Antimikrobiella peptider: Deras roll som infektions-selektiva spårare för molekylär avbildning

Abstract

Antimikrobiella peptider (AMP) är en heterogen klass av föreningar som finns i en rad olika organismer, inklusive människor, och hittills har hundratals av dessa strukturer isolerats och karakteriserats. De kan beskrivas som naturliga mikrobicider som är selektivt cytotoxiska mot bakterier, samtidigt som de uppvisar minimal cytotoxicitet mot värdorganismens däggdjursceller. De verkar genom sin relativt starka elektrostatiska attraktion till de negativt laddade bakteriecellerna och en relativt svag interaktion med eukaryota värdceller. Dessa pepters förmåga att ackumuleras vid infektionsställen i kombination med den minimala cytotoxiciteten hos värddjuret motiverade denna översikt att belysa AMP:s roll och användbarhet för PET, med tonvikt på deras verkningsmekanism och de olika interaktionerna med bakteriecellen. Dessa detaljer är nyckelinformation för deras selektiva egenskaper. Vi beskriver också strategin, utformningen och utnyttjandet av dessa peptider som potentiella radiofarmaka eftersom deras kombination med nuklearmedicinska metoder som SPECT eller PET skulle möjliggöra en icke-invasiv helkroppsundersökning för upptäckt av dolda infektioner som orsakar t.ex. feber av okänt ursprung.

1. Introduktion

Tomografisk avbildning kan, jämfört med andra konventionella tekniker, utvärdera sjukdomsprocesser djupt inne i kroppen, icke-invasivt och relativt snabbt. Det är därför inte förvånande att molekylär avbildning på ett kraftfullt sätt har ökat undersökningen av olika sjukdomsprocesser och har blivit ett viktigt verktyg inom onkologin, både för forskning och patientvård . En annan stor fördel med avbildning är dess förmåga att ge en holistisk, tredimensionell bedömning av hela organet eller kroppen, som mindre sannolikt begränsas av provtagningsfel och därför stämmer väl överens med den övergripande sjukdomsprocessen. De fortsatta framstegen inom molekylär avbildning har gett oöverträffade möjligheter till mer förfinade metoder för att övervaka sjukdomar, men verktygen för att utvärdera infektioner och inflammationer är fortfarande begränsade. Två avbildningsmetoder som för närvarande används i stor utsträckning på klinikerna är högupplöst datortomografi (CT) som mäter anatomiska (och därmed sena) förändringar eller 18F-märkt 2-fluorodeoxy-D-glukos (18F-FDG)-positronemissionstomografi (PET), som är en allmän markör för metabolisk aktivitet. Eftersom 18F-FDG också ackumuleras på infektions- och inflammationsställen på grund av den förhöjda glukosmetabolismen på dessa ställen är den ospecifik för infektion. Därför blev det allt viktigare att utveckla mer specifika och selektiva bildgivande medel för infektioner. Direkt märkning ex vivo av leukocyter anses vara den gyllene standarden för PET-avbildning av infektioner. Tyvärr är denna process mycket arbetskrävande och tidskrävande och kräver hantering av blodprodukter . Alternativt kan indirekt märkta leukocyter uppnås med hjälp av radioaktivt märkta molekyler, t.ex. kemotaktiska peptider eller cytokiner, som binder till receptorer på leukocyterna . Tyvärr har de biologiska effekterna av vissa av de föreningar som riktar sig mot leukocytreceptorer begränsat deras kliniska användning som infektionsspecifika molekylära avbildningsmedel . Även om de vanligaste märkta leukocyterna, neutrofiler och lymfocyter, är ganska selektiva för infektioner finns det fall då de inte upptäcker en infektion eller ackumuleras på icke-infekterade platser. Om infektionen inte ger upphov till ett immunsvar kommer märkta leukocyter inte att ackumuleras vid de infekterade loci, vilket kan vara fallet hos en kraftigt nedsatt immunförsvar eller vid infektion med vissa patogener, t.ex. Mycobacterium tuberculosis eller Pneumocystis carinii. Vissa icke-infektiösa immunsjukdomar, t.ex. reumatoid artrit, kan också framkalla ett immunsvar och ackumulera spårämnet . Genom att använda olika spårämnen är det möjligt att använda olika målinriktningsstrategier för att avbilda infektioner med hjälp av PET.

Spårämnen som interagerar direkt med de patogena mikrober som är ansvariga för infektionen är till sin natur mycket specifika för infektion och till skillnad från märkta leukocyter bör de inte ackumuleras i sterila inflammationer. Dessa typer av spårämnen omfattar radiomärkta antibiotika och antimikrobiella peptider. Technetium-99m-märkt ciprofloxacin (-ciprofloxacin) har varit den mest studerade antibiotikabaserade spårämnena för SPECT-infektionsavbildning med inriktning på DNA-gyrase, ett enzym som finns i alla bakterier som delar sig, och som inte anses ackumuleras i döda bakterier eller sterila inflammationer. Vissa problem i samband med dess användning som spårämne vid SPECT-infektionsavbildning har uppstått med avseende på dålig radiokemisk renhet och stabilitet. På senare tid har det rapporterats att lokaliseringen vid infekterade foci sker främst genom ökad extravasation och stasis. Denna process sker även på icke-infekterade platser med ökad kärlpermeabilitet och -ciprofloxacin kan ackumuleras på platser med steril inflammation, vilket minskar dess specificitet för infektion.

Antimikrobiella peptider (AMP) har väckt intresse som potentiella målvektorer för utveckling av PET-spårämnen som är utformade för att upptäcka infektioner. Dessa peptider finns i en mängd olika organismer, inklusive människor, och hittills har hundratals isolerats och karakteriserats. Man tror att dessa peptider fungerar som mikrobicider med brett spektrum och utgör en del av det medfödda immunsystemet hos många eukaryoter, inklusive människor. Oavsett deras ursprung har de många gemensamma egenskaper, t.ex. att de har en positiv nettoladdning, att de är amfipatiska och att de i de flesta fall är membranaktiva . På grund av deras roll i kroppen som ett naturligt mikrobicid är dessa antimikrobiella peptider selektivt cytotoxiska mot bakterier, samtidigt som de uppvisar minimal cytotoxicitet mot värdorganismens celler. Man tror att peptidernas katjoniska natur resulterar i en relativt stark elektrostatisk attraktion till negativt laddade bakterieceller och en relativt svag attraktion till eukaryota värdceller, som vanligen är mindre negativt laddade än prokaryoter, vilket tros ligga till grund för denna celltypdiskriminering . Förmågan hos dessa peptider att ackumuleras vid infektionsställen i kombination med deras nästan försumbara cytotoxicitet eller attraktion till värdceller gör dessa peptider attraktiva som målvektorer för PET-avbildning av infektioner.

2. Översikt över antimikrobiella peptider

Antimikrobiella peptider är evolutionärt bevarade biomolekyler som ingår i försvarsmekanismerna hos många organismer , från prokaryoter till flercelliga djur, t.ex. människor . De utgör en del av den första försvarslinjen mot patogena mikrober hos högre djur och många lägre livsformer. De är den enda formen av försvar mot patogena och saprofytiska mikrober . Den selektiva cytotoxiciteten hos dessa peptider, där de angriper de patogena mikroberna och lämnar värdcellerna oskadda, beror på de grundläggande skillnaderna i sammansättning och struktur mellan värdcellerna och de patogena bakterierna och jästcellerna. Trots att vissa antimikrobiella peptider uppvisar immunmodulerande effekter och/eller kemotaktiskt beteende är ett gemensamt drag för dessa antimikrobiella peptider att de är amfipatiska men har en övergripande positiv laddning . Cirka 1 500 antimikrobiella peptider har karakteriserats i ett stort antal organismer och klassificeringen av dessa peptider kan vara komplicerad på grund av den höga graden av sekvenslikhet mellan de olika peptiderna. Man har dock försökt klassificera dem utifrån aminosyrasammansättning och sekundärstrukturer.

