AP-3-adapterkomplexet medierar sortering av jäst och däggdjurs PQ-loop-familjens aminosyratransportörer till det vakuolära/lysosomala membranet.familjens basiska aminosyratransportörer till det vakuolära/lysosomala membranet

Ypq1-proteinet kan nå det vakuolära membranet via ALP- eller endosomala vägen

Har nyligen rapporterat att ett Ypq1-GFP-fusionsprotein lokaliseras till det vakuolära membranet6, försökte vi fastställa genom vilken trafikeringsväg Ypq1 når denna avdelning. Vacuolära membranproteiner kan nå vakuolen via två olika vägar: ALP (alkaliskt fosfatas) och CPY (karboxypeptidas Y), där den sistnämnda innebär att proteinerna passerar via endosomer (fig. 2A). För att testa om Ypq1 följer CPY-vägen undersökte vi dess intracellulära fördelning i en pep12Δ-mutant som saknar en t-SNARE som är involverad i vesikelfusionen med den sena endosomen13. I denna mutant hittades Ypq1-GFP uteslutande vid det vakuolära membranet (Fig. 2B). I en vps27Δ-mutant som saknar en komponent i det endosomala ESCRT-0-komplexet är membranproteiner som transporteras via endosomerna vanligtvis staplade i tydligt synliga klass E-kompartment som motsvarar onormalt förstorade endosomer, men Ypq1-GFP-proteinet riktades normalt mot det vakuolära membranet i denna mutant (data visas inte). Dessa resultat visar att Ypq1 inte kräver en fungerande CPY-väg för att nå vakuolen. Vi testade sedan om Ypq1 når det vakuolära membranet via ALP-vägen. Det är väl dokumenterat att denna väg kräver AP-3-adapterkomplexet, som antas verka vid trans-Golgi för att sortera lastproteiner till vesiklar som sedan smälter samman med endosomerna. Detta komplex är en heterotetramer som består av två stora underenheter (β3a och δ), en medelstor underenhet (μ3a) och en liten underenhet (σ3), och frånvaro av någon av dessa underenheter resulterar i ett bristfälligt AP-3-komplex14. Vi isolerade därför två AP-3-bristfälliga stammar, apm3Δ (saknar underenhet μ3a) och apl5Δ (saknar underenhet δ). I dessa mutanter hittades Ypq1-GFP vid det vakuolära membranet samt i små punktformiga strukturer som lätt märktes med FM4-64 och som inte observerades i celler av vildtyp (fig. 2B). I amp3Δ- och apl5Δ-mutantceller som också uttrycker ett funktionellt Sec7-mCherry för att märka Golgi, dekorerades en hög andel av dessa punktstrukturer med Sec7-mCherry (Fig. 2C) (för en kvantifiering av sublokaliseringsmönstren, se Supplementary Fig. S1 online). Dessa resultat tyder på att när ALP-vägen är bristfällig tenderar Ypq1 att ackumuleras i Golgi medan en betydande del av proteinet når det vakuolära membranet via en annan väg. För att testa om den sistnämnda är CPY-vägen bestämde vi placeringen av Ypq1-GFP i apm3Δ pep12Δ och apl5Δ pep12Δ dubbelmutanter (fig. 2B). Intressant nog var leveransen av Ypq1-GFP till vakuolen till stor del nedsatt i dessa stammar och proteinet hittades mestadels utspridd i hela cytosolen samt i punktformiga strukturer märkta med Sec7-mCherry (Fig. 2B,C) (för en kvantifiering av sublokaliseringsmönstren, se Supplementary Fig. S1 online). Vacuolen i dessa dubbelmutanter kunde normalt märkas med FM4-64. Dessa resultat visar att Ypq1 kan sorteras till vacuolarmembranet via både ALP- och CPY-vägarna. I celler av vildtyp använder det huvudsakligen ALP-vägen, men när denna väg är bristfällig, uppehåller sig proteinet längre i Golgi men kan fortfarande effektivt nå det vakuolära membranet via CPY-vägen. När både ALP- och CPY-vägarna är bristfälliga kan en liten del av Ypq1-GFP påvisas vid det vakuolära membranet, vilket tyder på att proteinet kan använda ännu en annan väg, men en som är mycket mindre effektiv när det gäller att korrekt rikta Ypq1 till vakuolen.

