Aporfinalkaloider från Ocotea macrophylla (Lauraceae)
ARTIGO
Aporfinalkaloider från Ocotea macrophylla (Lauraceae)
Ludy Cristina Pabon*; Luis Enrique Cuca
Departamento de Química, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Bogotá, KR 30 45 03, Colombia. AA 14490
ABSTRACT
Fyra aporfinalkaloider från träet av Ocotea macrophylla (Lauraceae) isolerades och karakteriserades som (S)-3-metoxin-nordomesticin (1), (S)-N-etoxikarbonyl-3-metoxin-nordomesticin (2), (S)-N-formyl-3-metoxin-nordomesticin (3) och (S)-N-metoxikarbonyl-3-metoxin-nordomesticin (4); alkaloiderna 2-4 rapporteras för första gången. De isolerade föreningarnas struktur fastställdes på grundval av deras spektrala data och genom jämförelse av deras spektrala data med värden som beskrivs i litteraturen. Alkaloidfraktionen och förening 1 visade svampdödande aktivitet mot Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici och även förening 1 visade antimikrobiell aktivitet mot Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis samt.
Nyckelord: Ocotea macrophylla; aporfinalkaloider; Lauraceae.
INTRODUKTION
Släktet Ocotea (Lauraceae) omfattar mer än 350 arter som finns på den amerikanska kontinenten och i södra Afrika.1,2 I Colombia finns det 35 Ocotea-arter som är spridda över hela landet, främst i de andinska skogarna.3 Inom den traditionella medicinen har vissa Ocotea-arter visat olika tillämpningar. O. quixos används som desinfektionsmedel, lokalbedövningsmedel och antidiarrémedel.4 O. lancifolia används som antiparasit, och O. caparrapi används för att behandla insektsbett, ormbett, bronkit och cancertumörer.5,6
Kemiskt sett är Ocotea-släktet främst känt som en källa till metaboliter av typen furofuran7 och tetrahydrofuran lignaner,8 bicyklokoktan9 och bensofuran neolignaner,10 och bensylisokinolin11 och aporfinalkaloider.5 I tidigare studier isolerades fyra aporfinalkaloider från trä av Ocotea macrophylla och identifierades som nantenin, glaucin, isocorydin och dehydronantenin.12,13 I denna artikel beskriver vi isolering och strukturbestämning av tre nya aporfinalkaloider 2-4 förutom (S)- 3-metoxin-nordomesticin 1 och rapporterna antibakteriella och svampdödande aktiviteter hos föreningarna.
RESULTAT OCH DISKUSSION
Det etanoliska extraktet från stammen av O. macrophylla utsattes för en syrabasextraktion för att erhålla en alkaloidfraktion, som ytterligare utsattes för fraktionering och rening med kromatografiska metoder vilket ledde till isolering av fyra alkaloider: (S)-3-metoxin-nordomesticin (1), (S)-N-etoxikarbonyl-3-metoxin-nordomesticin (2), (S)-N-formyl-3-metoxin-nordomesticin (3) och (S)-N-metoxikarbonyl-3-metoxin-nordomesticin (4). Strukturerna för alkaloiderna 1-4 visas i figur 1 och spektroskopiska data i tabell 1.
Signalen vid δH 6,30 (1H, s) visade ingen konnektivitet i HMQC-experimentet, vilket tyder på närvaron av en fenolisk OH-grupp, vilket stöds av IR. Analys av HMBC-spektrumet gjorde det möjligt att lokalisera substituenter, enligt de korrelationer som observerades mellan signalerna vid δH 5,94 och 5,95 (för metylendioxygruppen) med signalerna vid δC 145,9 (C-9) och 146.2 (C-10), och dessa två sista signaler med protonerna vid δH 6,70 (H-8) respektive 7,90 (H-11), vilket tyder på närvaron av en metylendioxygrupp vid positionerna 9 och 10 och två vattenväten på den aromatiska ringen i para-orientering. Närvaron av hydroxylgruppen i position 1 bestämdes med hjälp av korrelationer mellan signalerna vid δH 6,30 och δC 116,5, som tilldelas C-11b. Metoxylgruppernas placering i positionerna C-2 och C-3 tilldelades enligt korrelationen mellan vätevägarna vid δH 3,96 och 3,86 med kolvätena vid δC 138,4 (C-2) respektive δC 147,8 (C-3).
