Antiaterogena och antiischemiska egenskaper hos traditionell kinesisk medicin Xinkeshu via endotelskyddande funktion

Abstract

Inklusive örtmedicin är komplementär och alternativ medicin (CAM) populär över hela världen. Den traditionella kinesiska medicinen xinkeshu har använts i stor utsträckning för att behandla kranskärlssjukdom i Kina. Denna studie var utformad för att undersöka den skyddande effekten och sannolika mekanismen av xinkeshu tablett till aterosklerotisk myokardiell ischemi kanin. Kaniner delades in i fyra grupper ( vardera) och utfodrades med olika foder i 12 veckor: Kontroll (standarddiet), Model (högkolesteroldiet), XKS (högkolesteroldiet med 184,8 mg/kg/d xinkeshu) och Atorvastatin (högkolesteroldiet med 5,0 mg/kg/d atorvastatin). Plasmalipoprotein, EKG, endotelberoende kärlrelaxation, histomorfologisk undersökning och uttryck av eNOS och VCAM-1 på kranskärlen bedömdes. Resultaten visade att xinkeshu, i likhet med atorvastatin, uppvisade signifikanta effekter på att rädda endotelberoende kärlrelaxation, hämma aterosklerotiska framsteg, förhindra myokardiell ischemi och förändra eNOS- och VCAM-1-uttryck. Xinkeshu visade dock ingen lipoproteinsänkande effekt hos hyperkolesterolemiska kaniner. Resultaten av denna studie visade att xinkeshu utövade potenta antiaterogena och anti-ischemiska egenskaper på aterosklerotisk myokardiell ischemi kanin. En endotelskyddande effekt kan vara inblandad i mekanismen utöver den antihyperlipidemiska effekten.

1. Introduktion

Koronar hjärtsjukdom (CHD) orsakas huvudsakligen av ateroskleros, och höga kolesterolnivåer spelar en viktig roll i uppkomsten av denna sjukdom . Orsakerna till ateroskleros tycks vara lipidretention, oxidation och modifiering, vilket framkallar kronisk inflammation på känsliga ställen i väggarna i alla större ledningsartärer . Även om stora framsteg har gjorts när det gäller att minska dödligheten till följd av hjärt-kärlsjukdomar är detta tillstånd fortfarande den främsta dödsorsaken i världen . Statiner är de mest effektiva läkemedlen på detta område. Studier har visat att statiner inte bara kan sänka lipoprotein med låg densitet (LDL) utan också höja lipoprotein med hög densitet (HDL) och förbättra den vaskulära endotelfunktionen . Leverdysfunktion och myolys som biverkningar av statiner fick dock vissa patienter att avbryta behandlingen . Kompletterande och alternativ medicin (CAM), inklusive örtmedicin, är populär bland befolkningen i hela världen . Ett antal örter eller växter med potenta terapeutiska komponenter har undersökts för sina antihyperlipidemiska, antioxidativa och antiaterosklerotiska egenskaper . Användningen av örtmedicin för behandling av olika sjukdomar, inklusive hjärtsjukdomar, har en lång och omfattande historia.

I Kina är traditionella kinesiska växtbaserade produkter med låga bieffekter av stort intresse som CAM-terapi vid CHD . Traditionell kinesisk medicin (TCM) xinkeshu (XKS) i tablettform är ett sammansatt recept formulerat enligt TCM:s meridianteori och godkänt 2005 av Kinas statliga livsmedels- och läkemedelsmyndighet som behandling av angina pectoris och arytmi-patienter på klinik. Här har vi ytterligare undersökt mekanismen för behandling med XKS tablett till aterosklerotiska kaniner. Resultaten kan sammanfattas på följande sätt: blodplasmalipoproteinnivåer; EKG-test, indikator på allvarlighetsgraden av myokardiell ischemi ; endotelberoende kärlrelaxation (EDVR); histomorfologiska studier; uttryck av endoteliskt kväveoxidsyntas (eNOS) och vaskulärcellsadhesionmolekyl 1 (VCAM-1) på kranskärlen, markörer för endotelfunktion .

