Beta-Galactosidase Assay (A better Miller)

tillbaka till protokoll

Bakgrund

β-Galaktosidas kodas av lacZ-genen i lac-operonet i E. coli. Det är ett stort (120 kDa, 1024 aminosyror) protein som bildar en tetramer. Enzymets funktion i cellen är att klyva laktos till glukos och galaktos så att de kan användas som kol-/energikällor. Den syntetiska föreningen o-nitrofenyl-β-D-galaktosid (ONPG) känns också igen som substrat och klyvs för att ge galaktos och o-nitrofenol som har en gul färg. När ONPG är i överskott jämfört med enzymet i en reaktion är produktionen av o-nitrofenol per tidsenhet proportionell mot koncentrationen av β-galaktosidas; produktionen av gul färg kan således användas för att bestämma enzymkoncentrationen.

Så, varför bryr vi oss? Vanligtvis utformas experiment så att β-galaktosidaskoncentrationen i cellen är en avläsning för någon aspekt av ett system som studeras. En forskare kan till exempel fusionera en promotor till lacZ-genen och använda β-Gal-nivåerna som en avläsning för promotoraktivitet under olika förhållanden. År 1972 publicerade Jeffrey Miller ”Experiments in Molecular Genetics” som innehöll ett protokoll för att bestämma mängden β-Gal med ONPG. På grund av detta kallas ONPG/β-Gal-analyser för Miller-analyser, och en standardiserad mängd β-Gal-aktivitet är en Miller-enhet.

1 Miller-enhet = \displaystyle{ 1000 * \frac{(Abs_{420} – (1.75*Abs_{550}))}{(t * v * Abs_{600})} }

där:

• Abs420 är absorbansen av den gula o-nitrofenolen,
• Abs550 är spridningen från cellrester, som när den multipliceras med 1.75 approximerar spridningen som observeras vid 420nm,
• t = reaktionstid i minuter,
• v = volymen av den analyserade kulturen i milliliter,
• Abs600† återspeglar celldensiteten.

†Observera att detta värde är olika för varje spektrofotometer som används och bör kalibreras genom att utplanta utspädningar av kända Abs600-kulturer för att bestämma de kolonibildande enheterna per Abs600.

I sin bok beskriver dr. Miller förklarar att denna formel ger ungefär 1 Miller-enhet för oinducerad E. coli (låg β-Gal-produktion) och ungefär 1000 enheter för en fullt inducerad kultur (odlad på laktos eller IPTG).

Enligt min erfarenhet har kulturer av MG1655 inducerade med 1 mM IPTG i logfas 1500-1800 Miller-enheter. Orsaken till skillnaden är inte känd, men jag misstänker att den beror på skillnader i Abs600/celltäthet mellan Dr. Millers spektrofotometer och den jag använder och det faktum att jag utför mina Miller-analyser vid 30 °C (för enkelhetens skull) medan Dr. Miller utförde sina analyser vid 28 °C. Jag har gjort promotorfusioner som genererar ~40 000 Miller-enheter, men som kommer att diskuteras nedan är detta för högt för assayet och därför ändrades protokollet för att sänka detta värde.

Protokoll

Protokollet som jag använder härstammar från en artikel av Zhang och Bremer (JBC 270, 1995, Free full text!) där det ursprungliga Miller-protokollet förenklades kraftigt för att göra det möjligt att mäta fler prover med mindre manipulation.

I korthet består protokollet av att mäta celltätheten hos en bakteriekultur (Abs600), sedan ta bort en alikvot av cellerna från kyvetten och blanda dem med en ”permeabiliserings”-lösning som innehåller ett detergent som bryter upp cellmembranen (men lämnar β-Gal intakt). Detta dödar cellerna och stoppar översättningen. Efter inkubation tillsätts en ONPG ”substrat”-lösning och den gula färgen får utvecklas. En ”stop”-lösning tillsätts sedan och absorbansen av o-nitrofenol mäts.