Tre stora grupper (tabell 1) har identifierats, nämligen α-helikala peptider, cysteinhaltiga β-bladpeptider och flexibla peptider som är rika på specifika aminosyror som prolin, tryptofan, histidin, arginin och glycin .

2.1. α-helikala antimikrobiella peptider

Omkring 30-50 % av alla antimikrobiella peptider som hittills identifierats och studerats innehåller dominerande α-helikala strukturer. Detta kan bero på den relativa lätthet med vilken dessa peptider syntetiseras kemiskt, vilket möjliggör en omfattande karakterisering i laboratoriet. Dessa peptider består vanligtvis av 12-40 aminosyrarester och innehåller ett överflöd av helixstabiliserande rester som alanin, leucin och lysin, men aldrig cystein. I vattenlösningar är dessa peptider ofta ostrukturerade men antar sina amfipatiska α-helikala konformationer när de är associerade med ett cellmembran eller i en membranmimetisk miljö. Ofta är dessa peptider inte strikt α-helixer och kan innehålla en inre knut .

2.2. β-bladiga antimikrobiella peptider

Den andra stora gruppen antimikrobiella peptider är de som typiskt innehåller två till tio cysteinrester som bildar en till fem disulfidbindningar mellan kedjorna. Denna bindningsinteraktion gör att dessa peptider kan anta β-bladskonformationen. De flesta β-bladiga antimikrobiella peptider ingår i defensinfamiljen och dessa peptider är evolutionärt bevarade hos växter, svampar, insekter, blötdjur och ryggradsdjur. Defensiner består vanligtvis av två till tre antiparallella β-blad som stabiliseras av tre till fyra intramolekylära disulfidbindningar; i vissa fall finns dock ett α-helikalt eller ostrukturerat segment vid N- eller C-terminus. Till skillnad från de α-helikala antimikrobiella peptiderna, som är ostrukturerade i vattenlösningar, bibehåller defensinerna en kompakt globulär struktur under sådana förhållanden . Bortsett från den övergripande likheten i sekundärstrukturen har de flesta α-defensiner från däggdjur ytterligare två gemensamma drag, nämligen en utskjutande slinga som är resultatet av en bevarad arginin/glutamatsaltbrygga och en β-bulge som orsakas av ett bevarat glycin-X-cystein-motiv (X: vilken aminosyra som helst) mellan den första och den andra cysteinresterna .

2.3. Flexibla antimikrobiella peptider som är rika på specifika aminosyror

En minoritet av antimikrobiella peptider innehåller en hög andel av vissa aminosyror såsom prolin, tryptofan, histidin, arginin och glycin. Representativa medlemmar av denna klass är bland annat den tryptofanrika bovina indolicidin och den grisiga tritrpticin, histidinrika humana histatiner och den arginin- och prolinrika grisiga PR-39. På grund av sin ovanliga aminosyrasammansättning har dessa peptider mycket varierande sekundärstrukturer. Den 13-aminosyran indolicidin (ILPWWKWPWWWWPWRR) antar till exempel en i stort sett utsträckt konformation i närvaro av zwitterioniska miceller som består av ämnen som dodecylfosfolin eller anjoniskt natriumdodecylsulfat .

3. Mekanismer för cellspecificitet och selektivitet hos antimikrobiella peptider

Inherenta skillnader i sammansättningen och arkitekturen av mikrobiella respektive värdcellsmembran underlättar selektiviteten hos de antimikrobiella peptiderna. Reglering av peptidernas uttryck eller lokalisering anses också förhindra oönskade interaktioner med sårbara värdceller.

3.1. Målspecificitet och selektiv celltoxicitet

Ett biologiskt membran kan helt enkelt betraktas som en flytande mosaik bestående av fosfolipider varvat med proteiner. I olika organismer kan glycerider och steroler också bidra till den biokemiska arkitekturen och yttopologin hos sådana membran. Det finns dock grundläggande skillnader mellan mikrobiella och animaliska cellmembran som gör det möjligt för antimikrobiella peptider att skilja mellan dessa celler och selektivt rikta in sig på den ena framför den andra, vilket skisseras i figur 1 .

Figur 1

Membranmålsättning av antimikrobiella peptider och grunden för deras selektivitet (anpassad från ).

3.2. Membransammansättning, laddning och hydrofobicitet

Kärnkomponenten i nästan alla naturliga biomembraner är fosfolipiddubbelskiktet. Dessa bilager är amfipatiska, vilket innebär att de har både hydrofoba och hydrofila områden. Eukaryotiska och prokaryotiska cellmembran skiljer sig dock avsevärt åt när det gäller exakt sammansättning och cellenergier (figur 2). Fosfatidylkolin (PC) och dess analoga sfingomyelin (SM) samt fosfatidyletanolamin (PE) har ingen laddning under fysiologiska förhållanden . Kolesterol och andra steroler, t.ex. ergosterol, som förekommer rikligt i eukaryotiska membran, men mycket sällan i prokaryotiska membran, är också i allmänhet neutralt laddade (figur 2) . Hydroxylerade fosfolipider som fosfatidylglycerol (PG), kardiolipin (CL) och fosfatidylserin (PS) har en negativ nettoladdning under fysiologiska förhållanden. Man kan se hur membranets laddning huvudsakligen beror på förhållandet och placeringen av de olika fosfolipiderna, där cellmembran som huvudsakligen består av PG, CL och PS, vilket är fallet i de flesta patogena bakterier, är mycket elektronegativa, medan de membran som är rika på PC, PE eller SP tenderar att ha en neutral nettoladdning, vilket är fallet i däggdjurscellernas cellmembran .

Figur 2

Gemensam lipidstruktur i mikrobiella och mänskliga cytoplasmiska membran. Cytoplasmiska membran från bakteriella (Escherichia coli, Staphylococcus aureus eller Bacillus subtilis) och svampiga (Candida albicans) patogener jämförs med den mänskliga erytrocyten när det gäller relativ sammansättning och fördelning mellan inre och yttre membranblad. Membranbeståndsdelar från anjoniska (vänster) till neutrala (höger) är CL, PG, PE, PC, SM och steroler (kolesterol eller ergosterol, ST). Observera att den markanta skillnaden mellan mikrobiella patogener och mänskliga erytrocyter ligger i fosfolipidsammansättningen och asymmetrin. Dessa skillnader tros förklara den selektiva antimikrobiella peptidaffiniteten för mikrobiella celler jämfört med värdceller i den mån den finns för en viss antimikrobiell peptid. Nycklar: öppen, E. coli; horisontell skraffering, S. aureus; skuggad, B. subtilis; rutig, C. albicans; heldragen, mänsklig erytrocyt (anpassad från ).

3.3. Membranasymmetri

Och även om cellmembranen varken är symmetriska eller statiska kan skillnaderna mellan däggdjurs och mikrobiella fosfolipidbilayers tjäna som potentiella mål för antimikrobiella peptider. I vissa celler, som t.ex. den bovina erytrocyten, finns endast 2 % av det totala PE-innehållet på det yttre membranbladet . Skillnader i membransymmetri, mättnad av fosfolipidbilayers och sammansättningens stökiometri kommer att påverka membranets fluiditet och fasövergång. På liknande sätt kan också laddningen av de inre och yttre membranbladen i det cellulära dubbelskiktet vara olika .

3.4. Mikrobiella ligander och receptorer som mål för antimikrobiella peptider

Experiment har visat att D- och L-aminosyraversioner av antimikrobiella peptider uppvisar liknande bindningsaffiniteter till målceller, vilket tyder på att stereospecifika receptorer inte är inblandade i målinriktningen för patogena celler . Flera studier tycks dock motbevisa detta och tyder på att vissa proteiner i mikrobiella cellmembran kan fungera som bindningsmål för vissa klasser av antimikrobiella peptider, t.ex. histatiner. Detta skulle stödja slutsatsen att histadiner är involverade i lokala försvarsmekanismer mot vissa typer av patogener och har återfunnits i tand- och hudsår. Vissa forskare hävdar också att anjoniska komponenter i cellmembranen, t.ex. CL, PG eller lipopolysackarid (LPS), kan fungera som pseudoreceptorer och möjliggöra den initiala interaktionen mellan den antimikrobiella peptiden och den mikrobiella cellens måltavla. Antimikrobiella bindningsreceptorer kan därför vara en alternativ väg för AMP:s interaktion med det bakteriella cellhöljet.