2. Material och metoder

2.1. Läkemedel och reagenser

XKS-tabletter kom från Wo Hua Pharmaceutical Co, CHN. Kolesterol kom från Tian Qi Chemical Engineering Co, CHN. Atorvastatin kom från Jia Lin Pharmaceutical Co, CHN. Vasopressin (VP), fenylefrin (PE) och acetylkolin (Ach) kom från Sigma, USA. Polyklonala immunohistokemiska antikroppar av get anti-rabbit eNOS och VCAM-1 kom från Santa Cruz, USA. Streptavidin/peroxidas-kit och biotinylerat mus anti-get IgG kom från Boster, Kina.

2.2. Djur och experimentell utformning

Japanska storöriga kaniner ( kg, 3 veckor gamla, hanar) köptes från laboratoriedjurinstitutet vid Chinese Academy of Medical Science. De var enstammiga i en 12 : 12 timmars ljus-mörkercykel, temperatur-(°C) och luftfuktighet () kontrollerad specifik patogenfri miljö, med vatten tillgängligt ad libitum. All djurvård och alla försöksprotokoll överensstämde med det kinesiska hälsoministeriets regler för hantering av djur, och studien godkändes av den djuretiska kommittén vid Chinese Academy of Medical Sciences. Standardfoderpellets och foderpellets med hög kolesterolhalt (H-ChE) som innehåller 2 % kolesterol (240-280 g/d) för kaniner framställdes av Beijing Scientific Animal Feedstuff Company.

Kaniner delades in i 4 grupper ( per grupp) och försöksupplägget presenterades i figur 1.

Figur 1

Försöksupplägget. H-ChE, 2 % kolesterolester; XKS, Xinkeshu; VP, vasopressin; EKG, elektrokardiogram; EDVR, endotelberoende kärlrelaxation; eNOS, endotelial kväveoxidsyntas; VCAM-1, vascular cell adhesion molecule 1.

Kontroll
Rabbarna utfodrades kontinuerligt med standardpellets i 12 veckor. Kaninerna administrerades intragastriskt med normal saltlösning (10 ml/kg/d).

Modell
Kaniner utfodrades kontinuerligt med H-ChE-dietpellets. De övriga var desamma som kontrollen.

XKS
Kaniner administrerades intragastralt med 184,8 mg/kg/d XKS (motsvarande dos för en vuxen med en medelvikt på 60 kg) i normal koksaltlösning (10 mL/kg/d). De övriga var desamma som modellen.

Atorvastatin
Kaniner administrerades intragastriskt med 5,0 mg/kg/d atorvastatin i normal koksaltlösning (10 mL/kg/d). De övriga var desamma som i modellen.

2.3. Plasmalipoproteinanalys

Fasting venösa blodprover togs i heparin från marginalvenen före och efter 12 veckors försöken. Plasma separerades och förvarades vid -20 °C. Plasmalipoproteinnivåerna, inklusive totalkolesterol (TC), triglycerider (TG), LDL och HDL mättes med hjälp av en automatisk biokemisk analysator (Dimension AR, DuPont, USA).

2.4. EKG-test på VP-inducerad myokardischemi-modell

I slutet av den 12 veckor långa försöksperioden inducerades enligt metoden av Serradeil-Le Gal et al. experimentell koronar vasospastisk myokardischemi med VP. EKG:s standardledare II registrerades kontinuerligt före och 25 minuter efter administrering av VP (2,0 IE/kg, iv.) med ett Powerlab 30-system (AD Instruments, Castle Hill, Australien).

2.5. Bedömning av EDVR

En vecka efter att EKG-testerna avslutats sövdes kaninerna ( per grupp) med 10 % kloralhydrat (25 mg/kg, ip). Enligt Lee et al:s metod togs de färska hjärtan omedelbart fram och förvarades i kallt PBS. Därefter dissekerades bukaortorna och klipptes i 3 mm långa ringar. Ringarna sträcktes till 1,5 g spänning och fick jämna ut sig i 60 minuter i ett 10 ml vävnadsbad (38,6 °C) innehållande Krebs-Henseleit-lösning (sammansättning i mM: 115 NaCl, 25 NaHCO3, 1,38 NaH2PO4, 2,51 KCl, 2,46 MgSO4, 1,91 CaCl2 och 5,56 dextros) och ventilerades med en blandning av 95 % O2 och 5 % CO2. Kraftgenerering övervakades med hjälp av en isometrisk givare som kopplades till Powerlab 30-systemet. Efter jämviktning inducerades vasokonstriktion med 10-6 M PE. När maximal kontraktion hade nått en platå bestämdes EDVR som svaret från 10-9 till 10-4 M Ach. Den procentuella relaxationen beräknades utifrån förändringar i spänningen till det maximala prekontraktionsvärdet inducerat av PE.