Den absoluta konfigurationen av C-6a tilldelades som S, eftersom den har en negativ Bomullseffekt vid 280 nm och en positiv Bomullseffekt vid 240 nm i CD-kurvan.17 Dessutom bekräftades detta av det positiva värdet på den optiska rotationen 25D = +51,7 (c 0,38, CHCl3).18 Därför bestämdes alkaloid 1 som (S)-3-metoxin-nordomesticin, en aporfinalkaloid som tidigare rapporterats från Nectandra sinuata19 som också tillhör familjen Lauraceae. Denna rapport korrigerar och kompletterar spektroskopiska data för denna förening.
Alkaloid 2 erhölls som en gul olja som ger en positiv reaktion på Dragendorff-reagens och dess optiska rotationsvärde var 25D 25D = +33,3 (c 0,60, CHCl3). UV- och IR-spektrumet för 2 liknade det för 1, med undantag för uppkomsten, i båda spektren, av absorptioner på grund av en karbamatgrupp vid 282 nm respektive 1688 cm-1.20 1H- och 13C-NMR-spektren visade en liknande profil som för 1. I 1H-NMR uppträdde två nya signaler vid δH 4,29 (2H, m) och 1,29 (3H, m), samt en förskjutning av signalen H-5, på grund av närvaron av en avprotekterande grupp i närheten. COSY-experimentet visade en korrelation mellan signalerna δH 4,29 och 1,29, vilket indikerar närvaron av en etylgrupp som på grund av sin förskjutning tyder på att den är knuten till en heteroatom. 13C NMR- och DEPT-spektren visade tre nya signaler vid δC 158,8 (C), 61,0 (CH2) och 14,8 (CH3), som är typiska signaler för en etoxikarbonylgrupp som är knuten till en kväveatom. Den absoluta konfigurationen av C-6a bestämdes som S, eftersom den uppvisade samma bomullseffekter som 1. Därför identifierades alkaloidföreningen 2 som (S)-N-etoxikarbonyl-3-metoxinordomesticin. Dess ESIMS-spektrum gav en pseudomolekylär jontopp vid m/z 414 + som motsvarar molekylformeln C22H22NO7, och fragmenteringarna berodde på förlusten av CH3OH och CH3CH2OH vid m/z 382 + respektive m/z 368 +. ESI-spektrumet i negativ jonläge visade toppar vid m/z 412 – och m/z 383 ., varav den sista var förlusten av en etylgrupp. Denna typ av alkaloider med substituenterna N-etoxikarbonyl har isolerats från Lindera angustifolia (Lauraceae).21
Alkaloid 3, erhölls som en gul olja, med ett optiskt rotationsvärde på 25D 25D = +7,5 (c 0,53 CHCl3). IR-spektrumet liknade det för alkaloiderna 1 och 2. Dessutom observerades absorptioner vid 2830, 2700 och 1739 cm-1 som är karakteristiska för formylgruppen. I HRESIMS negativa läge observerades den pseudomolekylära jonen – vid m/z 369.1133, motsvarande molekylformeln C20H20NO6. ESI-MS-spektras negativa jonläge visade förlust av en formylgrupp vid m/z 339 … NMR-profilen liknade den för alkaloiderna 1 och 2. I 1H-NMR framträdde olika signaler som tillhörde en blandning av två isomerer i förhållandet 3:1. Jämförelsen av den största isomeren med alkaloid 1 i NMR visade samma mönster av substitution av den aromatiska ringen, förutom uppkomsten av två nya signaler vid δH 8,25 (1H, s) i 1H och vid δC 161,9 i 13C för formylgruppen till 3. Denna funktionalitet på kvävet ledde till bildning av rotationsisomerer, som tidigare beskrivits för alkaloider med en N-formyl- och N-acetylgrupp.22 Den absoluta konfigurationen bestämdes som S, på samma sätt som för 1 och 2. Därför identifierades denna alkaloid 3 som (S)-N-formyl-3-metoxin-nordomesticin.
Alkaloid 4 erhölls som ett vitt fast ämne med en smältpunkt på 222-223 ºC (MeOH) och med en optisk rotation på 25D 25D = +47,0 (c 0,55 CHCl3). Analysen av NMR-data för 4 visade att den har samma basiska skelett som 2, men att den har en metylester enligt signalerna δH 3,76 (3H, s) och δC 52,6 för 4 i stället för signalerna för etylgruppen i 2. HRESIMS visade en pseudomolekylär jon – vid m/z 398,1233 som motsvarar molekylformeln C22H22NO7. Därför identifierades alkaloiden 4 som (S)-N-metoxikarbonyl-3-metoxin-nordomesticin.