3.5. Transmembranpotential

Transmembranpotentialen är ytterligare ett sätt på vilket mikrobiella och däggdjursceller skiljer sig åt och det är i den laddningsseparation som finns mellan de inre och yttre lagren av cytoplasmamembranet. En elektrokemisk gradient, som är resultatet av de olika hastigheterna eller protonutbytet över cellmembranet, kallas transmembranpotential (Δψ). En normal däggdjurscell har en Δψ på mellan -90 och -110 mV. Patogena bakterier uppvisar dock i allmänhet Δψ i intervallet -130 till -150 mV. Denna betydande skillnad i elektrokemisk potential kan vara en annan faktor som gör det möjligt för antimikrobiella peptider att skilja mellan värd- och målceller .

4. Selektiv toxicitet baserad på antimikrobiell peptiddesign

I den vattenhaltiga intercellulära miljön antas många antimikrobiella peptider anta utsträckta eller ostrukturerade konformationer, även om detta kanske inte är fallet om det finns intramolekylära bindningar som garanterar en specifik konformation i en mängd olika miljöer på grund av inducerad styvhet. När den antimikrobiella peptiden binder till cellmembranet hos en patogen mikrob kan den genomgå betydande konformationsförändringar och anta en specifik konformation, t.ex. en α-helix. Studier tyder på att dynamiska och/eller inneboende konformationer hos antimikrobiella peptider påverkar deras selektiva cytotoxicitet . Dessutom kan antimikrobiella peptider genomgå konformationsövergång, självassociation eller oligomerisering i målpatogenens membran, men inte i värdcellens membran för att öka den cellspecifika toxiciteten . Zhang och medarbetare använde syntetiska testpeptider som var enhetligt kationiska men varierade i konformation och inkluderade förlängda, cykliska, α-helikala och β-bladstrukturer. Det fastställdes att alla testpeptider kunde interagera med och penetrera lipidmonolager bestående av PG, en negativt laddad fosfolipid. Det var dock endast de α-helikala och förlängda peptiderna som kunde interagera med det mer neutralt laddade PC-membranet. I samma studie fann man också att β-bladpeptiderna kunde translokera fosfolipider från det inre till det yttre bladet vid koncentrationer som var lägre än de som krävdes för att permeabilisera membranet. På samma sätt visade Kol och medarbetare att peptider med jämförbar konformation, men rika på histidin och lysin och utan tryptofan, också kunde inducera betydande nivåer av fosfolipidtranslokation. Av dessa studier kan man dra slutsatsen att antimikrobiella peptider inte bara interagerar med fosfolipidmembran av endast specifik sammansättning och symmetri, utan att de också kan påverka remodelleringen av membranen i specifika celler.

4.1. In vivo preferentiell affinitet för mikrobiella jämfört med däggdjursceller

Welling och kollegor genomförde ett in vivo-experiment där de testade bindningsaffiniteten hos ett radioaktivt märkt fragment av den katjoniska antimikrobiella ubiquicidinpeptiden -UBI 29-41 för mikrobiella celler jämfört med värdceller. I studien infekterades djuren med Candida albicans, Klebsiella pneumonia eller Staphylococcus aureus. Sterila inflammationer framkallades också i djurens lårmuskler genom injektion av värmedödade mikroorganismer eller renad LPS för att tjäna som kontroller. De radiomärkta peptiderna ackumulerades i betydande utsträckning på de infekterade ställena i förhållande till sterila eller icke-infektiöst inflammerade delar av kroppen. Detta in vivo-experiment visade att peptiderna kunde skilja mellan värd- och mikrobiella celler och även ackumuleras på de infekterade ställena. Genom scintigrafiska mätningar fastställdes att de radiomärkta peptiderna ackumuleras snabbt i infekterade vävnader och att ackumulationen i infekterade vävnader ökar upp till fem gånger mer än i icke-infekterade vävnader. Denna snabba lokalisering tolkades som att peptiderna har en högre eller preferentiell affinitet för målcellsytan i förhållande till värdcellsytan.

4.2. Lokalisering av cytotoxiska antimikrobiella peptider begränsar exponeringen av sårbara värdvävnader

Det är möjligt att värdcellens cytotoxicitet minskas i många flercelliga organismer på grund av att de lokaliseras till vävnader som inte är sårbara för deras cytotoxiska effekter. Hos de flesta djur utsöndras dessa peptider av celler på relativt inerta och robusta ytor såsom tarmens eller lungans epitel, eller hos amfibier på huden. På dessa ställen är det mest troligt att de interagerar med potentiellt skadliga mikrober mest frekvent, och uttrycket av de flesta av de antimikrobiella peptiderna är antingen konstitutivt eller snabbt inducerbart, så att de kan utgöra en del av det första försvaret mot patogener . Ett annat sätt att skydda känsliga värdvävnader från antimikrobiella peptider är att innesluta dem i granuler i fagocyterande leukocyter, som slukar patogener och utsätter dem för dödliga koncentrationer av antimikrobiella peptider och oxidationsmedel. Defensinklassen av antimikrobiella peptider används på detta sätt, eftersom de är några av de mest toxiska och minst selektiva av de värdproducerade antimikrobiella peptiderna. Den svagt sura mikromiljön i det mogna fagolysosomen är också den mest effektiva miljön för defensinerna, eftersom de uppvisar maximal cytotoxicitet under dessa förhållanden.

5. Mekanismer för antimikrobiell peptidverkan

De generellt bevarade strukturerna hos antimikrobiella peptider i ett stort antal organismer ger vissa ledtrådar om deras verkningsmekanismer. De är nästan uteslutande amfipatiska och katjoniska under fysiologiska förhållanden, vilket tros bidra till deras selektivitet i målcellerna. Den idealiska antimikrobiella peptiden bör ha låg cytotoxicitet för värdceller men vara giftig för ett stort antal patogena mikrober. De antimikrobiella bestämningsfaktorerna bör vara lättillgängliga och bör inte vara benägna att ändras eller förändras. I allmänhet har antimikrobiella peptider amfipatiska strukturer som gör att de kan interagera med fosfolipidmembran, strukturer som är nödvändiga för alla patogener . Parametrar som konformation (), hydrofobicitet (), hydrofobt moment (), laddning (), polvinkel () och amfipathicitet () är alla viktiga för antimikrobiella peptiders funktion. Dessutom är alla dessa bestämningsfaktorer inbördes relaterade och ändring av en av dessa egenskaper kommer att leda till ändring av de andra .

5.1. Konformation ()

Och även om antimikrobiella peptider kan hittas i ett stort antal värdorganismer och har olika aminosyresekvenser kan de klassificeras i några få diskreta grupper baserat på deras sekundärstruktur. De två största grupperna omfattar peptider som har en β-bladig eller α-helikal sekundärstruktur. Majoriteten av de återstående antimikrobiella peptiderna är sådana som har en ovanligt hög andel av en eller flera aminosyror som tryptofan eller prolin och arginin. De α-helikala peptiderna finns ofta i den intercellulära vätskan hos insekter och amfibier och antar i allmänhet en ostrukturerad eller utsträckt konformation i vattenlösning och antar sin spiralformade struktur först vid interaktion med ett fosfolipidmembran . Anledningen till detta är att den intramolekylära vätebindning som krävs för en α-helisk konformation störs i ett polärt lösningsmedel som vatten. I ett membran skyddas de polära vätebindningsgrupperna från den lipofila (apolära) membranmiljön genom α-helisk bildning. Helixkonformationen exponerar också de apolära sidokedjorna för den neutrala lipidmiljön inne i membranet. Även om den primära strukturen hos β-bladklassen av antimikrobiella peptider uppvisar en viss grad av olikhet i aminosyrasekvensen, har de alla gemensamma drag när det gäller amfipatisk struktur, och besitter distinkta hydrofila och hydrofoba domäner .