2,6. Histomorfologiska studier

De övriga kaninerna ( per grupp) sövdes med 10 % kloralhydrat (25 mg/kg, ip). Perfusionsfixering utfördes på varje kanin genom den vänstra halspulsådern med hepariniserad normal koksaltlösning (70 mL/kg) och 4 % paraformaldehyd (140 mL/kg) i 0,1 M fosfatbuffert med hjälp av en aortakateter (vid ett tryck på ca 100 mmHg), samtidigt klipptes den yttre jugularvenen för att eliminera kvarvarande blod. Två timmar senare under 4,0 °C togs hjärtan och aortor avlägsnades och sänktes i 10 % buffrat formalin över natten.

Aortorna öppnades i längsled längs den bakre sidan och färgades sedan med Sudan IV för visualisering av de aterosklerotiska placken. Efter färgningen pinnades aortorna upp för att platta ut dem och fotograferades. Den totala arean () och plackarean () i aortan analyserades morfometriskt med hjälp av Image-Pro Plus 7.0 morfometriskt analyssystem (Media Cybernetics, USA). Förhållandet mellan aterosklerotiska plack beräknades som .

Vänstra cirkumflexa koronarartären (2 cm lång) med intilliggande myokardvävnader skars försiktigt upp. Proverna bäddades in i paraffin och skars i 5 μm stora snitt på en mikrotom, och tvärsnitten färgades sedan med hematoxylin och eosin (HE) och skannades med hjälp av NanoZoomer Digital Pathology image analysis system (Hamamatus, Olympus, JAP). Lumenområdet () och det område som avgränsas av den inre elastiska lamina () analyserades morfometriskt med hjälp av Image-Pro Plus 7.0-analyssystemet för ×200 förstoringar. Koronarstenosförhållandet beräknades som .

2,7. Immunohistokemiska studier av eNOS och VCAM-1 på kranskärl

eNOS- och VCAM-1-uttryck utvärderades immunohistokemiskt på kranskärl med hjälp av streptavidin/peroxidas-kit enligt tillverkarens anvisningar. Sektionerna avparaffiniserades, rehydrerades och blötlades sedan i antigenåtervinningsbuffert (0,01 M Tris-bas, 1,0 M EDTA, 0,05 % Tween 20, pH 6,0) i 3 minuter vid 95 °C. Endogen peroxidasaktivitet blockerades genom att sektionerna inkuberades i 3 % vattenlösning av väteperoxid i 1 timme i rumstemperatur. Sektionerna sköljdes tre gånger med PBS och inkuberades sedan med 100 μL get anti-rabbit eNOS- eller VCAM-1-antikropp av get. Sektionerna sköljdes med PBS och inkuberades med 100 μL biotinylerat mus anti-get IgG (1:100 utspädning i PBS). Protein visualiserades med diaminobenzidin-substratlösning. Primärantikroppen ersattes av PBS i de negativa kontrollerna. Det eNOS- eller VCAM-1-färgade området () och det observerade området () analyserades morfometriskt med hjälp av analyssystemet Image-Pro Plus 7.0 för ×400 förstoring. Den totala befintliga eNOS eller VCAM-1 beräknades semikvantitativt som .

2,8. Statistisk analys

Statistiska analyser gjordes med hjälp av SPSS, v13.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Kvantitativa variabler uttrycks som medelvärde ± SEM. Jämförelse av kontinuerliga variabler mellan flera grupper utfördes genom variansanalys med ANOVA, och post hoc-jämförelser gjordes med LSD-test.