Den svampdödande aktiviteten utvärderades genom skivdiffusionsmetoden mot Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici,23 en fytopatogen svamp som angriper tomatgrödor och orsakar enorma förluster för jordbrukare. Alkaloidfraktionen var aktiv mot F. oxysporum vid 250 μg/μL. Den hämmande aktiviteten mot svampens tillväxt var måttlig vid 5 μg/μL för (S)-3-metoxinordomesticin 1, medan de andra alkaloiderna var ineffektiva, vilket tyder på att närvaron av elektronåterkallande substituenter på kväveatomen minskar den svampdödande aktiviteten.
Om än få utvärderingsrapporter om aporfiners svampdödande aktivitet har man funnit att dessa är aktiva mot arter som Candida albicans,24,25 men inaktiva mot svamppatogener som Cladosporium herbarium.26 Dessa resultat är en ny utvärderingsrapport om svampdödande aktivitet hos dessa alkaloider, där det betonas att typen av substituenter på kvävet hos aporfiner har en effekt på den svampdödande aktivitet de uppvisar.
Den antibakteriella aktiviteten utvärderades med hjälp av radiell diffusionsmetod som rapporterats av Lerhrer27 mot två Gram (+)-standardstammar: Staphylococcus aureus 6538 och Enterococcus faecalis 29212 och tre Gram (-): Escherichia coli 25922 och Salmonella tiphymurium, stammarna MS7953 och 14028s. Alkaloid 1 (2,5 μg) visade antimikrobiell aktivitet mot de båda grampositiva bakterierna som utvärderades med värden på 30 AU enligt tabell 2.
Det har rapporterats för den racemiska blandningen av föreningen 3-metoxinordomesticin, dess aktivitet mot E. coli (MIC= 256 μg/mL) och S. aureus (MIC= 512 μg/mL),28 men i det här fallet är dock förening 1 inte aktiv mot E. coli.
Samma som för den svampdödande aktiviteten visar resultaten att arten av substituenten på kväve påverkar den antibakteriella aktiviteten (tabell 2).
EXPERIMENTAL
Allmänt tillvägagångssätt
Smältpunkten bestämdes med hjälp av Mel-temp Fisher Johns, Laboratory Device. UV-spektra registrerades på en Perkin Elmer Lambda 2S och CD-spektra på en JASCO J-720-spektrometer. IR-spektra togs fram på Perkin Elmer FT-IR Panagon 500 series 1000 som en tunn film. Optiska rotationer registrerades på Schmidt-Haensch polarimeter. 1H (400 MHz) och 13C (100 MHz) NMR-spektra samt 2D-spektra (COSY, HMQC och HMBC) utfördes på en Bruker Avance 400 MHz-spektrometer med CDCl3 som intern referens. HRMS bestämdes på ett Shimadzu LCMS-IT-TOF-masspektrometersystem med ESI i positivt jonläge och negativt jonläge. Kolonnkromatografi (CC) utfördes med kiselgel (70-230 och 230-400 mesh, Merck) och analytisk kromatografi utfördes med kiselgel 60 PF254 (0,25 mm).
Plantmaterial
Stjälkarna av O. macrophylla samlades in i juli 2006 i Nocaima, Colombia av W. Delgado. Det botaniska exemplaret identifierades av A. Jara, och ett voucher-exemplar (COL-517191), och deponerades i Colombias nationella herbarium vid Colombias nationella universitet, Bogotá, Colombia.
Extraktion och isolering
Torkade och drivna stammar (2,0 kg) av Ocotea macrophylla extraherades med EtOH genom maceration i rumstemperatur och koncentrerades i vakuum för att få ett extrakt (102,6 g). Ett prov (48,9 g) av detta extrakt löstes upp i vatten med hjälp av ultraljud och syresattes med 5 % HCl till pH 2,0. Den sura suspensionen filtrerades sedan och basifierades med 20 % NaOH till pH 8,0 och extraherades därefter med kloroform. Kloroformfraktionen (3,01 g) utsattes för kolonnkromatografi med kiselgel och eluerades med en gradient av petroleumeter:AcOiPr (4:6 till 0:10) och AcOiPr:MeOH (10:0 till 0:10), varvid fyra fraktioner (I-IV) erhölls. Fraktion I (347 mg) kromatograferades upprepade gånger med kolonn (CC) på kiselgel och eluerades med n-hexan:AcOiPr (9:1-8:2), CHCl3 och Tol:AcOiPr 7:3. Detta gav alkaloiderna 1 (7 mg) och 2 (4 mg). Fraktion II (250 mg) genomgick kolonnkromatografi på kiselgel och eluerades med CHCl3:AcOEt (85:15) och genomgick sedan CC på Sephadex LH-20 (CH3OH) för att ge alkaloid 3 (8 mg). Fraktion IV (1433 mg) renades genom upprepad kolonnkromatografi på kiselgel med CH2Cl2:MeOH 97:3 och CH2Cl2 som elueringssystem. Slutligen gav successiva tvättar med MeOH alkaloid 4 (98 mg).
