Apocynin, en lågmolekylär oral behandling av neurodegenerativa sjukdomar

Det kan tänkas att komponenter i kemiskt komplexa växtextrakt kan störa avläsningsanalysen på flera olika nivåer och även utöva ospecifika effekter, t.ex. dödande av PMN eller rening av oxyradikaler. Detta innebär att en framgångsrik aktivitetsstyrd rening måste vara väl fokuserad och noggrant kontrollerad med avseende på ospecifika effekter för att undvika falskt positiva resultat. Trots dessa hinder kunde vi påvisa en mycket specifik aktivitet hos apocynin i testet. Apocynin visade sig vara metaboliskt aktiverat i en MPO-katalyserad reaktion med H2O2 som bildar en symmetrisk dimer, diapocynin (figur 2). Observationen att reaktionsintermediären kunde fångas in med GSH ledde oss till hypotesen att metaboliskt aktiverat apocynin kan blockera bildandet av tiolbryggor mellan de membranbundna och cytosoliska komponenterna som bygger upp funktionell Nox2. Det visade sig dock senare att diapocynin direkt hämmar Nox2 superoxidproduktion och att denna aktivitet är oberoende av MPO . Ett viktigt resultat med apocynin har varit att det hämmar PMN:s oxidativa explosion utan att hindra den intracellulära avdödningen av bakterier. Detta innebär att behandling med apocynin kan förhindra kollaterala skador på vävnader som infiltreras av aktiverade PMN utan att hindra deras bakteriedödande funktion.

Figur 2

Hämning av mikroglia Nox2 av metaboliskt aktiverat apocynin. Receptormedierad aktivering av mikrogliaceller inducerar produktion av reaktiva syrearter och frisättning av myeloperoxidas (MPO). Den MPO-katalyserade reaktionen av apocynin med H2O2 leder till produktion av en reaktiv intermediär som stabiliseras genom bindning till fria tiolgrupper, till exempel GSH, eller genom dimerisering. Dimeriskt apocynin (diapocynin) hämmar Nox2-aktiviteten.

3. Apocynins effekt i AIMID-djurmodeller

Den första målsjukdomen där vi testade apocynins kliniska effekt var WAG/Rij (RT-) råttmodellen för kollageninducerad artrit (CIA), som är en accepterad preklinisk modell för den autoimmuna inflammatoriska sjukdomen (AIMID) reumatoid artrit (RA). I denna modell har PMN en tydlig patogen roll, vilket återspeglar situationen hos RA-patienter. I råttstudien valde vi att administrera apocynin i ett dosintervall på 0,3 till 200 μg/mL dricksvatten, som tillhandahölls ad libitum. Det observerades att redan vid den lägsta dosen på 0,3 μg/mL, som motsvarar en daglig oral dos på 6 μg, undertrycktes artrit nästan helt . Ingen effekt av apocynin på serumnivåerna av antikollagena autoantikroppar eller IL-6, ett viktigt patogent cytokin vid CIA och RA, observerades, vilket tyder på hög selektivitet för den inflammatoriska komponenten av sjukdomen. Oberoende av oss har Hougee et al. i en CIA-modell för mus visat att apocynin som administreras oralt återställer den blockerade produktionen av broskproteoglykan i den artritiska leden. En fascinerande bieffekt av behandlingen, som illustrerar apocynins kraftfulla antiinflammatoriska effekt, var det dramatiska undertryckandet av de nekrotiserande hudförändringarna på de ställen där det immuniserande antigenet/CFA-formuleringen injicerades .

Sedan dess första identifiering som potent antiinflammatoriskt medel 1990 har apocynin blivit en etablerad hämmare av oxidativ explosion i neutrofiler, vilket har visats i ett stort antal in vivo-modeller för immunmedierade inflammatoriska sjukdomar som påverkar perifera och centrala organ. Av särskild betydelse för denna översikt är de lovande kliniska effekter som observerats i modeller av neurodegenerativa sjukdomar, inklusive ALS, Alzheimers och Parkinsons sjukdom. I dessa modeller är apocynins antioxidativa aktivitet inte riktad mot neutrofilerna utan mot ”hjärnans makrofager”, det vill säga mikroglia.

4. Mikroglia

Hjärnan innehåller olika celltyper med förmåga att utöva immunfunktioner, bland annat astrocyter, mikrogliaceller och makrofager som är lokaliserade i hjärnhinnorna och de perivaskulära utrymmena i hjärnans artärer och kapillärer . För sina immunförsvarsuppgifter är dessa celler utrustade med bevarade receptorer för patogenassocierade eller skadeassocierade molekylära mönster, som vidarebefordrar aktiveringssignaler till cellerna för att inducera inflammatoriska effektormekanismer .

