Antispermantikroppar:

Nyligen diskuteras upptäckten och den kliniska betydelsen av antispermieantikroppar (ASA) (Helmerhorst et al., 1999). Även om man försiktigt drar slutsatsen att `det finns anledning att acceptera antikroppsmedierad antispermimmunitet som en orsak till subfertilitet’, räknar författarna upp tre anledningar till varför klinikerna inte är benägna att testa för ASA hos subfertila par: (I) avsaknad av ett standardiserat och allmänt accepterat test för ASA, ii) avsaknad av konsensus om de kliniska konsekvenserna av ASA och iii) avsaknad av bevis för en mekanistisk förklaring till hur ASA försämrar befruktningen. Dessa tre påståenden förtjänar var och en en kommentar.

Diskussionen av Helmerhorst et al. (1999) är strikt baserad på moderna immunologiska begrepp, vilket leder till rekommendationen av immunoblotting och affinitetskromatografi som lovande inom detta område. För dem som har varit på området i många år kan dessa rekommendationer framkalla en känsla av deja vu. Detta var den vanliga strategin för ~20 år sedan, och många studier har sedan dess gjorts med hjälp av ELISA (enzyme-linked immunosorbent assays), med användning av spermatozoer eller antigenfraktioner, och med hjälp av immunoblotting (Lehmann et al., 1985; Mettler et al., 1985). Resultaten har dock i allmänhet varit en besvikelse; den klarhet man hade hoppats på har inte uppnåtts. Det finns inga bra förklaringar till den bristande framgången, men en aspekt av problemet kan vara att konventionellt immunologiskt tänkande inte är tillräckligt för att uppnå framsteg inom reproduktionsimmunologin. Man måste också ta hänsyn till reproduktionens fysiologi. En titt på de möjliga in vivo-effekterna av ASA kan illustrera detta.

Mekanistiska förklaringar till att ASA försämrar befruktningen?

Helmerhorst et al. hävdar att det saknas bevis för en mekanistisk förklaring till hur ASA försämrar befruktningen, vilket är ganska förvånande, särskilt i en nederländsk artikel, till och med i en artikel från Groningen. Det var i Groningen som den framstående gruppen under ledning av Jan Kremer visade att migrationen av spermatozoer med ASA av klassen immunoglobulin (Ig) A på ytan genom livmoderhalsens slem var starkt nedsatt, uppenbarligen på grund av att Fc-delen av IgA-molekylen (men inte av IgG-molekylen) binder effektivt till micellerna i livmoderhalsens slem (Jager et al., 1980). I testet för kontakt mellan spermier och cervixslem var procentandelen spermier som var täckta av IgA-antikroppar proportionell mot procentandelen spermier som uppvisade det s.k. ”shaking”-fenomenet, dvs. kraftiga svansrörelser utan framåtgående progression i cervixslemmet. Ytterligare bevis för IgA:s betydelse hittades när behandling av IgA-täckta spermatozoer med ett IgA1-proteas visade sig förbättra spermiernas vandring genom livmoderhalsens slem (Bronson et al., 1987).

Detta innebär att IgA-antikroppar mot vilket antigen som helst som uttrycks på spermiernas membran kommer att försämra penetreringen och att ASA:s immunglobulinklass i denna situation blir viktigare än antigenspecificiteten. Detta står i motsats till konventionella immunologiska reaktioner, vilket kan vara anledningen till att skakfenomenet ofta försummas i immunologiska diskussioner. Det är dock uppenbarligen en mycket effektiv mekanism; i experiment om migrationen av IgA-täckta spermatozoer in i livmoderhalsens slem i kapillärrör nådde spermatozoerna från patienter med starka immunreaktioner ofta bara några få mm in i slemmet. Bindningen av Fc-delen av IgA till livmoderhalsens slem bör ses i ett evolutionärt perspektiv. Med cervixslemmet som enda barriär mellan miljön och kvinnans könsorgan och bukhåla måste det finnas försvarsmekanismer i slemmet för att förhindra att mikroorganismer tränger in i könsorganen. IgA-antikroppar mot mikroorganismer fyller denna funktion genom att fånga upp mikroorganismerna. I sällsynta fall när en kvinna har producerat IgA-antikroppar mot spermatozoer eller, vilket är vanligare, när spermatozoer som kommer in i slemmet redan är täckta av IgA, blir resultatet detsamma: spermatozoerna fångas upp eller vandringen försämras.