Antifungal assay
F. oxysporum erhölls från kultursamlingen vid universitetet i Cundinamarca (Department of Agronomy, Laboratory of Phytopathology). PDA användes som medium för analyser av svampdödande aktivitet. Kulturmediet inokulerades med 100 μL av en lösning med 105 sporer. Proverna bereddes i lösningar med olika koncentrationer, motsvarande 50, 25 och 10 μg/μL av alkaloidfraktionen och 5, 2,5 1,0, 0,5, 0,2 och 0,1 μg/μL av de rena alkaloiderna. Tio mikroliter av proverna applicerades på filterpappersskivorna och placerades på det inokulerade mediet. Plattorna förseglades och lämnades i en inkubator i 3 dagar vid 25 °C. Tydliga zoner som uppstod mot en växande svamp angav den minimala mängd fraktion eller alkaloid som krävdes för att hämma svampens tillväxt. Tre upprepningar gjordes för varje behandling. Benomyl (bensimidazol – 5 μg) användes som positiv kontroll och aceton fungerade som negativ kontroll.23
Antibakteriella analyser
Den antibakteriella aktiviteten utvärderades med hjälp av en radialdiffusionsmetod som anpassats till den metodik som Lehrer tidigare publicerat.27 Föreningarna utvärderades mot två Gram (+)-stammar: Staphylococcus aureus ATCC 6538 och Streptococcus fecalis ATCC 29212 och tre Gram (-) stammar: Escherichia coli ATCC 25922 och Salmonella tiphymurium, ATCC 14028s och Salmonella tiphymurium MS7953. En isolerad koloni från varje stam deponerades i 3 ml soja-tryptikas (TSB) för Gram (+)-stammar och Luria-broth (LB) för Gram (-)-stammar och inkuberades vid 37 °C under omrörning tills mikroorganismerna befann sig i den logaritmiska fasen. Supernatanten avlägsnades och det erhållna sedimentet åter suspenderades i fosfatbuffert (PBS), följt av tvättar med PBS och centrifugering. Slutligen återuppslammades sedimentet i PBS och den optiska densiteten bestämdes i 620 nm för att beräkna antalet CFU (kolonibildande enheter) per milliliter. Det sprids en viss volym som innehåller 4 x 107 CFU i varje skål. Den uppmätta volymen blandades och homogeniserades i 15 ml agaros som smältes till mer eller mindre 45 °C. Denna bakteriesuspension serverades i petriskålar och lämnades för att stelna vid rumstemperatur, varefter gjordes av hål med 2 mm diameter med en steril stans.
Testproverna framställdes genom att 1 mg av den rena föreningen löstes upp i 500 μL DMSO, som placeras 8 μL av provet i två exemplar och inkuberades vid 37 °C i 30 min. Efter denna tid tillsattes näringsmediet, som innehåller smält agar agar och TSB, inkuberades i 18 timmar vid 37 ºC och därefter mättes diametern på hämmande zoner med hjälp av föreningens aktivitet. Positiva kontroller som användes var olika antibiotika, Ampicillin (50 mg/ml), Kanamycin (10 mg/ml) och Tetracyklin (4,12 mg/ml) i en utspädning 1:100 i PBS och som negativa kontroller användes DMSO och PBS, varje kontroll 8 μL i varje brunn. Hämningszonernas diametrar mättes i millimeter och resultaten rapporterades som verksamhetsenheter enligt förhållandet som stipulerar att 1 verksamhetsenhet (Unit of Action (UA)) är lika med 0,1 mm av hämningszonen.
SUPPLEMENTARISKT MATERIAL
ÅTERKÄNNANDE
Författarna vill tacka Colombias nationaluniversitet för det ekonomiska stödet till detta projekt. Även laboratoriet för nukleär magnetisk resonans och masspektrometrilaboratoriet tackas för deras stöd vid inspelning av NMR-spektra och HR-ESI-MS respektive. Författarna vill dessutom tacka Javeriana-universitetet för de optiska rotationerna, FIDIC (Foundation Institute of Inmunology of Colombia) för inspelning av CD-spektra och särskilt professor J. M. Lozano för analyser av antibakteriell aktivitet.