3. Resultat

3.1. Plasmalipoproteinanalys

För 12-veckorsförsöket varierade inte utgångsvärdena för plasmalipoproteinnivåerna (TC, TG, LDL och HDL) signifikant mellan de fyra grupperna. Efter 12-veckorsförsöket uppvisade kaninerna i modellgruppen en signifikant ökning av nivåerna av TC (), LDL (), TG () och en signifikant minskning av nivån av HDL () jämfört med kontrollen. Atorvastatinbehandling i 12 veckor minskade signifikant nivåerna av TC (), LDL () och TG () och ökade signifikant nivån av HDL () jämfört med Model. XKS-behandlingen visade dock en liten minskning () av TC-, TG- och LDL-nivåerna och en liten ökning () av HDL-nivåerna jämfört med Model (tabell 1).

3.2. EKG-test på VP-inducerad myokardisk ischemi-modell

Injektion av VP (iv.) i medvetna kaniner inducerade övergående ST-segmenthöjning i EKG i varje grupp. Den maximala ST-segmentförhöjningen observerades 5-10 minuter efter VP-administrering i kontrollgruppen. Kaniner i modellgruppen uppvisade signifikant högre () ST-segmenthöjning än kontrollen. XKS-behandling visade signifikant () antiischemisk effekt (hämning av ST-segmenthöjning inducerad av VP) än modell. Atorvastatin visade också signifikant () antiischemisk effekt; XKS var dock effektivare () än Atorvastatin (tabell 2 och figur 2).

Figur 2

Max ST-segmentförhöjning i EKG efter vasopressinadministrering.

Transient nedsättning av hjärtfrekvensen (HR) förekom efter VP-administration i varje grupp. Effekten kulminerade efter 10-15 min i kontrollen. Kaniner i modellgruppen uppvisade tydligare HR-dekrement () jämfört med kontroll. XKS-behandling visade signifikant () hämning på HR-dekrement jämfört med Model. Ingen signifikant hämningseffekt () observerades dock med atorvastatinbehandling jämfört med Model (Figur 3).

Figur 3

Hjärtrytmkurvor efter vasopressinadministrering.

3.3. Bedömning av EDVR

Ach (10-9 till 10-4 M) orsakade en koncentrationsberoende relaxation i prekonstrikerade bukaortaringar. Den maximala EDVR var signifikant nedsatt () hos kaniner i modellgruppen jämfört med kontroll. Behandling med XKS och Atorvastatin dämpade signifikant () försämringen jämfört med Model. Atorvastatin var effektivare () än XKS (figur 4).

Figur 4

Endothelia-beroende kärlrelaxationskurvor för bukaortaringar.

3.4. Histomorfologiska studier

Ingen av kontrollgruppens kaniner uppvisade några onormala histologiska förändringar i aorta. Typiska makroskopiska aterosklerotiska plack på aortas intimala yta kan ses tydligt och allmänt hos modellkaniner. Aterosklerotiska plack fick en röd färg genom Sudan IV-färgning. Behandling med XKS och atorvastatin minskade signifikant () arean av aterosklerotiska plack jämfört med modellkaniner. Effekten var likartad () mellan de två grupperna (figur 5).

(a)

(b)

(a)
(b)

Figur 5

Aterosklerotiska plack på den intima ytan av aorta genom Sudan IV-färgning.

Ingen aterosklerotiska förändringar av någon artärvägg uppvisades hos kaninerna i kontrollgruppen. Men hos modellkaniner uppvisade vissa intramyokardiella små arterioler betydande aterosklerotiska förändringar, inklusive att de basala lamellerna runt de glatta muskelcellerna var oregelbundet förtjockade och multilaminerade. Kollagenfibrillerna hade ökat betydligt i media, och ett stort antal lipider hade infiltrerats i den förtjockade intima. Koronarlumen blev stenos tillsammans med lipidavlagringar som innehöll skumceller. Kaninerna i modellgruppen uppvisade en signifikant () koronarstenos jämfört med kontrollen. Behandling med XKS och Atorvastatin hämmade signifikant () kranskärlsstenosen jämfört med Model. Effekten var likartad () mellan de två grupperna (figur 6).

Figur 6

Koronarstenos genom HE-färgning (ljusmikrografer, mitten 100×, vänster överst 400×).

3.5. Immunohistokemiska studier av eNOS och VCAM-1 på kranskärl

I kontrollgruppen kunde eNOS-positiv färgning observeras i cytoplasman i kranskärlets intima lagerområde. Förekomsten av eNOS var signifikant minskad () i modellgruppen jämfört med kontrollgruppen. XKS och Atorvastatinbehandling ökade signifikant () den existerande eNOS signifikant () jämfört med Model. Atorvastatin var effektivare () än XKS (Figur 7).