5.2. Laddning ()

De flesta av de antimikrobiella peptiderna är överlag katjoniska och har laddningar som sträcker sig från +2 till +9, och många har högt definierade negativt laddade domäner. Denna positiva laddning är viktig för den initiala attraktionen till och interaktionen med de anjoniska cellmembranen hos bakterier och andra patogena mikroorganismer. Värdens relativt sett mindre anjoniska membran drar inte heller elektrostatiskt till sig de antimikrobiella peptiderna och kan ge peptiderna en viss målcellsselektivitet. Patogena bakterier är i allmänhet rika på sura fosfolipider som CL, PG och PS. Dessutom ger teikos- och teichuronsyrorna i cellväggarna hos grampositiva bakterier och LPS hos gramnegativa bakterier bakterier ytterligare elektronegativ laddning till bakteriecellytan. Det har fastställts att bakteriernas Δψ vanligtvis är 50 % högre än däggdjurscellernas, och det har föreslagits att antimikrobiella peptider kan koncentreras på ytan av patogena mikrober på ett elektroforetiskt sätt. Även om många studier har kunnat korrelera kationiciteten hos antimikrobiella peptider med deras antimikrobiella aktivitet finns det inget strikt linjärt samband. Dathe och medarbetare visade i studier med analoger av magainin att en ökning av kationiciteten från +3 till +5 resulterade i en ökning av den antibakteriella aktiviteten mot både grampositiva och gramnegativa arter. De noterade dock att det fanns en gräns för kationiciteten, efter vilken varje ökning av den positiva laddningen inte längre ökar den antibakteriella aktiviteten. Man tror att denna minskning av den antibakteriella aktiviteten kan bero på att peptiderna binder så starkt till den negativt laddade fosfolipidhuvudgruppen att translokation av peptiden in i cellen var omöjlig .

5.3. Amphipathicity () och Hydrophobic Moment ()

Amphipathicity är en nästan universell egenskap bland antimikrobiella peptider och uppnås genom ett antal olika peptidstrukturer. Den amfipatiska α-helixen är en av de vanligaste och enklaste av dessa egenskaper. Genom att alternera anjoniska och katjoniska aminosyrarester var tredje eller fjärde position kan peptiden anta en sekundärstruktur som möjliggör optimal elektrostatisk interaktion med amfipatiska fosfolipidmembran (figur 3). Denna egenskap gör att peptiden kan utöva cytotoxisk aktivitet mot inte bara negativt laddade cellmembran utan även mot dem med neutral laddning eller amfipatisk natur .

Figur 3

Statistisk analys av restfördelningen i de 20-residuerna av N-terminalsträckan α-helikala AMP:er från naturliga källor. En grafisk representation av frekvensen av olika typer av rester vid varje position på en projektion av ett spiralhjul visas. Den ojämna fördelningen av hydrofoba och laddade peptider bidrar till peptidens amfipatiska natur (anpassad från Tossi et al. ).

En peptids amfipaticitet kan beskrivas av dess hydrofoba moment (), som kan beräknas som vektorsumman av de enskilda aminosyraminosyrornas hydrofobicitet, normaliserad till en ideal helix. En ökning av det hydrofoba momentet korrelerar med ökad permeabilisering av målcellsmembranet. Detta är särskilt viktigt vid interaktioner med lipidmembran som är neutralt laddade, där det är osannolikt att laddningsfaktorer kan åstadkomma den nödvändiga attraktionen till och interaktionen med målcellsmembranet . I likhet med de α-helikala antimikrobiella peptiderna uppvisar även de β-bladiga värdförsvarspeptiderna amfipathicitet. Detta visar sig som ett varierande antal β-strängar som organiseras för att bilda hydrofoba och hydrofila ytor. β-strängarna, som ofta är antiparallella, stabiliseras av disulfidbindningar med regelbundet avstånd eller genom cyklisering av peptidstommen. Denna intramolekylära bindning gör det möjligt för β-bladiga antimikrobiella peptider att bibehålla en styv konformation även i vattenhaltig extracellulär vätska och underlättar också multimerisering, eftersom de hydrofoba ytorna kommer att gruppera sig tillsammans för att undvika exponering för den vattenhaltiga miljön. Även om de exakta mekanismerna genom vilka amfipatiska antimikrobiella peptider åstadkommer membranbrytning i målcellsmembranen för närvarande är obestämda, till stor del på grund av att peptidernas exakta konformation i membranen inte är känd, har studier visat att segregerad amfipathicitet i både α-helikala och β-bladiga antimikrobiella peptider har en djupgående effekt på peptidbrytning av naturliga biomembraner .

5.4. Hydrofobicitet ()

En peptids hydrofobicitet kan definieras som den procentuella andelen hydrofoba aminosyrarester som utgör dess primära struktur. För de flesta antimikrobiella peptider är hydrofobiniteten omkring 50 % och är väsentlig för peptidens funktion eftersom den gör det möjligt för peptiden att interagera med och tränga in i fosfolipidbilagret. Även om en viss hydrofobicitet är nödvändig för att den antimikrobiella peptiden ska fungera, ökar överdriven hydrofobicitet dess sannolikhet att förstöra värdcellerna och minskar dess specificitet för mikrobiella celler . Wieprecht och medarbetare studerade förhållandet mellan peptidernas hydrofobicitet och deras förmåga att permeabilisera biomembraner. Genom att använda magaininanaloger som antimikrobiella modellpeptider kunde de hålla faktorer som hydrofobt moment, helicitet och laddning nästan konstanta, samtidigt som de producerade analoger med varierande hydrofobicitet. Deras experiment visade att hydrofobiciteten hade liten eller ingen effekt på peptidernas förmåga att binda till eller permeabilisera membranen när den uteslutande bestod av PG. I membran som bestod av ett 3:1-förhållande mellan PC och PG hade dock peptiderna med den högsta hydrofobiciteten en cirka 60 gånger högre permeabiliserande förmåga än den minst hydrofoba peptiden, och i membran som endast bestod av PC fanns det en 300-faldig skillnad.

5.5. Polarvinkel ()

En peptids polarvinkel avser det relativa förhållandet mellan polära och opolära facetter av peptiden som är konform med en amfipatisk helix. En spiralformad peptid med en fasett som helt består av polära aminosyrarester och en annan fasett som helt består av opolära rester skulle ha en polär vinkel på 180°. Mindre segregering mellan domänerna, eller ett överflöd av hydrofoba rester, skulle leda till en lägre polvinkel. Studier som Uematsu och Matsuzaki genomfört på både syntetiska och naturligt förekommande peptider har visat att en lägre polvinkel och därmed en mer hydrofob fasett är mer gynnsam för membranpermeabilisering. Polarvinkeln har också korrelerats med stabiliteten hos peptidinducerade porer i biomembraner. De visade också att antimikrobiella peptider med mindre polära vinklar kunde inducera högre grad av membranpermeabilisering och translokation med högre hastighet än peptider med större polära vinklar. De porer som bildades av peptider med mindre polära vinklar var dock mindre stabila än de som bildades av peptider med större polära vinklar. Hydrofoba och hydrofila egenskaper hos antimikrobiella peptider kan anses spela viktiga roller i interaktionen med och permeabiliseringen av fosfolipidcellmembran .

5.6. Gemensamma strukturella egenskaper hos antimikrobiella peptider

Och även om det finns ett stort antal olika antimikrobiella peptider i naturen, har man noterat att viktiga egenskaper och sekundärstrukturer bevaras. Extrema egenskaper som amfipathicitet, laddning, hydrofobt moment eller polär vinkel är inte fördelaktiga eftersom de tenderar att äventyra antingen den antimikrobiella aktiviteten eller leda till ökad cytotoxicitet hos värdcellerna. Den minsta laddning som peptider kan ha för att utöva någon form av antimikrobiell aktivitet verkar vara +2. Denna minsta katjonicitet är viktig eftersom den möjliggör den inledande elektrostatiska attraktionen till bakteriemembranet, som är negativt laddat. Det gör det också möjligt att förflytta andra katjoner som redan kan vara bundna till målcellsmembranen och förflyttning in i det inre av membranets tvåskikt. På samma sätt bör peptidens hydrofobicitet vara måttlig, eftersom mycket hydrofoba antimikrobiella peptider skulle rikta in sig på membran med en nettoneutral laddning, t.ex. värdcellerna, vilket leder till minskad selektivitet och skador på värdorganismen. Det kan konstateras att den selektiva inriktningen på patogena mikrober till stor del beror på en balans mellan elektronegativitet och hydrofobicitet hos de antimikrobiella peptiderna .