1. Takaku, S.; Haber. W.; Setzer, W.; Biochem. Syst. Ecol. 2007, 35, 525.
2. Guerrini, A.; Sacchetti, G.; Muzzolli, M.; Moreno, G.; Medici, A.; Besco, E.; Bruni R.; J. Agric. Food Chem. 2006, 54 , 7778.
4. Ballabeni, V.; Tognoli, M.; Bertoni, S.; Bruni, R.; Guerrini, A.; Moreno, G.; Barocelli, E.; Pharmacol. Res. 2007, 55, 23.
5. Fournet, A.; Ferreira, M.; Rojas, A.; Guy, I.; Guinaudeau, H.; Heinzen, H.; Fitoterapia. 2007, 78, 382.
6. Palomino, E.; Maldonado, C.; J. Nat. Prod. 1996, 59, 77.
7. Marques, R.; Batistuzzo, S.; Silva, C.; Barbosa, J.; Fassarella, L.; Mutat. Res. 2003, 536, 117.
8. López, H.; Valera, A.; J. Nat. Prod. 1995, 58, 782.
9. Zschocke, S.; Staden, J.; Paulus, K.; Bauer, R.; Horn, M.; Munro. O.; Brown N.; Drewes, S.; Phytochemistry 2000, 54, 591.
10. Lordello, A.; Yoshida, M.; Phytochemistry 1997, 46, 741.
11. Silva, I.; Barbosa, J.; Silva, M.; Lacerda C. da-Cunha, E.; Biochem. Syst. Ecol. 2002, 30, 881.
12. Franca, N.; Giesbrecht, A.; Gottlieb, O.; Malgalhaes, A.; Malgalhaes, E.; Maia, J.; Phytochemistry 1975, 14, 1671.
13. Warrumby, S.; Lordello, A.; Quim. Nova 2007, 30, 92.
14. Wu, Y.; Chao, Y.; Chang, F.; Chen, Y.; Phytochemistry 1996, 46, 181.
15. Mathouet, H.; Elomri, A.; Lameiras, P.; Daich, A.; Vérité, P.; Phytochemistry 2007, 68, 1813.
16. Tantisewie, B.; Pharadai, T.; Pandhuganont, M.; Guinaudeau, H.; Freyer, A.; Shamma, M.; J. Nat. Prod. 1989, 52, 652.
17. Ringdahl, B.; Chan, R.; Craig, J.; J. Nat. Prod. 1981, 44, 80.
18. Nishiyama, Y.; Moriyasu, M.; Ichimaru, M.; Iwasa, K.; Kato, A.; Mathenge, S.; Chalo, P.; Juma, F.; Phytochemistry 2006, 67, 2671.
19. Castro, O.; Hasbun, C.; Calderon, M.; Fitoterapia 1991, 62, 72.
20. Chen, Y.; Chang, F.; Wu, Y.; J. Nat. Prod. 1996, 59, 904.
21. Zhao, O.; Zhao, Y.; Wang, K.; J. Ethnopharm. 2006, 106, 408.
22. Chang, F.; Wei, J.; Teng, C.; Wu. Y.; J. Nat. Prod. 1998, 61, 1457.
23. Gomez, Y.; Gil, K.; González, E.; Farías, L.; Rev. Biol. Biol. Trop. 2007, 55, 767.
24. Kuo, R.; Chang, F.; Chen, C.; Teng, C.; Yen, H.; Wu. Y.; Phytochemistry 2001, 57, 421.
25. Agnihotri, V.; ElSohly, H.; Khan, S.; Jacob, M.; Joshi, V.; Smillie, T.; Khan, I.; Walker, L.; Phytochem. Lett. 2008, 1, 89.
26. Ma, W.; Fukuski, Y.; Tahara, S.; Osawa, T.; Phytotherapy 2000, 71, 527.
27. Lerhrer R.; Rosenman, M.; Harwig. S.; Jackson, R.; Eisenhaver, P.; J. Inmunol. Metoder. 1991, 137, 167.
28. Nimgirawath, S.; Udomputtimekakul, P.; Taechowisan, T.; Wanbanjob, A.; Shen Y.; Chem. Pharm. Bull. 2009, 57,
Received 26/6/09; accepted 6/11/09; published on the web 10/3/10
* email: [email protected]
TILLÄGGSMATERIAL