1. Väx upp kulturer under de förhållanden som du vill testa.
2. Under tillväxten förmätar du i förväg 80 μL alikvot av permeabiliseringslösningen i 1.5 mL mikrofuge-rör och stäng dem.
3. Mät Abs600 och REGISTRERA DET!
4. Ta bort en 20 μL alikvot av kulturen och tillsätt den till 80 μL permeabiliseringslösning.

Provet är nu stabilt i flera timmar. Detta gör det möjligt att utföra tidsförloppsexperiment.

1. När det sista provet har tagits flyttar du proverna och substratlösningen till det 30 °C varma rummet i 20-30 minuter.
2. Häll 600 μL substratlösning i varje rör och notera tiden för tillsättning.
3. När tillräckligt med färg har utvecklats, häller du till 700 μL stopplösning, blandar väl och NOTERAR STOPTIDEN.
4. När du har stoppat det sista provet (vissa kan ta längre tid än andra, men i allmänhet är de klara på 30-90 minuter), överför rören till en mikrofuge och centrifugera i 5-10 minuter vid full hastighet.
5. Ta försiktigt bort rören från centrifugen och överför lösningen från rörens översta del till din(a) kyvett(er). Du försöker undvika att ha partikulärt material i kyvetten så att spridningen inte påverkar avläsningen.
6. Registrera Abs420. Denna bör vara mindre än 1 och större än 0,05. Om den ligger en bit utanför detta intervall ska du inte oroa dig.

Beräkna Miller-enheterna på följande sätt:

\displaystyle{ 1000 * \frac{(Abs_{420})}{((Abs_{600} \text{{av kultur som provtagits})*(\text{volym } )*(\text{reaktionstid}))} }

Kommentarer till analysen

• Reshma 11:28, 15 oktober 2007 (CDT): Miller rekommenderar en odling med OD600 = 0,28 till 0,70. Han hävdar dock att man även kan använda kulturer över natten men att exponentiellt växande celler ger mer exakta analyser .

• När sker reaktionen? Jag har aldrig hittat något bra svar på detta i litteraturen. Om jag lät en reaktion gå till slut uppmätte jag ett Abs420 på ~2-3. Detta ligger naturligtvis utanför spektrofotometerns tillförlitliga område, men det ger en indikation på hur långt reaktionen kan gå. Jag fick reproducerbara data när den gula färgen var precis påvisbar innan stopplösningen tillsattes upp till ungefär samma färg som LB-buljong innan stopp. Kom ihåg att du behöver substratet för att mätta enzymet under reaktionens gång, så låt dem inte gå för långt. Jag gör rutinmässigt tre separata mätningar för varje kultur och tar ett genomsnitt av dem.
  • Reshma 11:28, 15 oktober 2007 (CDT): Miller rekommenderar att OD420nm-avläsningen helst ska vara 0,6-0,9 .

• Frekvent använder folk engångskuvetter av plast för att mäta både kulturens turbiditet och den gula o-nitropenolen. Min erfarenhet är att engångskuvetter har en HORRIKEL optik: ja, de är klara, men ljusbanan är patetiskt förvrängd (titta bara genom en av dem på ett avlägset objekt). Detta är inget stort problem om samma kuvett används för blankprov och prov och om den är orienterad på samma sätt i spektrofotometern. Problemet uppstår när många olika prover mäts i olika kuvetter. Värdena kan variera STORT även för samma kultur som mäts i olika kyvetter. Jag rekommenderar att man antingen använder en glas- eller kvartskuvett av hög kvalitet eller att man mäter proverna i en plattläsare med platta 96-brunnsplattor med platt botten. Jag har funnit att mitt fel när jag pipetterade 150 μL kultur för Abs600-mätningar var MYCKET mindre än när jag använde engångskuvetter. Naturligtvis bör den uppmätta turbiditeten kalibreras till celler/mL som med en 1 cm cuvette.