Ett surt dileucinmotiv främjar Ypq1-sortering till ALP-vägen

AP-3-beroende sortering av transmembranproteiner förmedlas ofta av tyrosinbaserade (YXXØ) eller dileucinbaserade (XXXL) signaler (där Ø är en skrymmande hydrofob rest och X en valfri aminosyra)15. Ypq1 innehåller en EQQPLL-sekvens i sin andra stora slinga som vetter mot cytosolen. Dileucinet i detta motiv föregås av ett prolin, en egenskap som observerats i flera lastämnen som använder ALP-vägen16. En dileucin-till-dialanin-substitutionsmutant av Ypq1 (Ypq1LL>AA) visade sig vara riktad mot det vakuolära membranet, men även dekorera punktstrukturer (fig. 3A). Denna fenotyp liknar den som observerats för Ypq1 av vildtyp i AP-3-deficienta celler, vilket tyder på att Ypq1LL>AA når vacuolen via den alternativa CPY-vägen. Som stöd för detta synsätt misslyckades Ypq1LL>AA som producerades i en pep12Δ-mutant med att riktas till vakuolen och missorterades till cytosoliska punktstrukturer, vilket observerades för Ypq1 i apm3Δ pep12Δ- och apl5Δ pep12Δ-mutanterna (fig. 3A). Dessa resultat visar att det sura dileucinmotivet i Ypq1 krävs för dess AP-3-beroende sortering till vakuolen, men inte för dess Pep12-beroende leverans till vakuolen. Dessa slutsatser stämmer överens med resultaten från en nyligen publicerad studie av S. Emr och medarbetare under förberedelserna av detta manuskript17. Därefter undersökte vi mer i detalj hur Ypq1LL>AA-varianten transporteras till vacuolen. Vi tänkte först på möjligheten att detta muterade protein, på grund av att det inte kan använda ALP-vägen, först missorteras till plasmamembranet innan det genomgår snabb endocytos och därefter Pep12-beroende leverans till vakuolarmembranet. Denna modell stöddes inte av våra observationer: Ypq1LL>AA ackumulerades inte vid cellytan i en end3Δ-mutant som är defekt i endocytos, vilket tyder på att det når vakuolen via CPY-vägen (Fig. 3B). Vi ställde då hypotesen att leverans av Ypq1LL>AA till vacuolen skulle kunna involvera dess sortering från Golgi till endosomer tack vare alternativa adaptorer som AP-1-komplexet eller de monomera GGA-proteinerna. Vi uttryckte det muterade proteinet Ypq1LL>AA i gga1Δ gga2Δ-celler som saknar de redundanta Gga1- och Gga2-adaptorerna och i amp1Δ, amp2Δ och apl4Δ-celler som saknar underenheter av AP-1-komplexet. I var och en av dessa mutanter fann man att proteinet fortfarande nådde vakuolen (fig. 3B). Dessa observationer tyder antingen på att dessa adaptorer agerar redundant för att främja sortering av Ypq1LL>AA till vakuolen via CPY-vägen eller att andra adaptorer är inblandade.

Ypq2 och Ypq3 trafikerar också till vakuolen via ALP-vägen, men genomgår olika öden när ALP-vägen är icke-funktionell

Ypq2- och Ypq3-proteinerna, som i sekvensen är mycket lika Ypq1, lokaliseras också till vakuolärmembranet6 och båda innehåller också ett surt dileucin i den andra cytosoliska loopen. Resultaten i figur 4A visar att Ypq2 travar normalt till vacuolen i en pep12Δ-mutant. Detta visade sig även gälla i apm3Δ- och apl5Δ-mutanter som är defekta i ALP-vägen, där den dessutom visade sig dekorera punktstrukturer, en fenotyp som inte observerades i celler av vildtyp. En hög andel av dessa punktstrukturer var också märkta med Sec7-mCherry (fig. 4B), vilket tyder på att Ypq2, i likhet med Ypq1, tenderar att ackumuleras i Golgi när ALP-vägen är bristfällig. I både apm3Δ pep12Δ och apl5Δ pep12Δ dubbelmutanter misslokaliserades Ypq2 till stor del till små punktformiga cytosoliska strukturer, varav många var dekorerade med Sec7-mCherry, även om en fraktion av proteinet tycktes levereras korrekt till vacuolen (Fig. 4A,B) (för en kvantifiering av sublokaliseringsmönstren, se Supplementary Fig. S2 online). Dessa resultat tyder på att Ypq2 beter sig som Ypq1 genom att det främst använder ALP-vägen för att nå vacuolen. De visar också att när denna väg är defekt, så uppehåller sig Ypq2 längre i Golgi men kan fortfarande levereras till vacuolarmembranet, främst via CPY-vägen.

Då uttryck av en YPQ3-GFP-gen under kontroll av den naturliga promotorn för YPQ3 gav en knappt detekterbar nivå av Ypq3-GFP, uttryckte vi fusionsgenen under kontroll av en galaktosinducerbar promotor. För att minska risken för fellokalisering på grund av överproduktion av Ypq3-GFP odlades cellerna först på raffinos, sedan tillsattes galaktos i tre timmar och slutligen tillfördes glukos i två timmar för att undertrycka transkriptionen av YPQ3-GFP-genen. Denna transient inducerade Ypq3-GFP, som ackumulerades i cellen på en nivå nära den endogena nivån av Ypq1-GFP (se Supplementary Fig. S3, online), visade sig lokaliseras till det vakuolära membranet (Fig. 5A), i enlighet med våra tidigare resultat6. Denna vacuolära lokalisering observerades också i mutanten pep12Δ. I apm3Δ- och apl5Δ-mutanterna missorterades dock Ypq3 huvudsakligen till vacuolens lumen. Denna missortering var beroende av Pep12, eftersom Ypq3 inte riktades till vacuolen i apm3Δ pep12Δ och apl5Δ pep12Δ dubbelmutanter (fig. 5A) (för en kvantifiering av sublokaliseringsmönstren, se Supplementary Fig. S4 online). Dessa resultat tyder på att Ypq3, liksom Ypq1 och Ypq2, huvudsakligen använder ALP-vägen för att nå det vakuolära membranet. När komponenter i AP-3-komplexet saknas omdirigeras Ypq3 på ett Pep12-beroende sätt till endosomer, där det sorteras in i den multivesikulära kroppsbanan (MVB), vilket resulterar i att det levereras till det vakuolära lumenet. Denna tolkning bedömdes ytterligare genom att isolera en Ypq3LL>AA-mutant som inte bör kännas igen av AP-3-adaptorkomplexet. I vildtypceller var Ypq3LL>AA-varianten tydligt missorterad till vakuolärlumen, men i en pep12Δ-mutant omdirigerades den till små cytosoliska punktstrukturer (fig. 5B).