Mikroglia är medfödda immunceller som är allmänt spridda i det centrala nervsystemet, där de är engagerade i ett nära samspel med neuroner, oligodendrocyter och astrocyter. Det är dock endast mikroglia som frigör MPO efter stimulering, vilket är en förutsättning för metabolisk aktivering av apocynin.

Mikroglia i det friska CNS har en förgrenad vilofenotyp. I motsats till tidigare föreställningar är mikroglia i den friska hjärnan inte vilande utan mycket dynamiska celler som utför homeostatisk övervakning av den extracellulära miljön genom att utvidga och dra tillbaka sina utskjutande delar och fagocytos av vävnadsrester, som annars skulle kunna orsaka inflammation . Aktiverade mikroglior finns i sjuklig CNS-vävnad, t.ex. i demyeliniserad kortikal grå substans i MS-hjärnan, runt amyloidplack i Alzheimers hjärna och i den degenererande substantia nigra i Parkinsons sjukdom . Även om de olika uttrycksprofilerna hos mikroglia tycks återspegla ett brett, kontinuerligt spektrum av aktiveringstillstånd kan två aktiveringstillstånd i båda ändarna av spektrumet identifieras, vilket motsvarar M1- och M2-tillståndet som betecknas för makrofager . ”Klassiskt aktiverade” M1-mikroglia, till exempel inducerade av LPS eller IFNγ, har proinflammatoriska funktioner som utövas genom utsöndring av proinflammatoriska cytokiner som TNF-α, IL-1β och IL-12 och giftiga ämnen som reaktiva syre- och kvävearter. ”Alternativt aktiverade” M2-mikroglia, t.ex. inducerade i en miljö som innehåller höga nivåer av IL-4 eller IL-13, har antiinflammatoriska och vävnadsregenerativa aktiviteter, som förmedlas av cytokiner som IL-4, IL-10 eller TGF-β och reparationsfaktorer som insulinliknande tillväxtfaktor, arginas-1 eller chitinasliknande-1. Inte bara cytokinmiljön utan även redoxtillståndet i mikromiljön, som är direkt kopplat till NADPH-oxidasaktiviteten, bestämmer den funktionella differentieringen av mikroglia mot en M1- eller M2-fenotyp .

5. Apocynin som en potentiell behandling av neurodegenerativa sjukdomar

M1-mikrogliaceller är den huvudsakliga resursen av Nox2 i hjärnan. M1-mikrogliacellernas uttryck av aktiverat Nox2 som producerar ROS är en väsentlig komponent i mikrogliamedierad neurotoxicitet. Den allmänt accepterade uppfattningen att ROS från mikroglia är viktiga mediatorer för neurodegenerativa hjärnskador väcker frågan om apocynins gynnsamma farmakologiska profil och låga toxicitet kan användas för neuroprotektiv behandling. Mikrogliaceller uttrycker inte bara Nox2 utan utsöndrar också MPO efter aktivering och kan därför potentiellt utöva metabolisk aktivering av apocynin. Flera författare har rapporterat om apocynins gynnsamma effekt på (modeller av) akuta neurologiska sjukdomar, såsom ischemi, intracerebral blödning och stroke (granskad i ). Vilka är perspektiven för apocynin vid kroniska neurodegenerativa sjukdomar?

In vitro-studier med odlade mikroglia har involverat Nox2-deriverade ROS i proliferation och funktionell polarisering av mikroglia . Ett avgörande resultat har varit att inhibering av Nox2 främjar alternativ och antiinflammatorisk mikroglia-aktivering under neuroinflammation . Detta innebär att undertryckande av Nox2 med apocynin skulle kunna återställa en sund balans mellan en proinflammatorisk M1- och en antiinflammatorisk/proregenerativ M2-fenotyp hos mikroglia. Andra har visat att apocynin sänker produktionen av IL-1β, TNF-α och kväveoxid av mikroglia och därmed avbryter en självupprättande cykel av skadlig aktivitet. Även om den exakta neurotoxiska mekanismen hos aktiverade mikroglior vid neurodegenerativa sjukdomar fortfarande är osäker, är det också av stort intresse att frisättningen av excitotoxinet glutamat kräver Nox2-aktivitet och att denna kan hämmas av apocynin . Sammantaget tyder dessa uppgifter på en potentiellt gynnsam roll för apocynin vid neurodegenerativa sjukdomar. Faktum är att lovande effekter av apocynin har observerats i musmodeller av några viktiga neurodegenerativa sjukdomar.