Figur 7

Föreliggande eNOS och VCAM-1 på kranskärl genom immunohistokemisk färgning (ljusmikrografer, 400×).

I kontrollgruppen observerades sällan positiv färgning av VCAM-1 i hela kranskärlsväggen. Den kunde dock observeras i stor utsträckning i kollagenfibriller och skumcellsrika områden i kärlväggen i modellgruppen, och förekomsten av VCAM-1 var signifikant () ökad jämfört med kontrollgruppen. XKS- och atorvastatinbehandling minskade VCAM-1 signifikant () jämfört med modellgruppen. XKS var effektivare () än Atorvastatin (Figur 7).

4. Diskussion

CAM inklusive örtmedicin har fått en världsomspännande popularitet under de senaste 20 åren. Det hävdas att patienter med kroniska sjukdomar inklusive hjärt- och kärlsjukdomar sannolikt kommer att använda CAM . Växtmedicin är en metod med användning av medicinalväxter eller örter för att förebygga och behandla sjukdomar, och den sträcker sig från traditionella och populära läkemedel i varje land till användningen av standardiserade och titrerade örtextrakt.

XKS-tabletten användes i stor utsträckning för att behandla hjärt-kärlsjukdomar av traditionella utövare i Kina i mer än tio år. Klinisk forskning visade att XKS hade många biologiska aktiviteter, inklusive förbättring av hjärtfrekvensens variabilitet, minskning av episoden av angina pectoris, förbättring av den arteriella elasticiteten . Samtidigt visade farmakologisk grundforskning att XKS-administrering hade en rad olika terapeutiska effekter, t.ex. minskad syreförbrukning i hjärtmuskeln, sänkning av lipider och antiapoptos.

I denna studie valdes atorvastatin som en positiv kontrollbehandling. Resultaten visade att atorvastatinbehandling i 12 veckor var mycket effektiv för att sänka plasma TC- och LDL-nivåerna, öka HDL-nivån, minska experimentell myokardiell ischemi, rädda EDVR och hämma aterosklerotiska framsteg. XKS-behandling i 12 veckor gav liknande effekter på att rädda EDVR och hämma aterosklerotisk utveckling som atorvastatin. Även XKS var effektivare än atorvastatin när det gällde att förebygga myokardiell ischemi och upprätthålla hjärtrytmen. Kanske var dessa egenskaper de viktigaste mekanismerna hos XKS för klinisk angina pectoris och arytmibehandling . Å andra sidan var ett av de viktiga resultaten i den aktuella studien att inga signifikanta förändringar i lipidprofilerna inträffade hos de kaniner som administrerades med XKS. Med andra ord visade XKS ingen lipoproteinsänkande effekt på den hyperkolesterolemi som inducerades av H-ChE-dieten.

Det är väl känt att endotelskador är en nyckelhändelse i aterosklerosens patogenes. Ateroskleros kan induceras från enkel dysfunktion av endotelfoderet som uppstår vid hyperkolesterolemi . Endotelcellernas homeostas upprätthålls till stor del genom syntesen av kväveoxid (NO), en potent vasodilator som syntetiseras av eNOS. NO fyller viktiga funktioner, bl.a. reglering av kärltonen och det regionala blodflödet samt undertryckande av proliferation av glatta muskulaturceller i kärlen. eNOS påverkas av olika stimuli, bl.a. hypoxi, skjuvstress, LDL samt utveckling och progression av ateroskleros . Minskat uttryck eller inaktivering av eNOS anses vara en avgörande faktor för utvecklingen av endotelisk dysfunktion . Man har upptäckt att vaskulära adhesionsmolekyler spelar en viktig roll vid ateroskleros, och dessa molekyler spelar en viktig roll vid vidhäftning av cirkulerande leukocyter till endotelet, vilket är det första steget i initieringen av ateroskleros . VCAM-1 är ett transmembran glykoprotein som uppregleras och uttrycks på platser som är benägna att drabbas av ateroskleros även innan makroskopisk sjukdom uppträder, och uttrycket kvarstår i mer avancerade aterosklerotiska lesioner. Aterogen kost kan snabbt inducera VCAM-1-uttryck i aortiskt endotel i aortiska organkulturer .