En mer konventionell immunologisk mekanism genom vilken ASA skulle kunna minska fertiliteten skulle vara genom att den binder sig till den receptor genom vilken spermatozoer fäster vid ägget, och på så sätt blockerar samspelet mellan spermier och äggstockar. I denna situation är ASA:s antigenspecificitet avgörande, och eftersom det finns mer än ett autoantigen i spermiernas membran kan inte alla ASA ha denna effekt. Under de senaste två decennierna har detta fenomen studerats ingående i samband med in-vitrofertilisering (IVF) med spermatozoer från män med ASA. I nästan alla studier observerades en signifikant minskning av andelen befruktade ägg. En av de tidiga studierna visade också att den blockerande effekten huvudsakligen orsakades av IgA-antikroppar (Clarke et al., 1985), men detta har inte noterats i senare studier, och absorptionsexperiment har visat att en hämmande effekt också kan orsakas av IgG-antikroppar (Bronson et al., 1982). En nyligen genomförd studie om spermatozoers bindning till zona pellucida (Francavilla et al., 1997) är särskilt illustrativ. I varje experiment tillsatte man lika många spermatozoer från en fertil person och från en patient med stark reaktivitet i immunobead-testet, så att de två typerna av spermatozoer, märkta med olika fluorokromer, fick konkurrera om att binda till zona pellucida. Jämfört med spermatozoerna från de fertila männen inhiberades spermatozoerna från patienter med normala spermaprover (bortsett från förekomsten av ASA) i ~50 % av fallen, förstärktes i ett fåtal fall och påverkades inte i de återstående fallen, vilket stämmer överens med konceptet att antikroppsspecificiteten måste spela en roll. Men trots patienternas starka immunsvar med höga titrar av cirkulerande ASA och, i de flesta fall med både IgG och IgA, på nästan alla spermatozoer, var hämmningen aldrig fullständig utan en del av de antikroppstäckta spermatozoerna var bundna till zona pellucida. Detta stämmer överens med erfarenheten från många andra IVF-studier att även om procentandelen befruktade ägg kan minska på grund av förekomsten av ASA, så brukar vissa ägg vanligtvis ha blivit befruktade.

Slutsatsen från denna diskussion om de möjliga fertilitetsreducerande effekterna av ASA är att försämring av spermiernas vandring genom cervixslemhinnan genom IgA-antikroppar är en mycket effektiv mekanism, medan blockeringen av samspelet mellan spermier och äggstockar (som orsakas av både IgG- och IgA-ASA) tycks vara mindre effektiv, och troligen sällan förhindrar men kanske fördröjer befruktningen. Kliniska erfarenheter stöder dessa slutsatser. På infertilitetskliniker har män med ASA sällan ett isolerat IgG-svar utan uppvisar vanligen en blandning av IgG- och IgA-antikroppar. Å andra sidan, i fertilitetsstudier av vasektomerade och därefter vasovasostomerade män, var immunsvar begränsade till IgG-klassen inte sällsynta, men dessa män tycktes ha normal fertilitet medan fertilitetsgraden var omvänt korrelerad med IgA-svaret (Meinertz et al., 1990). Därför verkar det som om ”avsaknad av bevis för en mekanistisk förklaring” inte bör hindra klinikern från att testa patienter (åtminstone män) med fertilitetsproblem för ASA.

Missnöje med en standardiserad och allmänt accepterad analys för ASA?

Och även om det inte går att argumentera mot detta påstående från Helmerhorst et al. (1999), så är frågan om det är ett rättvist och nödvändigt krav för att en analys ska kunna användas? Om så är fallet kan det breda spektrumet av laboratorietester minskas dramatiskt. Den väsentliga frågan tycks vara om vissa tester för ASA ger kliniskt relevanta resultat.