Amyotrofisk lateralskleros (ALS, Lou Gehrig-sjukdomen). Amyotrofisk lateralskleros är en vanlig neurodegenerativ sjukdom hos vuxna som drabbar motoriska nervceller. Sjukdomen leder till snabbt framskridande motorisk funktionsnedsättning och död vanligtvis inom 5 år. Hos majoriteten av patienterna är orsaken till sjukdomen okänd, men i en del av fallen har sjukdomen en genetisk orsak, nämligen mutationer i genen för superoxiddismutas-1 (SOD1) . Mutationen ökar den oxidativa stressen genom dysreglerad produktion av superoxidanjoner på grund av minskad dismutation till H2O2. Muterade astrocyter som uttrycker SOD1 är kopplade till ALS-patologin på grund av deras minskade förmåga att absorbera glutamat och/eller genom att de släpper ut neurotoxiska faktorer . Selektivt tystande av muterad SOD1 eller ersättning av muterad mikroglia med vildtypmikroglia i den muterade SOD1-musmodellen pekar starkt på en central patogen roll för mikroglia. Harraz et al. har använt apocynin i munnen för att kontrollera utvecklingen av neurodegeneration i en SOD1-muterad musmodell och har observerat lovande effekter; det observerades att administrering av apocynin i dricksvattnet avsevärt förlängde överlevnaden och fördröjde uppkomsten av motoriska defekter. Denna studie visar att apocynin som administreras oralt kan bygga upp en tillräckligt hög koncentration i CNS-parenkymet för att mildra neurotoxiska nivåer av ROS-produktion. Dessa lovande data kunde dock inte reproduceras i en annan studie med samma muterade musstam.

Alzheimers sjukdom (AD). Alzheimers sjukdom är en åldersrelaterad progressiv neurologisk sjukdom som leder till irreversibel demens. Neuropatologiska kännetecken för Alzheimers sjukdom är senila plack av felveckade och fibrillära amyloid-β-aggregat och intraneuronala trassel av tau-protein i hjärnbarken . Aktiverade mikrogliaceller hittades grupperade runt senila plack som producerar neurotoxiska ämnen som ROS, NO och TNF-α. Aktivering av mikroglia Nox2 av oligomeriskt och/eller fibrillärt amyloid-β och uttryck av aktiverat Nox2 i Alzheimers hjärna har rapporterats.

Lull et al. har testat apocynin i en daglig oral dos av 10 mg/kg via dricksvattnet i en hAPP-transgen musmodell av Alzheimers sjukdom. De observerade hos apocyninbehandlade möss en signifikant minskning av plackstorleken i cortex och hippocampus och en minskning av antalet mikroglia i cortex, men inte i hippocampus. Ett beteendemässigt kännetecken för Alzheimers sjukdom som observerades i denna musmodell, nämligen prestationen i simtestet Morris water maze swim test, som testar det rumsliga minnet som är organiserat i hippocampus, förbättrades dock inte markant av behandlingen. Den begränsade kliniska effekten av apocynin i modellen kan bero på avsaknaden av tydlig neuroinflammation, medan denna är mer framträdande hos AD-patienter, och på grund av att plackbildning inte nödvändigtvis förutsäger kognitiv försämring.

Parkinsons sjukdom (PD). Det patologiska kännetecknet för PD är en progressiv degeneration av dopaminproducerande neuroner i substantia nigra (SN), en pigmenterad struktur som ligger längst ner i mellanhjärnan. Via frisättning av dopamin har SN en central roll i samordningen av olika neurologiska funktioner, inklusive belöning, beroende och rörelse. Den sistnämnda funktionen är särskilt störd vid PD. För att kompensera dopaminförlusten ges en metaboliskt stabil prekursor av dopamin (L-DOPA), vilket hos ett betydande antal patienter orsakar typiska ofrivilliga rörelser som kallas hyperkinetiskt syndrom. Medan orsaken till sjukdomen är okänd hos den stora majoriteten av (sporadiska) PD-patienter, har man hos en liten andel funnit en genetisk orsak, nämligen mutationer i flera gener, bland annat alfa-synuklein, parkin, leukinrikt upprepande kinas 2, PTEN-inducerat putativt kinas 1 och ATP13A2 . Observationen att användare av heroin som förorenats med MPTP utvecklade symtom på PD gjorde det möjligt att skapa en kliniskt relevant djurmodell för PD. Efter omvandling av MPTP till MPP+ genom monoaminoxidas B i astrocyter koncentreras MPP+ i dopaminerga celler genom upptag via den specifika dopamintransportören, där det blockerar komplex I i den mitokondriella andningskedjan. Den efterföljande redoxstressen orsakar bland annat dysreglering av cellulär Ca2+ vilket leder till celldöd. Precis som i ALS och AD har man funnit att neurodegeneration vid PD är förknippad med aktivering av mikroglia Nox2, som tros bidra väsentligt till den patogena processen.

