[Antigenåterställning: dess betydelse och nackdelar inom immunohistokemi]

Ett av de största problemen inom immunohistokemi har varit hur man ska kunna bibehålla både en god morfologi och immunreaktivitet hos antigener i vävnadssektioner. Olika tekniker för att återfå antigenernas immunoreaktivitet (avmaskering) efter rutinmässiga vävnadspreparationer, t.ex. fixering, uttorkning och inbäddning, har utvecklats och börjar nu användas för immunfärgningar vid inte bara cytohistologiska undersökningar utan även vid patokliniska diagnoser. I den här rapporten undersöktes först mekanismerna och betydelsen av både fixering och antigenhämtning ur synvinkel av proteininaktivering. För det andra granskades vissa praktiska problem och noteringar i två av de mest populära avmaskningsteknikerna, enzymdigestion och heat-induced epitope retrieval (HIER), i syfte att anpassa teknikerna exakt i immunohistokemi. Den viktigaste artefakt som orsakas av fixering är maskering av vävnadsantigen på grund av tvärbindning mellan aminosyraresterna i proteiner. Det är viktigt att välja ett lämpligt fixeringstillstånd för varje antigen med hänsyn till dess biokemiska natur och motståndskraft mot fixering. (Tabell 2) och att hålla fixeringsförhållandena så låga som möjligt så att antigenets immunoreaktivitet lätt kan återfinnas genom olika avmaskningstekniker (Tabell 3, Fig. 1). Antigenhämtning i sig är den process som orsakar proteindenaturering i vävnader, precis som många andra proteininaktiveringsprocesser (tabell 1). Enzymspjälkning kan etsa de maskerande delarna av proteiner runt ett antigen för att exponera dess epitop. Även om enzymspjälkning är relativt enkel och behandlingsförhållandena lätta att kontrollera, är resultaten inte nödvändigtvis dramatiska och konsekventa beroende på vilka typer eller mängder av enzymer som används. Man måste därför hitta sin egen digestionsmanual för att uppnå det bästa färgningsresultatet för varje antigen (t.ex. tabell 4). Exempelvis gav pepsindesutrering de bästa resultaten vid immunfärgning av bromdeoxyuridin (BrdU) och proliferating cell nuclear antigen (PCNA), medan andra enzymer hade liten effekt (tabell 5). Uppvärmning kan också klyva polypeptidryggraden och störa de tvärbindningar som bildats genom fixering. Uppvärmningseffekten på antigenåterhämtning är temperaturberoende och verkar vara proportionell mot produkten av temperatur och tid. När det gäller PCNA-immunfärgning på paraformaldehydfixerade paraffininbäddade sektioner krävdes uppvärmning vid 90 grader C i minst 3 minuter, men när uppvärmningsförhållandet blev strängare ökade också de ospecifika bakgrundsfärgningarna (tabell 6), vilket är ett av de allvarligaste problemen vid antigenhämtning (fig. 2a, c). Ett möjligt val för att undvika sådana oönskade resultat är kombinationen av suboptimal uppvärmning (vid 80 grader C i 10-15 minuter) och pepsinspjälkning (fig. 2b, d). Ett viktigt teoretiskt övervägande vid användning av en sådan dramatisk denatureringsmetod är huruvida de maskerade antigenepitopen kan exponeras på ett adekvat sätt utan att ge upphov till falskt positiva (eller falskt negativa) resultat med tidigare betrodda antikroppar. Det verkar som om varje antigen kräver en ”skräddarsydd” vävnadspreparation för optimalt bevarande av dess antigenicitet och exakta lokalisering. I enlighet med utvecklingen inom immunologi, molekylärbiologi, genetik eller embryologi bör behovet av multipel immunfärgning i kombination med andra tekniker, t.ex. in situ-hybridisering, öka för att man skall kunna analysera de rumsliga och funktionella förhållandena mellan olika molekyler in situ. Antigenåtervinning skulle då bli en kraftfull strategi.