I många år var spermaagglutinationstester (antingen makroskopisk gelatinagglutination eller mikroskopisk brickagglutination) de vanligaste testerna (Rose et al., 1976). På senare tid har dessa tester misskrediterats och ofta beskrivits som opålitliga, särskilt i samband med beskrivning av nya tekniker. Det är sant att ingen av dem är idealisk, eftersom båda kräver färska spermaprover av optimal kvalitet. I gelatinagglutinationstestet används stora volymer sperma, och i brickagglutinationstestet krävs erfarenhet och försiktighet vid tolkningen av resultaten för att skilja verkliga agglutinater från ospecifik klumpning. Dessa tester har dock gett kliniskt relevanta resultat hos män. Flera studier har visat att höga titrar i serum eller fria antikroppar i seminalplasma mycket sällan förekommer utom hos patienter med fertilitetsproblem (hos ~10 % av män från par med oförklarlig fertilitet) (t.ex. Bronson et al., 1985) och hos normospermatiska män i en uppföljningsstudie (Rümke et al., 1985), 1974), var ökande serumtiter i gelatinagglutination korrelerade med minskad fertilitet (t.ex. hade endast 12,5 % av 64 män med titrar från 128-512 och ingen av 11 med titrar ≥1024 framkallat befruktning under observationsperioden på 2-16 år). Eftersom de ASA som påvisas i serum huvudsakligen tillhör IgG-klassen kan det tyckas märkligt att serumtiter är relaterade till subfertilitet om ASA:s anti-fertilitetseffekt huvudsakligen orsakas av IgA-antikroppar i sperma. Förklaringen är att IgA-antikroppar mycket sällan förekommer utan IgG-antikroppar, och höga IgA-koncentrationer hittas främst hos patienter som också har höga IgG-koncentrationer.

En lika viktig observation i dessa studier var att låga koncentrationer av antikroppar (titrar på 4-16) var lika vanliga bland fertila kontroller och infertila patienter, vilket tyder på att sådana låga värden uppenbarligen inte påverkade fertiliteten på något signifikant sätt.

På senare tid har det indirekta immunobead-testet blivit det mest populära (Bronson et al, 1982). Färska spermatozoer, som skördas med swim-up-teknik, inkuberas med serum eller seminalplasma, tvättas sedan noggrant och immunobeads täckta med anti-IgG eller anti-IgA (eller anti-IgM) tillsätts. I mikroskopet kan man se att immunobligatorerna fäster vid de rörliga spermatozoerna om provet innehåller ASA av rätt immunoglobulinklass. Användningen av ett anti-immunglobulin garanterar att reaktionen är specifik. Det är ett mycket känsligt test som bestämmer ASA:s immunglobulinklass och som endast kräver små mängder spermatozoer, vilket uppenbarligen gör det till en idealisk testmetod. Det finns dock ett problem. För att det skall vara praktiskt genomförbart utförs det vanligen med endast en utspädning av serum, vanligen en låg utspädning (oftast 1:4). I sådana fall fungerar det indirekta immunobead-testet som ett mycket känsligt screeningtest, så att till och med låga antikroppsnivåer utan betydelse för fertiliteten (som förmodligen utgör den största delen av de positiva reaktionerna) kan framkalla starka reaktioner, åtminstone för IgG (se t.ex. Bronson et al., 1985). Detta kan förklara varför flera utredare har ifrågasatt värdet av testning för ASA och betydelsen av ASA som orsak till infertilitet. Om testet utfördes med högre spädningar av serum (t.ex. 1:50 och 1:250) skulle det kunna ge bättre klinisk vägledning.

Det mest rationella sättet att testa ASA hos män är uppenbarligen att bestämma immunoglubuliner (IgG och IgA) på ytan av patientens spermatozoer med hjälp av direkt blandad agglutineringsreaktion (MAR) eller immunobead-test. Båda testerna är snabba, enkla och känsliga, men kräver rörliga spermatozoer för att säkerställa att erytrocyterna eller immunobeads fäster vid spermiemembranet. De är utmärkta screeningtest; om reaktionen är negativ eller svagt positiv (≤50 % av de rörliga spermatozoerna bär på immunoglobuliner) kan patienten knappast ha ett infertilitetsproblem orsakat av ASA och inga ytterligare immunologiska tester behövs. Om å andra sidan alla eller majoriteten av spermatozoerna har immunglobuliner på sitt membran är konsekvenserna för fertiliteten svårare att bedöma, först och främst eftersom dessa känsliga tester inte kan skilja mellan spermatozoer med endast små mängder immunglobulin och spermatozoer som är helt mättade med antikroppar på alla tillgängliga antigenmolekyler. Både när det gäller den IgA-inducerade försämringen av spermiernas vandring genom livmoderhalsens slem och när det gäller en eventuell blockering av samspelet mellan spermier och ovum måste antalet antikroppsmolekyler antas spela en roll. I denna situation kan det vara användbart att bestämma ASA i serum och spermaplasma. Med höga titrar i serum eller ett överskott av fritt ASA i seminalplasma verkar det troligt att mängden ASA på spermatozoerna också skulle vara hög.