6. Initiala interaktioner med målcellsmembranen

Den initiala interaktionen mellan den antimikrobiella peptiden och cellens fosfolipidmembran är viktig, eftersom den bestämmer målcellsselektiviteten och även påverkar eventuella efterföljande interaktioner med målcellen. De inledande interaktionerna bestäms till stor del av fysiska och kemiska egenskaper hos både den antimikrobiella peptiden och målcellens membran.

6.1. Elektrostatiska interaktioner

Elektrostatiska interaktioner anses allmänt vara ansvariga för den initiala inriktningen på den mikrobiella cellen. I en studie av Matsuzaki korrelerades den antimikrobiella peptidens katjonicitet med membranbindningsförmågan, och det faktum att katjonicitet är en bevarad egenskap hos nästan alla antimikrobiella peptider i ett brett spektrum av organismer stöder ytterligare detta argument. Elektrostatiska krafter verkar på långa avstånd, och det stora antalet lysin- och argininrester i antimikrobiella peptider, som attraheras av de negativt laddade fosfatgrupperna i biomembraner, ger ytterligare trovärdighet åt teorin att det är dessa interaktioner som står för den initiala attraktionen till målcellsmembranen . I gramnegativa bakterier tror man att de antimikrobiella peptiderna tränger undan katjoner som normalt är associerade med LPS, eftersom antimikrobiella peptider har en bindningsaffinitet för LPS som är ungefär tre storleksordningar större än de divalenta katjoner som normalt är associerade med denna grupp. Bakteriestammar där LPS i hög grad är substituerad med 4-amino-4-deoxy-L-arabinos eller är starkt acylerad uppvisar större motståndskraft mot positivt laddade antimikrobiella peptider, vilket ger ytterligare trovärdighet åt teorin om att elektrostatisk laddning är viktig för interaktionen med målcellsmembranen . Grampositiva bakterier saknar LPS eller yttre cellmembran, men de har en tjock cellvägg som består av teichuron- eller teikosyrapolymerer. Dessa starkt anjoniska strukturer är idealiska mål för katjoniska antimikrobiella peptider. Stammar av Staphylococcus aureus där teichonsyrorna har modifierats, vilket resulterar i ökad anjonisk laddning, är mer mottagliga för katjoniska antimikrobiella peptider . Det faktum att de flesta bakterier har en stark elektrokemisk gradient (Δψ) i förhållande till däggdjursceller anses också öka målselektiviteten hos antimikrobiella peptider .

6.2. Receptor-Ligand-interaktioner med membranet

En del studier har visat att både naturligt förekommande och syntetiska peptider interagerar lika bra med membranet oavsett om D-aminosyror eller L-aminosyror används . Detta skulle tyda på att interaktioner med biomembran inte är beroende av receptor-ligandmekanismer; andra studier har dock visat att detta kanske inte är fallet med alla antimikrobiella peptider. Nisin, en naturligt förekommande cyklisk peptid med kraftfull antimikrobiell verkan, har visat sig binda specifikt till bakteriernas membranbundna lipid II . På samma sätt har tachyplesin visat sig ha en specifik affinitet för LPS. Uppgifterna från dessa studier tyder på att receptormedierad bindning är viktig för cellmålsättning i ett litet antal antimikrobiella peptider.

7. Händelser som följer på den initiala membranbindningen

Det är vanligen enklare att experimentellt bestämma peptiders initiala attraktion till och interaktion med cellmembran än att bestämma de interaktioner som följer efter detta. En rad olika metoder, t.ex. cirkulär dikroism , röntgenkristallografi, kärnmagnetisk resonans , vätskekromatografi i omvänd fas och högpresterande vätskekromatografi och ytplasmonresonans , har använts för att belysa interaktioner mellan peptider och membraner. Man menar dock att den antimikrobiella effekten och mekanismerna är extremt känsliga för förhållanden som pH, osmotisk styrka, lösningens viskositet och temperatur, så alla data som erhålls med ovannämnda tekniker måste betraktas med hänsyn till dessa förhållanden. Efter den inledande membranbindningen tränger antimikrobiella peptider in i det yttre fosfolipidmembranet, en fas som kallas tröskelkoncentration, och kan på så sätt utöva sina cytotoxiska effekter i cellens inre. För att peptiderna ska kunna tränga in i cellen krävs att ett minsta antal, eller en tröskelkoncentration, av antimikrobiella peptider ackumuleras på lipidmembranets yta. Denna händelse kan påverkas av andra faktorer än koncentrationen, t.ex. peptidernas förmåga att multimerisera och även egenskaper hos själva fosfolipidmembranet, t.ex. dess lipidsammansättning, huvudgruppstorlek och fluiditet . Bilagerets transmembranpotential kan också påverka hur peptiden kommer in i membranet, eftersom en mycket negativ transmembranpotential underlättar porbildning genom att den positivt laddade peptiden dras in i membranet .

8. Förändringar i peptidkonformationen vid interaktion med membranet

Många antimikrobiella peptider, särskilt de med α-helikala sekundärstrukturer, genomgår en betydande konformationsomläggning när de kommer in i den opolära miljön i det inre membranet. De α-helikala antimikrobiella peptiderna är normalt oordnade i den extracellulära miljön och uppvisar slumpmässiga spiral- eller förlängda strukturer, men anpassar sig snabbt till en strukturerad α-helix när de associeras med biomembranet . Vissa antimikrobiella peptider kan endast genomgå denna konformationsförändring i samband med ett negativt laddat bilagermembran. Detta kan bero på hur lipiderna är arrangerade i sådana membran, där fosfolipidhuvudgrupperna inducerar optimal periodicitet hos de katjoniska aminosyraresterna i peptiden, vilket i sin tur främjar korrekt konformation till den spiralformade sekundärstrukturen . Det har föreslagits att denna egenskap garanterar att de antimikrobiella peptiderna endast ”aktiveras” till den cytotoxiska formen i närvaro av målcellsmembranet, i detta fall en negativt laddad bakterie, och att de inte urskillningslöst skadar värdceller som inte är målceller . De intramolekylära disulfidbindningar som finns i β-bladpeptider säkerställer att de behåller sin sekundärstruktur även i vattenmiljöer, och de genomgår därför inte de drastiska konformationsomläggningar som ses i α-helikala peptider, även om kvartära peptidstrukturer kan disassocieras när de tränger in i membranen, och detta skulle kunna underlätta selektiv toxicitet . Efter den första interaktionen med cellmembranet kan många peptider genomgå självassociation, vilket i kombination med lipid-peptidinteraktioner kan leda till att komplexa strukturer skapas som bidrar till peptidernas cytotoxiska effekter. Den antimikrobiella peptidens aminosyrasekvens och konformation i monomerform kommer att diktera dess förmåga att bilda dessa strukturer. I amfipatiska peptider kan de hydrofoba domänerna interagera med den opolära hydrofoba kärnan i lipidbilagan och därigenom driva in peptiden djupare in i membranet. Alternativt kan de också interagera med de hydrofoba fasaderna hos andra peptider, vilket främjar multimerisering i ett försök att undvika att dessa fasader exponeras för vattenmiljön. Denna typ av multimerisering och interaktion med insidan av lipiddubbelskiktet kan leda till att peptidförsedda porer eller kanaler bildas i biomembranen, vilket leder till förlust av integritet och permeabilisering. Eftersom biomembraner har mycket varierande sammansättning och struktur är det möjligt att en peptid kan uppträda på ett antal olika sätt när den associeras med olika cellmembran . Flera modeller har föreslagits för att beskriva den porbildning som observerats i membran som exponerats för antimikrobiella peptider.

