Apc-relaterade modeller av tarmneoplasier: en kort genomgång för patologer

Colorektalcancer är en vanlig orsak till dödlighet i cancer i västvärlden. I många patologipraktiker utgör kolorektala adenom som avlägsnas under screeningkoloskopier en hög procentandel av den dagliga arbetsbelastningen, och därför är morfologin hos humant kolorektal karcinom och adenom, dess förstadier till lesioner, bekant för kirurgiska patologer. Vid akademiska centra kan kirurgiska patologer bli ombedda att tolka musmodeller av neoplasi för utredare, och en grundläggande förståelse för likheter och skillnader mellan morfologin hos mänsklig tarmneoplasi och musmodeller är nödvändig för en korrekt tolkning.

Genetiskt förändrade musmodeller av tumörigenes, även om de ibland kritiseras för sin ofullständiga modellering av mänsklig sjukdom, är användbara när det gäller att bedöma om specifika mutationer kan leda till tumörbildning, för kemopreventionsstudier och för att klarlägga funktionaliteten hos förändrade genprodukter. Det finns många genetiskt manipulerade musmodeller (GEM) av tarmneoplasi som beskrivs i den vetenskapliga litteraturen, men de kan i stort sett delas in i fem grupper: Apc-relaterade modeller med förändringar i Wnt-signalering, modeller med bristfällig mismatchreparation, modeller som behandlats med cancerframkallande ämnen, modeller med förändringar i transformerande tillväxtfaktor β och kolit-associerad neoplasi som uppstår i modeller med nedsatt immunförsvar, t.ex. IL10-/- möss. Denna översikt kommer att fokusera på patologin hos en av de första GEM-modellerna för tarmneoplasi, ApcMin+/–musen och relaterade modeller, med målet att beskriva de morfologiska egenskaperna hos de intestinala lesionerna, med en jämförelse med humana kolorektala adenom och karcinom.

En av de mest använda modellerna för tarmneoplasi hos människor är ApcMin+/–modellen, som utvecklades 1990 i William Doves laboratorium (Moser et al., 1990). ApcMin+/–musen, den första könsmuterade musmodellen för tarmneoplasi, bär på en autosomalt dominant funktionsförlustmutation vid Apc-kodon 850 som genererats genom exponering för N-etyl-N-nitrosourea (ENU), en mycket potent mutagen. Ett antal andra modeller med Apc-mutationer, många med trunkerande mutationer, har sedan dess skapats (tabell 1).

Dessa Apc-relaterade modeller är särskilt användbara eftersom den vanligaste drivmutationen för kolorektalcarcinom hos människor är en mutation i tumörsuppressorgenen APC, Detta leder till inaktivering av APC och aktivering av Wnt-signalvägen, med stabilisering av β-catenin och dess translokation till kärnan. APC-genen hos människor kodar för ett 213 kilodalton protein som är involverat i celladhesion och motilitet, cellcykelreglering, apoptos och signaltransduktion (Boman & Fields, 2013), och dess germina mutation resulterar i familjär adenomatos polyposis coli (FAP). Detta cancerpredispositionssyndrom kännetecknas av utvecklingen av hundratals kolorektala adenom, vilket leder till adenokarcinom vid ung ålder. De flesta mutationer som orsakar FAP finns inom 5′-halvan av genen och resulterar i trunkerade polypeptider.

Genetik av APC-relaterade djurmodeller

Många av de Apc-relaterade musmodellerna har konstruerats så att de innehåller germina mutationer i Apc som leder till att ett trunkerat Apc-protein uttrycks; i de flesta av dessa modeller är endast heterozygoter livskraftiga, eftersom homozygotism är embryonalt dödligt. Förlust av tillväxtkontroll vid förlust av den återstående vildtypkopian av Apc leder till multipla tarmadenom. Den specifika placeringen av Apc-mutationen påverkar polypernas mångfald, placering och livslängd hos mössen (McCart et al., 2008). Till exempel har Apc1638N/+ musen en minskad polypbörda och längre livslängd jämfört med ApcMin/+ musen (Smits et al, 1998), I Apc1322T-musen har det muterade proteinet en 20-aminosyra β-cateninbindande/nedbrytningsrepetition (i ApcMin/+ finns det ingen); adenom i dessa möss upptäcks tidigare, har allvarligare dysplasi och är större (Pollard et al., 2009) jämfört med ApcMin/+-möss. Tidpunkten för Apc-funktionsförlust kan också vara viktig; till exempel leder stegvis Apc-förlust med hjälp av Apc(Min/CKO) eller Apc(1638N/CKO) till grovt synlig neoplasi i tarmen, medan samtidig förlust leder till dold klonalexpansion genom kryptfission utan morfologisk omvandling (Fischer et al., 2012). Deletion av hela Apc-genen i ApcΔel-15-musen ger snabbare tumörutveckling jämfört med Apc-trunkering, med minskad överlevnad, allvarligare polypos och mer avancerad kolon-tumörprogress jämfört med ApcMin/+-möss (Cheung et al,