Det faktum att dessa teoretiska överväganden stämmer överens med den kliniska verkligheten illustrerades på det tydligaste sättet i vår uppföljningsstudie på vasovasostomerade män, som nämndes ovan (Meinertz et al, 1990).

Under observationsperioden (22-111 månader, median 44 månader) hade 10 av de 15 männen (66,7 %) med en negativ direkt MAR (≤10 % av de rörliga spermatozoerna med vidhäftande erytrocyter) inducerat befruktning, men det hade även 42 av de 79 männen (53,2 %) med en positiv MAR gjort (Fishers tvåsvansade exakta test: P = 0,4995). En enbart positiv MAR (>10 % för IgG eller IgA) gav alltså ingen information om fertilitetsstatus. De flesta av männen med ASA hade både IgG och IgA på sina spermier, men några hade endast IgG. Rena IgA-reaktioner registrerades inte. Om man tittar på männen med immunreaktioner begränsade till IgG-klassen var befruktningsfrekvensen för den totala gruppen 85,7 % (18/21), och för dem med IgG på alla spermatozoer var den lika hög (11/13 = 84,6 %). Det gick alltså inte att registrera någon effekt mot fertiliteten för IgG; i själva verket var befruktningsfrekvensen anmärkningsvärt hög, till och med högre än för patienter utan ASA (även om skillnaden inte var statistiskt signifikant). Å andra sidan uppvisade männen med både IgG- och IgA-reaktivitet minskad fertilitet med ökande IgA-reaktivitet. För den totala gruppen var befruktningsgraden 42,9 % (24/56) och för dem med IgA på alla spermatozoer 21,7 % (fem av 23). Jämfört med grupperna med enbart IgG-reaktivitet var skillnaderna mycket signifikanta. I ett försök att identifiera män med särskilt starka immunsvar visade det sig att ingen av 10 män med 100 % IgA-reaktivitet i MAR och cirkulerande spermieagglutininer i titrar på 256 eller högre hade framkallat graviditet och endast en av 13 män med 100 % IgA MAR och fria spermieagglutininer i seminalplasma hade lyckats.

Och även om det för närvarande inte finns någon enskild test som kan utvärdera den enskilda patientens fertilitetsstatus på ett tydligt sätt med avseende på immun subfertilitet eller infertilitet, förefaller det motiverat att dra slutsatsen att vi med rätt kombination av tester (t.ex. MAR- eller immunobead-tester i kombination med spermieagglutininer i serum eller spermaplasma) kan närma oss detta mål ganska nära. En nyligen genomförd undersökning av diagnostik och behandling av ASA vid reproduktionsmedicinska centra i Storbritannien (Krapez et al., 1998) visade att det stora flertalet centra faktiskt följer denna strategi. Sålunda testade 44 av 48 centra för ASA på spermatozoer genom direkt MAR-test (28 laboratorier) eller immunobead-test (19 laboratorier). I vissa fall testades även spermaplasma och 17 laboratorier undersökte serum från manliga partners genom olika tester, främst trayagglutinationstestet. Detta innebär att nästan alla centra på ett enkelt sätt kunde identifiera de män som kunde ha en immunologisk orsak till sin subfertilitet. Även om detta är det bästa man kan göra för närvarande är det inte optimalt. Vad som behövs är en teknik som på ett mer exakt sätt kan identifiera de män som har ett immunologiskt problem. För närvarande verkar flödescytometri vara en lovande teknik som kanske kan fastställa den exakta mängden IgG och IgA på de enskilda spermatozoerna (Räsanen et al., 1992; Ke et al., 1995).

Missnöje med konsensus om de kliniska konsekvenserna av ASA?

Omedelbart kan detta påstående från Helmerhorst et al. tyckas vara korrekt, men frågan är om undersökningar med många olika tekniker och kriterier kan jämföras? För flera år sedan trodde man allmänt att ASA kunde orsaka infertilitet, men numera verkar bilden mycket mindre klar. Det kan finnas flera orsaker till denna ändrade uppfattning.

För det första har vi lärt oss att även med de högsta nivåerna av ASA (särskilt IgA) kan konception knappast uteslutas. Därför är frågan snarare i vilken utsträckning ASA kan orsaka subfertilitet. De studier om manlig infertilitet som diskuteras i denna översikt har huvudsakligen baserats på olika konventionella (vissa skulle kanske säga gammaldags) tekniker. Även om konsensus kanske är ett för starkt ord att använda, är resultaten av dessa studier i allmänhet väl samstämmiga, vilket tyder på att låga nivåer av ASA inte gör någon större skada, medan något högre värden (särskilt IgA) orsakar subfertilitet, vilket ökar till något som ligger nära infertilitet för mycket höga nivåer av ASA.