Vi ansåg att det annorlunda beteendet hos Ypq3 jämfört med Ypq1 och Ypq2 i AP-3 bristfälliga stammar kan bero på att Ypq3-GFP syntetiserades i celler som växte i närvaro av galaktos, eller på att transkriptionen av Ypq3-GFP genen inducerades med hjälp av den starka GAL promotorn. Detta verkar dock osannolikt eftersom Ypq1-GFP- och Ypq2-GFP-proteinerna som transient inducerades i vildtyp- och mutantstammar med hjälp av samma GAL-promotor lokaliserades i cellerna som när de uttrycktes under sina egna genpromotorer (se Supplementary Fig. S5 online). Dessutom, även om den fluorescerande signalen knappt var detekterbar, fick vi bevis för att Ypq3-GFP som uttrycks med hjälp av den naturliga YPQ3-genens promotor märkte vakuolernas membran i vildtypstammen, men inte i apl5Δ-mutanten, en fenotyp som tydligt skiljer sig från de som erhållits med Ypq1-GFP och Ypq2-GFP. I denna mutant fanns Ypq3-GFP i punktformiga strukturer som sannolikt motsvarade Golgi, och dess missortering till det vakuolära lumenet var inte tydligt synlig, sannolikt på grund av att fluorescensen var för svag (se kompletterande figur S6 online).

Slutningsvis använder Ypq2- och Ypq3-proteinerna huvudsakligen ALP-vägen för att nå det vakuolära membranet och avviker till endosomer när denna väg är defekt, vilket visas ovan för Ypq1. Medan Ypq1 och Ypq2 som passerar genom endosomerna når det vakuolära membranet på ett effektivt sätt, är Ypq3 mer benägen att sorteras in i MVB-vägen, vilket leder till att det riktas till det vakuolära lumenet.

PQLC2 som produceras i jäst använder ALP-vägen och sitt dileucinmotiv för att nå det vakuolära membranet

I en tidigare studie fann man att PQLC2 från råttor lokaliserades till lysosomer i HeLa-celler, men dess PQLC2LL>AA-mutant, där det C-terminala dileucinet är ersatt med ett dialanin, uppvisade en mer diffus fördelning i cellen och missorterades delvis till plasmamembranet6. Dessutom visade sig PQLC2 som produceras i jäst lokaliseras till det vakuolära membranet, där den är funktionell, eftersom den visade sig komplettera tillväxtfenotypen hos en ypq2Δ-mutant6. Resultaten i figur 6A visar att PQLC2 var korrekt riktad mot jästvakuolen i en pep12Δ-mutant, men avvek till det vakuolära lumenet i apm3Δ- och apl5Δ-mutanter. Denna inriktning på vacuolärlumen var nedsatt i apm3Δ pep12Δ- och apl5Δ pep12Δ-dubbelmutanter, där PQLC2 visade sig vara diffust fördelad i cytosolen (för en kvantifiering av sublokaliseringsmönstren, se Supplementary Fig. S7 online). Vi uttryckte också mutanten PQLC2LL>AA-mutanten i jäststammar av vildtyp och mutanter. I jäst av vildtyp befanns PQLC2LL>AA lokaliseras till det vakuolära lumenet, men den hittades distribuerad i hela cytosolen i pep12Δ-mutanten (fig. 6B). Sortering av laster till den multivesikulära kroppsbanan är vanligtvis nedsatt i en vps27Δ-mutant som saknar en nyckelkomponent i ESCRT-0-komplexet18. I vps27Δ-mutanten staplades PQLC2LL>AA i ett stort perivacuolärt kompartment: det klass E-kompartment som vanligtvis observeras i denna kategori av mutanter (fig. 6B). Dessa resultat visar att PQLC2 som produceras i jäst beter sig som den endogena Ypq3: den sorteras till vakuolen via ALP-vägen på ett sätt som är beroende av att dess dileucinmotiv erkänns på rätt sätt av AP-3-adapterkomplexet. När detta erkännande är nedsatt på grund av att dileucinmotivet är muterat eller att en komponent i AP-3-komplexet saknas, avviker PQLC2 till endosomerna, där den effektivt sorteras in i MVB-vägen och slutligen når det vakuolära lumenet.

.