8.1. Tunnestavmodellen

Denna mekanism för bildning av membranporer har fått sitt namn eftersom de transmembranpeptider, eller peptidkomplex, som kantar kanalen är placerade i en tunnliknande ring, där peptiderna bildar transmembranstänger. Amphipatiska peptider är orienterade så att de hydrofoba domänerna interagerar med de opolära kolvätehalarna som finns i lipidmembranets inre, medan de hydrofila domänerna är orienterade så att de vetter mot porens vattenkanal och bildar dess beklädnad . Monomerpeptiderna ansamlas till en början vid cellytan och genomgår konformativa omarrangemang när de kommer i kontakt med membranet (figur 4). Detta tros tvinga fosfolipidhuvudgrupperna åt sidan och leda till att membranet tunnas ut. Detta gör det möjligt för den hydrofoba delen av peptiden att komma in i membranets opolära inre, medan de katjoniska aminosyrorna i den antimikrobiella peptiden interagerar med de negativt laddade huvudgrupperna. När tröskelkoncentrationen av peptiderna nås kan peptidmonomerer aggregera och bilda multimerer, vilket ytterligare tvingar in peptiderna i membranets hydrofoba centrum, eftersom aggregeringen förhindrar att de hydrofila delarna av peptiden exponeras för de hydrofoba delarna av det inre membranet (figur 4 a)). När allt fler peptidmonomerer aggregeras utvidgas porerna i membranet .

(a)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

Figur 4

Översikt över möjliga interaktionsmekanismer efter peptidinteraktion med bakteriens cellmembran , Det vill säga (a) tunnpulpetmodell (porbildning), (b) toroidalmodell (porbildning) och (c) mattmodell (membranupplösning). Rödfärgade peptidområden: hydrofila; blåfärgade peptidområden: hydrofoba.

8.2. Toroidalporen eller maskhålsmekanismen

Denna mekanism för porbildning har studerats väl med hjälp av de α-helikala magaininpeptiderna. Vid kontakt med det laddade cellmembranet antar de desorganiserade peptiderna den α-helikala strukturen. Initialt orienterar sig spiralerna så att de är parallella med membranets yta. De polära fosfolipidhuvudgrupperna förskjuts och membranets yta försvagas, vilket resulterar i en positiv krökningsspänning i membranet. Till följd av denna påfrestning och förtunnning destabiliseras membranet och blir mer mottagligt för ytterligare peptidinteraktioner. När en tröskelkoncentration av peptider har uppnåtts omorienterar sig peptiderna så att de står vinkelrätt mot membranet och börjar multimeriseras så att de hydrofila delarna av peptiderna inte kommer i kontakt med de hydrofoba delarna av membranet (figur 4 b). Den nybildade toroidala porerna är instabila och vid upplösningen tvingas en del av peptiderna in i cellmembranets inre blad. Man tror därför att upplösningssteget i dessa övergående porer är viktigt eftersom det gör det möjligt för peptiderna att translokeras till det intracellulära utrymmet, där de kan verka på andra måltavlor .

8.3. Mattmodellen

Mattmodellen för membranpermeabilisering bygger på diffus verkan av många monomerpeptider på cellmembranet. När tillräckligt höga koncentrationer av vissa antimikrobiella peptider finns på cellmembranet förskjuts en del av membranets fosfolipider, vilket leder till förändringar av membranets fluiditet eller medför svagheter i membranets barriäregenskaper. Den kumulativa effekten av dessa förskjutningar är att membranet försvagas och förlorar sin integritet. Som tidigare antytts är det elektrostatiska dragningskrafter som gör att de antimikrobiella peptiderna först attraheras av membranen. Inga specifika kanaler eller porer bildas, och man tror att permeabilisering och förlust av membranintegritet beror på de ogynnsamma energetiska egenskaper som dispersionen av fosfolipiderna ger upphov till (figur 4(c)) .

9. Bakterieinfektioners inverkan på människors hälsa och traditionella metoder för infektionsdiagnostik

Det uppskattas att upp till 85 % av de kritiskt sjuka patienterna på sjukhus har feber men visar inga andra yttre tecken på infektion. Eftersom långvariga feberepisoder kan vara dödliga är det viktigt att en underliggande infektion upptäcks så snart som möjligt, så att rätt behandling kan inledas. Traditionella metoder för att ställa diagnos kan omfatta undersökning av vävnadsbiopsier och försök att odla patogener, en ofta felaktig och tidskrävande uppgift som kan fördröja behandlingsstarten. Diagnostiska avbildningsförfaranden används också och kan omfatta datortomografi (CT) eller magnetisk resonanstomografi (MRI). Dessa tekniker kan dock i allmänhet inte upptäcka infektioner i ett tidigt skede eftersom de kräver morfologiska förändringar i vävnaderna, något som vanligtvis förknippas med avancerade infektioner . Dessutom är de i allmänhet inriktade på specifika delar av kroppen, vilket innebär att det är möjligt att infektionen missas eller att den verkliga omfattningen av infektionen inte upptäcks. Gallium-radiolabelade antikroppar eller -immunoglobuliner eller komplex, t.ex. 67/68Ga-citrat, kan användas för att belysa områden där leukocyttrafik sker med hjälp av SPECT- eller PET-scanning. Dessa tekniker kan dock inte definitivt skilja mellan infekterade vävnader och vävnader som är inflammerade men sterila, eftersom leukocyttrafik förekommer i båda fallen . Med tanke på den höga specifika affiniteten hos naturligt förekommande antimikrobiella peptider för patogena bakterier eller svampar, i motsats till värdorganismens celler, har man tänkt sig att de skulle kunna användas för att underlätta upplösningen av diagnostiska avbildningsprocesser.

9.1. Användning av antimikrobiella peptider som radiofarmaka

I princip bör en radiofarmaka som används för avbildning av infektioner möjliggöra snabb upptäckt av bakterier och snabb eliminering från icke-infekterade områden. Det bör också uppvisa ett högt och specifikt upptag på den infekterade platsen, med minimala mängder som ackumuleras i steril eller icke-målvävnad. Föreningen bör också ha låg toxicitet och inte framkalla något immunsvar. Mycket viktigt är att den ska kunna skilja mellan en steril och en infekterad inflammation . Eftersom antimikrobiella peptider i allmänhet uppvisar ett brett spektrum av aktivitet mot ett stort antal patogena jästsvampar och bakterier är de idealiska målmolekyler för infektioner där den misstänkta patogenen inte har identifierats. Dessutom kräver deras verkningsmekanism att de fysiskt associerar sig med patogenen, vilket innebär att de skulle kunna föra en gamma- eller positronemitterande källa, t.ex. technetium-99m (99mTc) eller gallium-67 (67Ga), till den exakta platsen för infektionen. Deras bristande affinitet för värdorganismens celler innebär också att de inte skulle ackumuleras i sterila inflammerade vävnader. Radiomärkta antimikrobiella peptider är också attraktiva eftersom de snabbt försvinner från cirkulationssystemet och utsöndras av kroppen. Dessutom kan de tränga in i extravaskulära vävnader och därigenom ackumuleras på infekterade platser på mycket kort tid. I idealfallet bör förfarandet för radiomärkning av en målmolekyl möjliggöra att en radionuklid fästs fast vid molekylen utan att det påverkar dess målförmåga eller molekylens farmakokinetik negativt. Märkningsmetoderna kan vara direkta eller indirekta enligt följande: (i) En direkt märkning (figur 5 a) innebär att radionukliden inkorporeras i målmolekylen via en kovalent bindning. När det gäller peptidmålmolekyler kan en kovalent bindning bildas mellan radionukliden och en lämplig fri amidrest av Lys och Arg . Användning av tyrosinrester kan orsaka problem i samband med märkning, bland annat ospecifik eller dålig bindning, komplexets instabilitet in vivo och oönskade förändringar av peptidstrukturen, t.ex. klyvning av interna disulfidbindningar, vilket kan förändra dess funktion.(ii) En strategi för indirekt märkning kan användas genom tillsats av kelatbildande ämnen till målmolekylen (figur 5 b) . Bifunktionella kelater har använts för att märka peptidbärarmolekyler med radionuklider. Chelatbildaren kan laddas med radionukliden innan den binds till bärarmolekylen, eller så kan den först bindas till bärarmolekylen och sedan exponeras för nukliden för chelatbildning i en process som kallas post-märkning. Postmärkning har den fördelen att bärarmolekylen kan lagras under lång tid tills den behövs, och radionukliden, som sönderfaller, kan tillsättas strax innan det radioaktiva läkemedlet administreras. Detta gynnar kommersialiseringen av bärarmolekylen och gör tekniken lättare att använda på sjukhus och kliniker.