• Om du snurrar proverna och försiktigt tar bort ett prov från supernatanten undviker du att behöva mäta spridningen vid 550nm och gissa vad den skulle vara vid 420nm.

• Om reaktionen har för mycket β-Gal kommer röret att gulna inom några minuter (eller till och med sekunder). Detta är för snabbt. Ett av de största bidragen till felet kommer att vara din uppskattning av reaktionstiden. Genom att ha reaktionsförhållandena inställda så att det tar ungefär en timme blir tidsfelen obetydliga. Om du behöver fördröja reaktionen kan du använda färre celler och öka mängden permeabiliseringsbuffert så att volymen fortfarande är 100 μL. Alternativt kan du omkonstruera den ribosombindande platsen i din β-Gal-konstruktion för att försvaga den. Jag upptäckte att om mina celler tillverkade 40 000 Miller-enheter av β-Gal blev de väldigt sjuka av översättningsstressen. Det var i detta fall bättre att försvaga översättningen av β-Gal mRNA:t.
  • Jag gör dessa reaktioner som jag gör enzymkinetik. Jag startar proverna med 10 sekunders mellanrum (med tiden som räknas upp) så det är möjligt att få exakta reaktionstider även om du bara låter dina reaktioner pågå i några minuter. Jag får mycket reproducerbara resultat med reaktionstider på 1,5-30 minuter. När du väl har fått en känsla för hur lång tid dina reaktioner kommer att ta är det lätt att gruppera prover som kommer att behöva samma reaktionstid. Genom att göra varje prov i tre exemplar får du ett visst förtroende för att din tidsåtgång är reproducerbar.–Kathleen 16:43, 14 december 2005 (EST)

• Här är ett exempel på några faktiska data som jag har fått med den här analysen. Det var ett tidsförloppsexperiment. Vid varje tidpunkt tog jag ut 1 mL från var och en av mina kulturer, mätte OD600, tog tre alikvenser på 20 µL direkt från kyvetten och tillsatte var och en till 80 µL permeabiliseringslösning. Jag utförde analysen exakt enligt beskrivningen ovan, och alla prover förvarades i rumstemperatur tills tidsförloppet var avslutat. OD600 för dessa kulturer varierade från 0,4 till 4 (i min spec) under experimentets gång och reaktionstiderna för β-Gal-analyserna varierade från 2-25 min. De tre enskilda β-Gal-analyserna för varje tidpunkt för varje kultur (röda eller svarta symboler) är plottade i diagrammet för att illustrera analysens reproducerbarhet inom varje experiment.Kathleen

Recept

Permeabiliseringslösning

Du behöver 80 μL per prov.

• 100 mM dibasisk natriumfosfat (Na2HPO4)
  • (Zhang-protokollet har 200 mM natriumfosfat. Jag kunde aldrig få detta i lösning med de andra komponenterna, oavsett vad jag försökte, så jag backade ner det till 100 mM. Jag har till och med använt 50 mM utan någon påvisbar förändring.)
• 20 mM KCl
• 2 mM MgSO4
• 0,8 mg/mL CTAB (hexadecyltrimetylammoniumbromid)
• 0.4 mg/mL natriumdeoxycholat
• 5,4 μL/mL beta-mercaptoetanol

Substratlösning

Du behöver 600 μL per prov.

• 60 mM Na2HPO4
• 40 mM NaH2PO4
• 1 mg/mL o-nitrofenyl-β-D-Galaktosid (ONPG)
• 2.7 μL/mL β-mercaptoethanol

(Zhang-protokollet har också 20 μg/mL CTAB och 10 μg/mL deoxycholat. Jag utelämnar dessa med tanke på att det fortfarande finns mycket från permeabiliseringslösningen och att om de inte är döda än så kommer de inte att bli det.)

Stopplösning

Du behöver 700 μL per prov.

• 1 M natriumkarbonat (Na2CO3)

Stopplösningens höga pH denaturerar β-Gal och fördubblar ungefär den gula färgen i reaktionen.