För det andra, när nya tester för ASA introduceras bör de jämföras med de konventionella testerna, och om de inte bestämmer samma typ av ASA bör man ha detta i åtanke. När en multicenterstudie från Världshälsoorganisationen (WHO) om antikroppar mot reproduktiva antigener genomfördes för 15 år sedan visade det sig att flera av teknikerna, inklusive de flesta ELISA, immunoblottningstekniker, passiv hemagglutination och cytotoxicitetstester, inte påvisade den ASA som registrerades med konventionella tekniker. Dessutom hade resultaten vanligtvis liten klinisk relevans och visade ingen signifikant skillnad mellan fertila och infertila grupper (Hjort et al., 1985). Tyvärr glöms detta ofta bort i diskussioner om ASA.

För det tredje bör den kvantitativa aspekten och immunoglubulinklassen för antikropparna ingå i testningen. Alla patienter med reaktivitet i direkt MAR- eller immunobead-test bör således inte betraktas som en enda grupp, utan de med svag reaktivitet (troligen fertila) bör särskiljas från de med antikroppar på nästan alla spermier (troligen subfertila), och på samma sätt bör de med endast IgG (troligen fertila) inte blandas ihop med de med stark reaktivitet för både IgG och IgA (troligen subfertila eller infertila).

Den nyligen genomförda undersökningen av reproduktionsmedicinska centra i Storbritannien (Krapez et al, 1998) visade att det vanligtvis inte görs någon åtskillnad mellan IgG och IgA ASA. Detta beror förmodligen på att de flesta infertila män med ASA kommer att ha en blandning av de två immunglobulinklasserna på sina spermatozoer. Försöken att behandla patienterna stämmer dock väl överens med slutsatserna från laboratorieundersökningar och ”kliniska experiment” (studier på vasovasostomerade män). Därför används intrauterin insemination på de flesta centra för att övervinna den IgA-inducerade försämringen av spermiernas penetration genom livmoderhalsens slem. Antingen IVF eller intracytoplasmatisk spermieinjektion (ICSI) användes för patienter med stark immunitet mot spermier (>50 % reaktivitet i MAR- eller immunobead-test), men i allmänhet med liberala indikationer i jämförelse med de slutsatser som dragits ovan. Detta återspeglar uppenbarligen det faktum att ASA ofta inte är den enda orsaken till infertilitet hos dessa patienter, utan lågt antal spermier, dålig motilitet eller problem hos den kvinnliga partnern kan också spela en roll. Därför är ASA:s anti-fertilitetseffekter svåra att analysera i grupper av infertila patienter.

Vasektomerade och därefter vasovasostomerade män tycks erbjuda en mycket bättre grupp; i själva verket en grupp som i hög grad liknar försöksdjur. Båda partnerna har vanligtvis tidigare bevisat sin fertilitet så att genetiska faktorer för infertilitet kan uteslutas. Man kan välja ut en grupp män som har vasektomiserats under en begränsad tid och som har genomgått en framgångsrik vasovasostomi med ett godtagbart antal spermatozoer som uppvisar god motilitet i spermaprovet. Om båda partnerna har varit friska sedan den senaste befruktningen är andra infertilitetsfaktorer än eventuellt ASA mycket mindre sannolika än i en grupp infertila patienter. Den stora fördelen med vasovasostomigruppen är att deras fertilitetsstatus inte är känd från början, och en kontrollgrupp ingår därför automatiskt, dvs. vissa har ingen ASA, vissa har endast IgG och vissa har både IgG och IgA. Detta verkar vara en idealisk grupp för att studera effekterna av ASA och för att utvärdera nya tekniker, och det är förvånande att den har använts så lite. Den avgörande frågan i detta sammanhang är naturligtvis om vasektomerade män producerar antikroppar mot alla samma antigener som infertila män kan reagera mot. Ytterligare studier krävs, men hittills har vi inga bevis för att detta inte skulle vara fallet.

Detta leder till slutsatsen att spermieimmunologi kan ge användbar information för klinikerna. Det är kanske inte så viktigt nu när den immunologiska faktorn tillsammans med många andra infertilitetsfaktorer kan övervinnas med hjälp av tekniker för assisterad reproduktion. Det är dock fortfarande en god princip att nå en så exakt diagnos som möjligt innan en behandling inleds.

.