(a)

(b)

(a)
(b)

Figur 5

Ansatser för radiomärkning av peptider. Den direkta metoden (a) där radionukliderna är kovalent bundna till peptiden och den indirekta metoden (b) där radionukliderna är bundna till målpeptiderna med hjälp av bifunktionella kelatorer .

9.2. Ubiquicidin är ett exempel på ett tillvägagångssätt för radiofarmaka som härrör från antimikrobiella peptider

Den antimikrobiella peptiden ubiquicidin (UBI), som består av 59 aminosyrarester, är en peptid på 6,7 kDa som först upptäcktes i cytosoliska extrakt från murina makrofager (figur 6). Denna peptid visade sig ha antimikrobiella effekter mot Salmonella typhimurium och Listeria monocytogenes. Den hittades därefter i ett stort antal andra organismer, inklusive människor. Eftersom ubiquicidin förekommer naturligt hos människan är den inte en immunogen enhet, vilket gör den lämplig för administrering som ett diagnostiskt verktyg. Den har också hög affinitet för bakterieceller men riktar sig inte mot däggdjursceller, vilket gör den icke-toxisk för patienten och selektiv eftersom det är osannolikt att den ackumuleras på sterila inflammationsställen . Flera studier har utförts på fragment av ubiquicidin både in vitro och in vivo för att bedöma dess förmåga att binda till bakterieceller.

Figur 6

Primärstruktur för ubiquicidin som ursprungligen rapporterades av Hiemstra och medarbetare .

Welling och medarbetare utvärderade hela den märkta ubiquicidin och olika radiomärkta fragment av peptiden, inklusive UBI1-18 (KVHGSLARAGKVRGQTPK), UBI29-41 (TGRAKRRMQYNRR), UBI18-29 (KVAKQEKKKKKT), UBI18-35 (KVAKQEKKKKKTGRAKRR), UBI31-38 (RAKRRMQY) och UBI22-35 (QEKKKKKTGRAKRR) för deras förmåga att binda till bakterieceller och/eller mänskliga leukocyter in vitro. De fann att ubiquicidinpeptidfragmenten UBI 18-35, UBI 31-38, UBI 22-35 och UBI 29-41 uppvisade betydligt högre bindningsaffiniteter för bakterieceller än för mänskliga leukocyter. De in vivo-resultat som erhölls genom scintigrafi av experimentellt infekterade möss efter intravenös administrering av de olika radiomärkta peptiderna visade att peptiderna UBI18-35 och UBI29-41 verkade vara de mest lovande kandidaterna. Efter en postadministrationsperiod på 2 timmar och 24 timmar var bindningsförhållandet mellan leukocyter och bakterier 1 : 36, 1 : 166 och 1 : 73, 1 : 220 för UBI18-35 respektive UBI29-41. Forskarna drog slutsatsen att UBI29-41 och UBI18-35 var de optimala peptiderna för att skilja infektioner från sterila inflammationer.

9.3. Kliniska prövningar på människor av -Ubiquicidin 29-41 som infektionsavbildande medel

Akhtar och medarbetare undersökte effekten av -UBI 29-41 som infektionsavbildande medel hos arton patienter med misstänkta infektioner i proteser eller mjukvävnad. Genom att använda scintigrafi för att övervaka den radiomärkta peptiden kunde forskarna övervaka förhållandet mellan mål och icke-mål (T/NT) för bildbildningsmedlet. Infektionen hos patienterna bekräftades genom odling av bakterier från den infekterade platsen, eller när detta inte var möjligt genom fullständig blodundersökning. I studien konstaterades att alla patienter tolererade den radiomärkta peptiden väl, inga betydande förändringar av deras vitala tecken noterades och inga relaterade biverkningar sågs efter administreringen av -UBI 29-41. T/NT-förhållandet bestämdes vid 30, 60 och 120 minuter, där skanningen efter 30 minuter visade det högsta genomsnittliga T/NT-värdet. Den främre helkroppsskanningen (figur 7) gav information om spårämnets biodistribution och dess elimineringsvägar i kroppen. Man kan se att spårämnet huvudsakligen elimineras via urinsystemet och att en viss perfusionsberoende leveraktivitet noterades. Det bildgivande medlet visade sig ha en känslighet på 100 % och en specificitet på 80 %. Forskarna drog slutsatsen att -UBI 29-41 hade ett positivt prediktivt värde på 92,9 %, ett negativt prediktivt värde på 100 % och en övergripande diagnostisk noggrannhet på 94,4 %. Den radiomärkta peptiden visade effekt mot en rad olika bakterier, inklusive Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus och Streptococcus pyogenes. Forskarna ansåg att -UBI 29-41 är ett mycket känsligt och specifikt bildgivande medel för att upptäcka infektioner i mjukvävnad och ben hos människor.

Figur 7

Anteriör helkroppsbild tagen 30 minuter efter injektion av spårämne som visar njurar (streckad pil), lever (heldragen pil) och urinblåsa (bollpilar) (anpassat från ).