I enlighet med den nya egenskapen av antiaterogen och antiischemia inte via antihyperlipidemisk väg, fokuserade vi på endotelskydd som mål för att undersöka den faktiska mekanismen för XKS. eNOS och VCAM-1 valdes ut som antiaterogena respektive aterogena faktorer. Resultaten visade att 12 veckors H-ChE-diet orsakade minskande uttryck av eNOS samt ökande uttryck av VCAM-1under förfarandet av ateroskleros. Atorvastatin och XKS-behandling visade båda kärlskyddande egenskaper genom att förändra uttrycket av eNOS och VCAM-1. Därför var ett betydande endotelskydd för kärl troligen en av de viktiga mekanismer som är inblandade i XKS kardioprotektiva egenskaper.

XKS innehåller fem växtbaserade medicinska komponenter, och de är Salvia miltiorrhiza Bunge, Panax notoginseng (PN), Fructus Crataegi, Radix Puerariae och Radix Aucklandiae (tabell 3). Materialen maldes ursprungligen till ett fint pulver med en mikronisator och framställdes som tablett, som autentiserades och standardiserades på grundval av markörföreningar i den kinesiska farmakopén 2010 . Flera grupper av monomerer med särskilda biologiska aktiviteter extraherades från varje enskild komponent, t.ex. dämpning av lungfibros av PN-extrakt , sänkning av plasmakolesterol av hagtornsextrakt , förbättring av insulinresistens av Puerarin-extrakt och dämpning av idiopatiskt ödem av radix Aucklandiae-extrakt . Enligt TCM-teorin betraktades Salvia miltiorrhiza Bunge som ett slags ”huvudläkemedel”, Panax notoginseng som ”ministeriellt läkemedel”, och de andra tre komponenterna fungerade som ”tilläggsläkemedel” bland komponenterna i XKS . Tanshinone IIA var en av de viktigaste monomererna i Salvia miltiorrhiza Bunge-extraktet. De biologiska aktiviteterna hos Tanshinone IIA handlade om minskad syreförbrukning i hjärtmuskeln, dilatation av kranskärlen och förbättring av neuronregeneration, antihypertension och antioxidant .

Latin binomial Herb eller växtkällor Del används Andel (%) Radix salviae miltiorrhiae Salvia miltiorrhiza Bge. Rot och rhizom 32 Panax notoginseng Panax Notogin seng (Burk) F.H Chen Rot och rhizom 2 Hawthorn Crataegus pinnatifida Bge. Frukt 32 Radix Puerariae Pueraria lobata Rot och rhizom 32 Radix Aucklandiae Aucklandia lappa Decne. Rot och rhizom 2

Tabell 3

Formulering av xinkeshu tablett.

I denna studie betraktade vi XKS som ett enda ”läkemedel” och undersökte den farmakologiska verkan av alla komponenter tillsammans. Även om resultaten av föreliggande studie gav impulser till ytterligare studier av XKS terapeutiska verkan återstod att klargöra förhållandet mellan dessa komponenter och deras interaktioner. Detta var de huvudsakliga begränsningarna i den aktuella studien. Därför bör den detaljerade molekylära mekanismen hos XKS och ytterligare studier på djur om de aktiva beståndsdelarnas och metaboliternas farmakologiska egenskaper undersökas.

5. Slutsats

Slutsatsen är att det uttryckligen visades att TCM XKS utövade potenta antiaterogena och antiischemiska egenskaper på den aterosklerotiska myokardiella ischemiska kaninmodellen. En endotelskyddande effekt kan vara inblandad i mekanismen utöver den antihyperlipidemiska effekten. Vi trodde att en bättre förståelse av de mekanismer genom vilka XKS skyddar endotelet och interaktionerna mellan aktiva ingredienser kan leda till nya farmakologiska CAM-interventioner för CHD-patienter.

Acknowledgments

Denna studie stöddes av Major State Basic Research Development Program (G2000056905), National Natural Science Foundation (No. 81073021), och Education Ministry Science Foundation (108019) i Kina. Xu Tao och Peng Jing-bo bidrog lika mycket till detta arbete.