Genetiskt förändrade råttmodeller med Apc-mutation finns också tillgängliga och är tilltalande på grund av modellernas livslängd och den relativa lättheten att utföra koloskopi, vilket möjliggör longitudinella experiment (tabell 2). De vanligaste är Kyoto Apc Delta (KAD)-råttan och Pirc-råttan. KAD-råttan härstammar från ENU-mutationer och har en nonsensmutation vid kodon 2523 i exon 15 av Apc, vilket ger ett trunkerat protein. Dessa råttor är livskraftiga i homozygot tillstånd och utvecklar inte spontant tarmtumörer. Behandling med azoxymetan och dextransulfatnatrium (AOM/DSS) är nödvändig för att framkalla tarmneoplasi. Pirc-råttan, som också framställs genom ENU-inducerad mutagenes, har en Apc-mutation vid nukleotid 3409, vilket ger ett trunkerat protein. Denna mutation är embryonalt dödlig i homozygot tillstånd. Mutationen har 100 % penetrering och alla råttor utvecklar kolonpolyper efter 4 månaders ålder.

En genetiskt förändrad grismodell som bär på en APC 1311-mutation, som är ortolog till människans APC 1309, har utvecklats. Dessa djur utvecklar aberrant crypt foci, enstaka krypt adenom och multipla kolorektala adenom, som liknar mänsklig FAP. De större adenomen uppvisar progression i form av höggradig dysplasi. Ytans involvering, som liknar mänskliga adenom (Flisikowska et al., 2012), är karakteristisk.

Modifierare av cancerfenotyper

Stamskillnader har länge erkänts ha en betydande effekt på tumörbördan i ApcMin+/–modellen, som vanligen upprätthålls på en C57Bl/6J-bakgrund. Korsning av B6 Min/+ möss med AKR och andra inavlade stammar resulterade i en minskning av det genomsnittliga tumörantalet hos F1-mössen (Shoemaker et al., 1997). Backcrossing-experiment och andra genetiska analyser för att kartlägga modifierande loci har gett upphov till ett antal kandidatgener för Modifier of Min (Mom) (McCart et al., 2008). Dessutom har kosten och muskolonins tarmmikrobiom viktiga effekter på polypernas mångfald, utveckling och storlek. Till exempel har en västerländsk diet med hög fetthalt och låg fiberhalt visat sig öka antalet polyper och tumörprogressionen hos ApcΔ716/+-möss (Hioki et al., 1997).

Patologi

Morfologin hos tarmlesioner i ApcMin+/och besläktade modeller är likartad hos modellerna, även om åldern för debut, graden av dysplasi och fördelningen i mag-tarmkanalen varierar (tabell 1). De tidigast igenkännbara lesionerna består av en enda förstorad krypt eller ett litet kluster av kryptor som kantas av trånga celler med ökat förhållande mellan kärnor och cytoplasma och nukleär hyperkromasi (fig. 1). Dessa tidiga lesioner är låggradiga dysplastiska lesioner som liknar små tubulära kolonadenom som ses hos patienter med FAP. I tunntarmen utvecklas en liten invagination i lamina propria i den proliferativa zonen vid korsningen mellan kryptan och villan (fig. 2). De adenomatösa cellerna tränger in i lamina propria och upp i villus och bildar ett dubbelt lager adenomatöst epitel under en normal ytslemhinna (fig. 3). I tjocktarmen invaginerar de tidiga adenomen in i lamina propria mellan kryptorna, även om adenom i enskilda kryptor också kan identifieras (Oshima et al., 1997). Immunohistokemi för beta catenin kan användas för att hjälpa till att identifiera tidiga adenom, eftersom även enstaka kryptoadenom i ApcMin+/- och besläktade modeller uppvisar ackumulering av nukleärt beta catenin (Fig. 4).