Med hjälp av ett in vitro-system visade Gao et al. att ROS som genereras av mikroglia Nox2 ökar dopaminerga neuroners känslighet för MPP+ . En gynnsam effekt av apocynin på neurotoxiska effekter som förmedlas av mikroglia har visats i en musmodell av PD .

6. Effekten av apocynin i en icke-mänsklig primatmodell för Parkinsons sjukdom

Repetitiv injektion av en låg dos MPTP i vanliga marmosets, en neotropa primat med liten kroppslängd, framkallar en neurologisk sjukdom som närmar sig PD när det gäller klinisk och neuropatologisk presentation. Vi har använt denna MPTP-modell hos fem marmoset-tvillingar för att testa om oralt apocynin också är effektivt hos en högre art . För oral administrering löstes apocynin i arabiskt tuggummi; ett syskon av varje tvilling fick apocynininnehållande tuggummi och det andra fick endast tuggummi. Behandlingen med apocynin (100 mg/kg, TID) inleddes en vecka före PD-induktion med MPTP (1 mg/kg, via subkutan injektion i 8 dagar). Apocynin begränsade den typiska kroppsviktsförlusten i samband med parkinsonsyndromet. Även den motoriska funktionen hos de apocyninbehandlade aporna förbättrades, vilket tyder på en antiparkinsonistisk effekt av apocynin. Dessutom ökade antalet överlevande dopaminneuroner med apocynin, vilket tyder på en neuroprotektiv effekt. Det är anmärkningsvärt att apocynin har en liknande molekylstruktur som homovanillinsyra (HVA), en metabolit av dopamin. En förklaring till apocynins skyddande effekt vid PD kan också vara relaterad till kompensationen av den minskade nivån av den naturligt tillgängliga o-metoxikatekol HVA.

7. Perspektiv för behandling av mänskliga patienter

Apocynin är ett potentiellt attraktivt oralt prodrug på grund av dess låga generella toxicitet och det faktum att dess specifika antioxidativa verkan framkallas efter metabolisk aktivering av MPO-frisättande fagocytiska celler. Säkerhetsdata om apocynin är knapphändiga, men de som finns tillgängliga visar på låg toxicitet och hög stabilitet (delvis granskad i ). LD50 efter oral dosering hos möss har uppskattats till 9 g/kg. Hos råttor återfanns cirka 80 % av intraperitonealt injicerat apocynin vid 120 mg/kg i oförändrad form i ett urinprov som samlades in 20 timmar senare. En intravenös dos av 420 mg/kg apocynin hos möss orsakade minimala tecken på toxicitet .

Såvitt vi vet har apocynin inte testats på patienter med neurodegenerativa sjukdomar hos människa. Peters et al. har dock utvärderat den terapeutiska potentialen hos inhalerat apocynin på ozoninducerad bronkiell hyperreaktivitet för metakolin hos astmapatienter som en modell för inflammatorisk lungsjukdom . Författarna kunde utesluta att apocynin kan fånga upp ozon och drog slutsatsen att effekten var att ROS-produktionen mildrades av PMN och eosinofiler som hade infiltrerat lungan vid ozonexponering.

Musstudierna som diskuteras i denna översikt visar att låga doser av apocynin som administreras via oralt intag når CNS-parenkymet i en tillräcklig koncentration för att hämma microglias oxidativa burst och hämma neurodegeneration. Med hänsyn till den mycket låga systemiska toxiciteten och apocynins mycket specifika verkningsmekanism skulle det vara ett attraktivt perspektiv att testa det terapeutiska värdet vid neurodegenerativa sjukdomar hos människor.

Intressekonflikter

Författarna förklarar att det inte finns några intressekonflikter i samband med publiceringen av denna artikel.

Acknowledgment

Författarna vill tacka Henk van Westbroek (BPRC) för förberedelsen av konstverket.