i lungan hos OVA-inducerade astmatiska möss, vilket stämmer överens med resultaten av den histopatologiska observationen.

Det är välkänt att förhöjda IgE-antikroppsnivåer var korrelerade med allergisk inflammation i luftvägarna och bronkial hyperreaktivitet i astmamodellmöss . Coyle et al. rapporterade att anti-IgE-antikroppar dämpade eosinofil luftvägsinflammation och bronkial hyperreaktivitet hos astmatiska möss. Allergeninducerat IgE utlöste eosinofiler, basofiler och mastceller som utsöndrade cytokinerna IL-4, IL-5, IL-10 och IL-13 . Därför bedömde vi de totala IgE-nivåerna i serum och fann att SLPCD signifikant kunde sänka de totala IgE-nivåerna i serum hos OVA-challengagerade astmamöss (figur 5).

Den obalans som råder mellan Th1/Th2-celler anses vara den immunologiska orsaken till astma . Vid astma minskar Th1-cellernas aktivitet, medan Th2-cellernas aktivitet aktiveras, vilket resulterar i en ökning av cytokiner av Th2-typ och en minskning av Th1-cytokiner . Th2-celler som migrerat till lungan utsöndrar de prototypiska Th2-cytokinerna IL-4, IL-5 och IL-13, vilket leder till gobletcellshyperplasi, bronkokonstriktion och eosinofili i luftvägarna . In vitro kan IL-13 förmedla produktionen av IgE och kan spela en nyckelroll i patogenesen för IgE-medierade allergiska sjukdomar . IL-13 kan också öka eosinofilers överlevnad och bidra till dessa cellers patologiska aktiviteter vid astma . Möss som överuttrycker IL-13 replikerar flera av astmans egenskaper, inklusive pulmonell eosinofili, epitelhyperplasi, obstruktion av luftvägarna och överreaktion på kolinerga läkemedel.

Undertryckning av produktionen av Th2-cytokiner skulle visa sig vara användbar för allergenimmunoterapi . Å andra sidan kan Th1-aktiverade celler hämma inflammationen i astmatiska luftvägar . Th1-cytokiner, t.ex. IFN-γ, hämmar allergeninducerad eosinofilrekrytering och IgE-frisättning via nedreglering av GATA-3-, IL-4- och IL-5-uttrycket i lungvävnaden i en astmamodell . I den här studien uppskattade vi effekten av SLPCD på cytokinnivåerna i BALF från astmatiska möss. Resultaten visade att SLPCD dosberoende inte bara minskade nivåerna av IL-13 och IL-10 utan också höjde nivån av IFN-γ i BALF från de astmatiska mössen (figur 6). Den hämmande effekten av SLPCD-behandling på produktionen av Th2-cytokiner överensstämde med dess effekt på nivåerna av totalt IgE i serum.

Det rapporterades att IL-5 spelar en viktig roll för eosinofilers proliferation, differentiering, mognad och migration till vävnadsplatser. Uttrycksnivåerna av IL-5 mRNA i bronkialbiopsier från astmatiker var uppreglerade jämfört med icke-astmatiska kontroller . Uttrycksnivåerna av IL-5 mRNA var korrelerade med den kliniska svårighetsgraden av astma . Den ackumulativa allergenprovokationen uppreglerade IL-4 mRNA-uttrycket i BALF-celler och perifera CD4+ och CD8+ T-celler . IL-10 har också indikerats delta i astma . Uppregleringen av IL-13-transkriptioner i BAL-celler hos patienter med lindrig astma efter lågdosallergenutmaning stämmer överens med den högre uttrycksnivån av IL-13 mRNA i bronkieslemhinnan . Effekterna av SLPCD-behandling på mRNA-uttrycksnivån för cytokiner i lungvävnader från de astmatiska mössen bestämdes vidare med hjälp av qRT-PCR. SLPCD-behandlingen minskade signifikant mRNA-uttrycksnivåerna för Th2-cytokiner (IL-4, IL-5, IL-10 och IL-13) och ökade mRNA-uttrycksnivåerna för Th1-cytokiner (IL-2 och IFN-γ) i lungor från astmatiska möss. Dessa resultat bekräftade ytterligare de reglerande effekterna av SLPCD-behandling på Th1- och Th2-cytokinsvar i lungvävnader från astmatiska möss.

Slutsatsen är att SLPCD signifikant kunde hämma luftvägsinflammation, reducera inflammatoriska celler i BALF, sänka de totala IgE-nivåerna i serum och modulera innehållet av cytokiner i BALF och mRNA-uttrycket av cytokiner i lungor från astmatiska möss. Dessa resultat tyder på att SLPCD kan dämpa luftvägsinflammation och lindra patogenesen i en musmodell av astma genom att inducera ett balanserat Th1/Th2-svar och validerar dess kliniska användning som ett effektivt läkemedel vid behandling av astma.

Offentliggörande

Binnian Zhus nuvarande adress är ACON Biotech (Hangzhou) Co, Ltd., Hangzhou 310030, China.

Intressekonflikter

Författarna förklarar att det inte finns några intressekonflikter.

Författarnas bidrag

Binnian Zhu och Jun Dong bidrog i lika stor utsträckning till detta forskningsarbete.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av Grant-in-Aid från Shaoxing Science and Technology Project (no. 2014B700722).