När adenomen växer bildar de polypoida, pedunkelformade eller ibland skålformade lesioner med ett nedtryckt centrum (Fig. 5a och b). I många modeller utvecklas adenomen inte längre än till låggradig dysplasi. I modeller med längre livslängd och färre tumörer utvecklar vissa dock höggradig dysplasi som kännetecknas av kribriform arkitektur, där inte alla celler är i kontakt med ett basalmembran (fig. 6). Många mitotiska figurer och apoptotiska kroppar är vanliga i adenom i alla utvecklingsstadier.

Den tarmneoplasma som uppstår i ApcMin+/- och relaterade modeller innehåller flera olika celltyper, men består främst av celler av absorptiv typ och goblettceller (tabell 3). Adenom som uppstår i tunntarmen hos i ApcMin+/- och besläktade modeller innehåller Paneth-celler som lätt identifieras på hematoxylin- och eosinfärgning (fig. 7) och framhävs med immunohistokemi för lysozym. Det har visats att de utgör 10 % eller mindre av cellerna i tunntarmsadenom (Moser et al., 1992). Musens kolon innehåller inte Paneth-celler, men lysozymuttryckande celler som saknar PAS-positivitet har identifierats i kolonadenom i dessa modeller, vilket tyder på en Paneth-cell-liknande differentiering även i koloniska lesioner (Moser et al., 1992; Husoy et al., 2006). Neuroendokrina celler utgör en liten andel av cellerna i adenom av ApcMin+/–typ, men den specifika celltypen återspeglar de neuroendokrina celler som finns i normal tarmslemhinna på platsen för adenomet (Moser et al., 1992). Serotoninuttryckande celler är till exempel de vanligaste neuroendokrina cellerna i musentarm och finns överallt; sådana celler utgör upp till 5 % av ApcMin+/- adenomcellerna, i lesioner från tunntarm och tjocktarm (Moser et al., 1992). PYY-positiva celler finns däremot endast i adenom från den distala tjocktarmen, vilket återspeglar fördelningen av dessa celler normalt. Neuroendokrina celler är diffust utspridda i adenomen och bildar inte små kluster som de lysozympositiva cellerna (Moser et al, 1992).

Dysplasi i tarmadenom i musmodeller bör graderas med hjälp av samma terminologi (låggradig dysplasi, höggradig dysplasi, intramukosalt karcinom) och kriterier som för humana kolorektala adenom (Washington et al., 2013). De flesta adenom i ApcMin+/–musen och relaterade modeller uppvisar låggradig dysplasi, men många blir progressivt större när musen åldras, och ett fåtal utvecklas längs sekvensen adenom-karcinom. Invasiva karcinom är sällsynta, eftersom de flesta möss dör av anemi eller intussusception innan de utvecklas. Några av de modeller som lever längre och har färre adenom utvecklar dock adenokarcinom som invaderar submucosan (Colnot et al., 2004; Fodde et al., 1994; Robanus-Maandag et al., 2010). Metastasering förekommer inte i ApcMin+/- möss och är ytterst sällsynt i besläktade modeller (Fodde et al., 1994).

Kirurgiska patologer som ombeds att analysera tarmprover bör vara medvetna om en fallgrop vid bedömning av tumörinvasion i musmodeller. Eftersom skikten i musens tarm är tunna och känsliga är herniation av godartat epitel i submucosan en vanlig företeelse (Boivin et al., 2003), särskilt i samband med rektal prolaps och vid inflammatoriska tillstånd (fig. 8a och b). Liknande förskjutning av adenomatös mukosa (pseudoinvasion) förekommer vid pedunkulerade kolorektala adenom hos människor och vid colitis cystica profunda. Konsensusriktlinjer för att skilja mellan herniation och invasivt adenokarcinom utarbetades vid en workshop om musmodeller för intestinala neoplasier vid Jackson Laboratories år 2000 av en panel av forskare och patologer (Boivin et al., 2003) och sammanfattas i tabell 4. Det är kanske inte möjligt att diagnostisera invasivt karcinom med säkerhet, särskilt i inflammatoriska modeller eller områden med prolaps, och utvärdering av äldre möss med bättre utvecklade lesioner kan vara nödvändig för en slutgiltig bestämning av invasion.

Invasion i lamina propria kännetecknas av utvecklingen av kantiga kryptprofiler med enskilda infiltrerande celler och kan åtföljas av stromala förändringar som desmoplasi och ökad inflammatorisk celltäthet (Fig. 9a och b).

.