10. Diskussion och perspektiv

Användningen av nuklearmedicinska modaliteter som SPECT eller PET gör det möjligt för kliniker att göra icke-invasiva helkroppsundersökningar av fysiologiska processer, t.ex. dolda infektioner på cellulär nivå, och förutom att vara ett användbart redskap för fysiologisk och medicinsk forskning, kan dessa mycket känsliga tekniker upptäcka sjukdomar utan, eller före, anatomiska förändringar (feber av okänt ursprung). Hittills har radiomärkta leukocyter, monoklonala antikroppar mot cytokiner/leukocyter och spårämnen som är kopplade till specifika molekylära mål eller metaboliska processer använts . Radiomärkta leukocyter har ett spektrum av begränsningar (förändring av leukocyternas funktion på grund av strålningsskador), dvs. de har en besvärlig farmakokinetik och är dessutom relativt ospecifika. Dessutom kan märkta leukocyter och spårämnen med hög molekylvikt, t.ex. antikroppar, ha begränsad penetration i infekterade eller sjuka vävnader. I den sistnämnda rapporten presenteras en översikt som klargör AMP:s utbredda potential att utvärderas som bildsonder, med tanke på deras unika selektiva inblandning i bakterier. En enkel litteratursökning med sökning på ”antimicrobial peptides” resulterade i ca 6 000 publikationer. Så snart sökningen kombineras med termen ”imaging” resulterade den dock i endast 63 publikationer, varav endast 17 har klinisk relevans (-UBI-29-41 relaterade studier/försök). Detta är en viktig observation eftersom detta ubiquicidinfragment kan utgöra en nästan perfekt bärare för målmolekyler för infektionsdetektion. I de kliniska prövningar på människor som Akhtar och medarbetare genomförde med -UBI 29-41 hittades inga tecken på cytotoxicitet hos patienterna, vilket stöder resultaten i den aktuella studien. Även om det konstaterades att förhållandet mellan signal och brus är lågt har det använts framgångsrikt i tio år nu. År 2010 motiverade de Murphy et al. de hittillsvarande kliniska prövningarna med avseende på deras diagnostiska värde under den inledande sjuårsperioden. -Metaanalysen av UBI 29-41 gav höga värden för sensitivitet (96,3 %), specificitet (94,1 %) och noggrannhet (95,3 %) med höga positiva prediktiva (95,1 %) och negativa prediktiva värden (95,5 %) . Från 2011 och framåt har ytterligare sju kliniska studier (med sammanlagt över 160 patienter) genomförts med framgång och alla har visat att -UBI29-41-SPECT är ett mycket exakt och selektivt diagnostiskt verktyg för beninfektioner i diabetiska fötter, höftproteser eller andra implantatrelaterade infektioner; dessutom upptäcker den även osteomyelit och infektiös endokardit . Det kan konstateras att detta tillämpningsområde för -UBI29-41-avbildning kommer att fortsätta att växa, även på grund av att forskning med andra alternativa radioisotoper än -UBI29-41 kan ge upphov till en ny grupp radiofarmaceutiska medel för medicinsk diagnostisk avbildning med hjälp av klinisk PET/CT eller PET/MRI i framtiden. Nya radioisotoper som 68Ga, 82Rb eller 62Cu kan produceras på begäran från en radioisotopgenerator utan behov av en cyklotron på plats och kan användas som radionuklider för PET. 68Ga har väckt intresse som positronavsändare för molekylär avbildning på grund av några av de fördelar som den erbjuder som spårämne. Den har en radioaktiv halveringstid på 67,71 minuter, vilket gör den kompatibel med biokinetiken hos de flesta radiofarmaka med låg molekylvikt, t.ex. peptider, oligonukleotider, aptamerer eller antikroppsfragment. Isotopens nukleära sönderfall sker huvudsakligen genom positronemission (89 %), med en genomsnittlig positronenergi på 740 keV. Dessutom är samordningskemin för Ga3+ välkänd, vilket underlättar utformningen av kelatbildare som kan användas för att koppla denna radionuklid till en målvakt. Nyligen konjugerades UBI29-41 till makrocykeln 1,4,7-triazacyklononan-1,4,7-triättiksyra (NOTA) och märktes därefter med 68Ga . Detta tillvägagångssätt användes ursprungligen med 1,4,7,10-tetraazacyklododekan-N′,N′′,N′′′′,N′′′′ ′-tetraättiksyra (DOTA) för att ge peptidderivat som DOTA-TOC eller DOTA-TATE för 68Ga-komplexering, vilket sedan möjliggjorde PET-avbildning baserad på tumörreceptorer. I en preklinisk studie med 68Ga-NOTAUBI29-41-PET visades att makrocykelkonjugeringen inte äventyrade peptidens förmåga att selektivt binda till bakterier in vivo. Förutom UBI finns det andra föreningar som utvärderats för avbildning av infektioner och inflammationer, men majoriteten av de tillgängliga antimikrobiella peptiderna är fortfarande underutforskade när det gäller avbildning av infektioner. År 2000 betraktades de humana neutrofila peptiderna (HNP1-3) bland andra peptider som ett användbart medel för att rikta in sig på infektioner. Som en del av försvarsmekanismen i monocyt- och lymfocytkulturer spelar de humana neutrofila peptiderna en kemotaktisk roll som medierande molekyler. Denna tvetydiga roll kan vara en nackdel när det gäller att utveckla HNP för avbildning. Användningen av särskilda peptider som målvektorer kan därför ha vissa sekundära begränsningar, trots deras gynnsamma cellulära egenskaper. Eftersom radiofarmaka oftast administreras genom intravenös injektion kan peptiderna vara känsliga för enzymatisk nedbrytning eller destabilisering av radioisotopen, vilket rapporterats för 18F-UBI29-41 . Den laktoferrinbaserade peptiden hLF(1-11) visade stor känslighet som infektionsmedel för multiresistenta Acinetobacter baumannii-stammar, men bindningen till svampen Candida albicans och den hepatobiliära utsöndringen gjorde den mindre gynnsam för avbildning. Dessutom visade hLF immunaktiverande eller bakteriedödande effekter beroende på den administrerade dosen, dvs. en negativ återkopplingsmekanism genom interleukin-10-modulering . Ett annat exempel är AMP Latarcin-2a, som utvinns ur giftet från den centralasiatiska spindeln Lachesana tarabaevi, som har en oönskad lytisk aktivitet mot grampositiva och gramnegativa bakterier, erytrocyter och jäst i mikromolära koncentrationer, vilket gör den mindre lämplig för bakteriedetektion med PET . Dessutom kan de flesta bakterier producera både ytbundna och/eller sekretoriska proteaser, vilket är en försvarsstrategi som kan bryta ned eller inaktivera AMP. Att använda AMP-derivatföreningar som bildgivande medel skulle följaktligen leda till falsknegativ diagnostik där en ihållande infektion lätt kan missbedömas eller helt förbises. Genom att förstå dessa specifika bakterieintrinsiska försvarsmekanismer kan man undvika att använda sårbara AMP-derivatstrukturer som bildgivande medel vid infektioner. Det bör också noteras att forskningen, med undantag för några få strukturer, inte avslöjade något bakteriespecifikt receptorliknande mål som kompletterar de potentiella peptiderna som ligander eller allosteriska modulatorer. Tumörceller uttrycker däremot specifika receptorreceptorer som integrin-, bombesin- eller somatostatinligander eller -antagonister som är måltavlor för SPECT- eller PET-spårämnen . Dessutom har värdens immunsystem, när det reagerar på infektioner, patologiska vägar som kan avbildas med hjälp av PET. Aktiverade makrofager kan fungera som ett likvärdigt värdberoende mål som kan visualiseras med 18F-FDG på ett icke-specifikt sätt, men den faktiska bakteriebördan förblir osynlig. Däremot agerar AMP-ledda peptider enligt en värdoberoende mekanism: radiomärkta peptider kommer att binda till fria och celladherenta men inte fagocyterade bakterier och därför blir bakterier osynliga för -UBI29-41-SPECT när de väl har införlivats av makrofager . Användningen av denna metod kan potentiellt göra det möjligt att tidigt upptäcka en infektion innan några morfologiska förändringar i kroppen äger rum . Det gör det också möjligt att skilja en infektion från en steril inflammation som ytligt sett kan se likadan ut, eftersom båda kan uppträda som röda, svullna och ovanligt varma områden. Detta beror på det ökade blodflödet, den ökade vaskulära permeabiliteten och inflödet av vita blodkroppar som är vanligt förekommande i båda situationerna. Det sistnämnda tillvägagångssättet skulle innebära att man i framtida kliniska studier skulle kunna använda sig av en avbildningsregim med dubbla spårämnen eller till och med administrering av dubbla spårämnen (om de respektive radioisotopegenskaperna och farmakokinetiska egenskaperna kompletterar tillvägagångssättet). Sammanfattningsvis bör den idealiska spårämnet för klinisk PET-avbildning av infektioner uppfylla flera kriterier. (1) Den bör uthärda en betydande nedbrytning i blodet och ha en rimlig grad av lipofiliitet. (2) Den bör ackumuleras och behållas på infektionsstället (helst genom internalisering och efterföljande förstärkning), med minimal ackumulering på icke-infekterade ställen. (3) Den bör ha en snabb clearance av icke-specifikt aktivitetsupptag från omgivande regioner för höga signal-till-brus-förhållanden. (4) Den bör ha minimala bieffekter och vara lätt att bereda, till en låg kostnad. UBI29-41 har visat sig vara användbar för generisk infektionsavbildning, och andra lämpliga AMP-baserade radiofarmaka kommer utan tvekan att följa.

Abkortningar

Intressekonflikter

Författarna förklarar att de inte har några intressekonflikter.

Acknowledgments

Arbetet i samband med denna översikt finansierades och fick vänligt stöd av National Research Foundation (NRF), Institute of Cellular and Molecular Medicine och Nuclear Technologies in Medicine and the Biosciences Initiative (NTeMBI), en nationell teknikplattform som utvecklas och förvaltas av South African Nuclear Energy Corporation (Necsa) och som finansieras av Department of Science and Technology (DST)

.